牛皮蝇Hypodermin B 基因的克隆及原核表达载体构建

参照牛皮蝇Hypodermin B(HB)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以牛皮蝇总RNA为模板利用RT—PCR扩增牛皮蝇HB基因,并对扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,克隆的牛皮蝇HA基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为97．2％和99．3％。同时,将该基因与原核表达载体．PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。     

皮蝇Hypodermin A基因的克隆及表达质粒构建

参照牛皮蝇HypoderminA(HA)基因的核苷酸序列,设计一对引物,以皮蝇总RNA为模板进行RT--PCR扩增牛皮蝇HA基因,将扩增基因进行克隆测序。序列分析表明,所克隆获得的基因与GenBank中已经登录的核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.2%和99.3%。同时,将该基因与表达载体PGEX-4T-1连接,构建并获得阳性重组表达载体。     

皮蝇 Hypodermin C 基因的克隆及重组表达载体的构建

参照牛皮蝇 Hypodermin C(HC)基因的核苷酸序列，设计了1对引物，以牛皮蝇总RNA为模板，用RT-PCR扩增了牛皮蝇HC基因，将扩增基因进行克隆测序。测序结果表明，所获得基因与已知序列同源性达99．45％。同时，将该基因与表达载体pGEX-4T-1连接，构建并获得阳性重组表达载体。     

牛皮蝇HA基因克隆及分泌型真核表达载体的构建

为了构建牛皮蝇的皮蝇素A(hypodermin A,HA)基因的分泌型真核表达载体pEF1α-HAAcGFP,并在Cos7细胞中表达与鉴定,试验从牛皮蝇中提取RNA,反转录成cDNA,扩增出HA基因,并在HA基因序列的上游加1段信号肽序列;通过双酶切将带有信号肽的HA基因序列克隆到真核表达载体pEF1α-IRES-AcGFP中,得到分泌型真核表达载体pEF1α-HA-AcGFP;再利用脂质体法转染Cos7细胞,并以RT-PCR和Western-blot技术在RNA和蛋白水平上检测HA基因是否在Cos7细胞中表达。结果表明:经双酶切及测序鉴定,分泌型真核表达载体pEF1α-HA-AcGFP构建成功;转染Cos7细胞后,在RNA和蛋白水平上能检测到HA基因的表达。说明成功构建了HA基因的分泌型真核表达载体PEF1α-HA-AcGFP。     

禽流感病毒A／Turkey／Canada／63毒株HA和NA基因的克隆及序列分析

用SPF鸡胚增殖禽流感病毒（AIV）A／Turkey／Canada／63毒株，提取病毒基因组总RNA，应用RT-PCR技术分别扩增该病毒分离株的HA和NA基因全片段，并克隆到pMD18-T载体上。测序结果表明，该毒株的HA基因全长为1745bp，含有完整的阅读框架，编码566个氨基酸；NA基因全长1467bp，编码469个氨基酸。BLAST序列比较结果显示，该毒株HA基因属于H6亚型，NA基因属于N2亚型。将获得的HA和NA基因与AIV数据库中H6和N2基因进行遗传演化分析，表明该毒株HA基因与其他H6基因核苷酸的同源性为80．5％～87．3％，氨基酸的同源性为88．0％～93．1％；NA基因与其他N2基因核苷酸的同源性为86．0％～93．5％，氨基酸的同源性为90．6％～96．3％。     

猪2型圆环病毒ORF1基因的克隆及表达

根据GenBank中猪圆环病毒2型(PCV-2)的ORF1基因序列，设计合成了1对引物，对PCV-2广东株(GD)ORF1基因进行PCR扩增，将扩增的ORF1基因克隆入pMD18～T载体，获得的重组质粒命名为pMD-ORF1。将ORF1的Kpn Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切产物插入原核表达载体pBAD／gⅢ C得到重组子，命名为pBAD／gⅢ—ORF1。序列分析表明，克隆的ORF1与德国分离株AF201897核苷酸序列的同源性高达99．5％；与其他PCV-2株的核苷酸序列同源性为92．1％～99．9％，推导的氨基酸序列同源性为90．2％～99．5％。同时，测序结果表明，克隆的ORF1准确插入了pBAD／gⅢC的多克隆位点，未改变读码框。用L-阿拉伯糖诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE和Western—blotting分析，结果表明PCV-2ORF1在pBAD／gⅢC中获得了高效融合表达，其表达蛋白的分子质量约为41ku。     

鹅细小病毒NS1基因的克隆及原核表达

本研究根据GenBank发表的GPVB株全基因核苷酸序列，设计了1对用以扩增GPV主要非结构蛋白NS1基因的引物。通过PCR技术，扩增出NS1完整基因片段1．9kb。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析，结果表明：GPV H1株NS1基因全长1884bp，编码627个氨基酸，与国外已发表的B株核苷酸序列同源性为98．15％。同时将该目的基因正向插入到GST融合蛋白原核表达载体PGEX-6P-1的BamH1多克隆位点，构建了GPV NS1的原核表达载体，成功的表达了约97KD的NS1融合蛋白。     

水貂 β-干扰素基因的克隆、测序与遗传进化分析

根据Genβank发表的序列,应用DNAstart分析软件设计并合成一对引物用于扩增水貂β干扰素（IFN—β）基因,从病死水貂的脾脏中提取总RNA,RT—PCR扩增水貂β干扰素基因,获得了约561bp片段,将其克隆到pEasy—T1载体中,进行序列分析,证实该基因是水貂β干扰素基因。将测序结果与GenBank发表的雪貂（EF581890．1）的IFN—β基因序列进行比较,核苷酸序列同源性为100．0％,氨基酸同源性为100．0％。同时将核苷酸序列、氨基酸序列与其他几种犬科动物进行遗传进化分析,其同源性分别在83．0％～100．0％之间和69．4％～100．0％之间。     

牛皮蝇Hypodermin A基因在大肠杆菌中的表达

从牛皮蝇Ⅱ期幼虫中提取总RNA,进行RT-PCR扩增牛皮蝇Hypodermin A基因.将扩增基因进行克隆测序,构建原核表达栽体pET30-HA,转化大肠杆菌BL21(DE3).用IPTG诱导表达,得到表达量达到全菌蛋白35%以上的特异性蛋白.SDS-PAGE分析表明,表达产物大部分以包涵体形式存在.Western-blot检测结果表明,获得的重组蛋白为重组Hypodermin A,具有较好的免疫活性.     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需区的TK基因(约2.5kb),将其克隆入pUC19载体获得载体puDTK。根据已知载体pcDNA-LacZ的序列设计了一对引物,PCR扩增出pcDNA-LacZ上含CMV启动子、多克隆位点、SV40及LacZ的完整的基因表达盒插入puDTK的TK上,获得质粒puDTCL。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)基因序列,设计引物从T-HA质粒上扩增出HA基因,克隆到puDTCL的表达盒的多克隆位点NheI与ApaI之间,成功构建含LacZ及HA基因的转移载体质粒puDTCL-HA。将这载体质粒与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑克隆筛选和纯化,获得了遗传性状稳定的表达HA基因的重组鸭瘟病毒。     

鸡γ-干扰素基因的克隆及原核表达

参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT-PCR．技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中构建成重组表达载体pGEX-CHIFN-1，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。     

猪瘟流行毒株E2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

用RT-PCR方法扩增了陕西省近期猪瘟流行野毒株E2基因，并将其克隆到pMD18-T载体；经转化、筛选、鉴定后，测定了核苷酸序列，根据C株、Brescia株和Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行gp55氨基酸序列推导，并进行同源性比较。结果表明，该猪瘟流行毒株的E2核苷酸序列与C株、Brescia株和Alfort株的E2核苷酸序列同源性分别为81．9％、83．4％和83．5％；相应地，gp55氨基酸同源性分别为94．8％、95．6％和95．3％。将此E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb后获得了重组质粒pFBHT-E2，进而转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中，发生转座作用；经抗性及蓝白斑筛选得到了含E2基因的重组DNA，将其命名为rBacmid-E2。此研究为进一步在昆虫细胞中表达E2基因、开发研制猪瘟基因工程疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型武威株ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据GenBank中猪2型圆环病毒（PCV2）的核酸序列，设计了1对引物，采用PCR方法从疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的死亡仔猪组织病料中扩增出了ORF2基因，将其克隆到pMD18-T载体上，筛选获得了重组质粒pMD18-T-ORF2。对此重组质粒进行序列测定分析，结果表明，克隆的ORF2基因与其他PCV-2的ORF2核苷酸序列同源性为92．0％～93．3％，推导氨基酸序列的同源性为82．9％～84．6％。重组质粒pMD18-T-ORF2经Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切，将回收的ORF2基因转移入真核表达载体pIRES。成功构建了重组质粒pIRES-ORF2。     

表达猪流行性腹泻病毒COE基因的重组乳酸菌的构建与鉴定

用疑似患猪流行性腹泻病（PED）的病猪肠病料,根据猪流行性腹泻病毒（PEDV）S糖蛋白基因设计引物进行RT-PCR扩增,获得531bp的PEDV部分保护性抗原基因,将其克隆入pMD18-T载体后测序,核苷酸序列与PEDVCV777株相应序列的同源性为99．4％。根据测序结果和表达载体特点,设计一对引物,扩增PEDV部分保护性抗原基因（COE基因）501bp片段。将COE基因与乳酸乳球菌表面表达载体pNZ8149进行连接,电击转化入食品级乳酸乳球菌NZ3900细胞。重组菌以1ng／mL乳链菌肽（Nisin）诱导,通过SDS-PAGE和Westernblot分析,PEDV部分S蛋白成功表达,并具有反应原性。间接免疫荧光试验表明,重组菌表达蛋白定位于菌体细胞表面。     

禽流感病毒A/PFV/Restock/34(H7N1)HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/PFV／Restock／1／34（H7N1）1．7kbHA基因的cDNA，将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis，筛选到重组质粒命名为pBlueBacHisH7HA，测序正确后与线性化的杆状病毒DNA（Bac-N-Blue^TMDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经三轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rpBlueHisH7HA。提取重组病毒DNA，经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中，血凝实验、SDS-PAGE和Western blot实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得了表达。     

乌鬃鹅a干扰素基因的克隆及生物信息学分析

采用RT-PCR方法从乌鬃鹅肝脏中扩增a干扰素（Interferon,IFN-a）基因片段,将扩增片段克隆到pMD18-T载体上,经PCR和双酶切鉴定为阳性后进行序列测定,并用生物信息学软件Lasergene v7．1DNAStar和在线分析方法对IFN—a基因的核苷酸序列及其氨基酸序列进行了生物信息学分析,同时与GenBank中登录的鸡、鸭和鹅IFN．仅基因核苷酸序列进行同源性比较分析。结果表明,所扩增的IFN—a基因编码完整的开放阅读框,基因长度为576bp,与鸡、鸭与鹅IFN-a基因核苷酸序列同源性在72．0％～99．7％,遗传进化树显示鸡、鸭、鹅IFN-a因在遗传进化上各处一支。乌鬃鹅IFN-a基因的克隆及生物信息学分析为进一步研究鹅干扰素抗病毒的作用机理奠定基础。     

不同源性H5亚型禽流感病毒株HA基因序列分析

本研究对1株鹅源和一株鸽源的H5N1亚型禽流感病毒血凝素（HA）基因进行扩增、克隆和序列分析。结果表明，所扩增的片段长均为1707bp，包含完整的开放阅读框架，编码568个氨基酸；该毒株有7个潜在糖基化位点；在HA裂解位点附近有6个碱性氨基酸序列插入。两毒株间核苷酸与氨基酸的同源性均为96．7％。该毒株与参考毒株的序列比较分析结果表明：核苷酸同源率分别为95．3％～99％；氨基酸同源率分别为95．1％～99.3％。     

鸡CaBP-D28k基因克隆、序列测定及其真核表达质粒的构建

采集200日龄产蛋新扬州鸡小肠组织直接提取总RNA进行反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）扩增,扩增产物进行克隆、测序,获得了新扬州鸡CaBP—D28k基因序列。序列测定表明,CaBP—D28k基因核苷酸长度为789bp,编码262个氨基酸。与GenBank上发表序列（NM_205513．1）比较,核苷酸同源性为99．9%,在760bp处存在G→T的错义突变。与从GenBank下载的马、人、小家鼠、蟾蜍序列进行比较分析,核苷酸同源性分别为79．3％、79．1％、77．4％、77．3％。将该基因片段克隆到真核表达载体pCEP4,构建重组质粒pCEP4-CaBP—D28k,所获重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确,为利用pCEP4-CaBP—D28k调控蛋禽钙代谢、改善蛋壳质量的研究应用奠定了基础。     

边缘无浆体MSP5基因序列分析及其融合蛋白的纯化

参照已发表的主要表面蛋白5（MSP5）基因的核苷酸序列,设计了一对特异性引物,以边缘无浆体基因组DNA为模版。采用PCR技术扩增获得了MSP5基因;将其克隆到pGEM—TEasy载体,并进行测序分析,结果表明,克隆的MSP5基因与GenBank上登录的Florida株MSP5基因的序列同源性达98．6％,编码氨基酸的同源性为99％,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为633bp。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,构建了重组原核表达载体。将其转化到DH5a宿主茵中,用IPTG进行诱导表达,实现了融合表达。表达产物的分子质量为45ku。Western blot分析表明,此表达产物能够被抗边缘无浆体阳性血清所识别。通过裂解、洗涤、变性、复性等方法对包涵体蛋白进行处理,获得的纯化产物浓度为1mg／mL。     

表达H5N1亚型禽流感病毒HA和NA基因的重组鸭瘟病毒的构建

利用PCR技术扩增出鸭瘟病毒(DPV)生长非必需的TK基因(约1.1kb),将其克隆入pGEM-Teasy载体获得载体pGTK。根据已知的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C1的序列设计了一对引物,PCR扩增出pEGFP-C1上含CMV启动子、EGFP及其多克隆位点的完整的基因表达盒插入pGTK的TK上,获得质粒pGTK-EGFP。根据Genbank已发表的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因序列,设计了两对引物,分别从pT-HA和pT-NA两个质粒上扩增出HA和NA基因,克隆到pGTK-EGFP的表达盒的多克隆位点Kpn2I与SmaI之间,构建含EGFP及HA和NA基因的转移质粒载体pGTK-EGFP-HA-NA。将这质粒载体与DPV34F2疫苗毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),通过荧光方法筛选,获得了表达HA和NA基因的重组DPV(rDPV-HA-NA)。