piggyBac转座子介导的家蚕细胞转基因研究初探

为探讨稳定转化家蚕细胞表达外源基因的新方法,以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)极早期蛋白基因(ie-1)启动子元件驱动新霉素抗性基因(neor),并克隆至具有绿色荧光蛋白基因(gfp)标记的昆虫转座子载体piggyBac中,构建转基因载体pigA3-IE-Neo。以该载体转染家蚕BmN细胞,用终浓度800μg/mL的遗传霉素(geneticin,G418)筛选3个月,获得了稳定转化的细胞,呈现绿色荧光的细胞数达80%以上。通过PCR鉴定证实了细胞基因组DNA中neor基因和gfp基因的存在。     

哺乳动物转基因载体——piggyBac转座子

piggyBac转座子具有识别位点特异性5'-TTAA-3',剪切和插入都不留下印迹,且高效转座。基于piggyBac转座子的特性,借助载体系统,已应用于哺乳动物转基因的研究。此外,piggyBac转座子还应用于基因诱导突变和基因治疗等领域。RNAi技术作为基因功能研究的一个工具,在应用于克服畜牧业中家畜的生产繁殖障碍等方面已取得一定研究成果。本文对piggyBac转座子的结构和特性、转座机制及影响因素和在动物中应用等方面进行总结,为RNAi技术借助piggyBac转座子用于哺乳动物转基因提供理论依据。     

piggyBac转座子在哺乳动物中的应用

转座子(transposon)是存在于生物体基因组中的可移动的DNA片段,能够影响基因的结构和功能,广泛存在于生物演化过程中。转座子通过切离和粘贴机制介导外源基因的插入,是研究基因功能,制备转基因动物及基因治疗的优良载体。目前在哺乳动物中转座活性较高且研究最多的是"睡美人"转座子和piggyBac(PB)转座子。前者是目前临床前基因治疗研究中使用最为广泛的转座子,但存在剂量抑制效应和转座效率低等缺陷。而PB转座子可克服剂量抑制效应,且转座高效,转基因载量大,因此在哺乳动物中的应用越来越广泛。作者就PB转座子的作用机制、影响因素及在哺乳动物中的应用现状等进行报道。     

家蚕转基因研究及肌动蛋白A3启动子的表达分析

通过显微注射法,将转基因载体pBcA3EG及辅助质粒pA3H导入产后1h的蚕卵,在G1代获得家蚕转基因的阳性个体.通过对G2代转基因蚕基因组的Southern杂交分析表明,获得的该转基因品系为EGFP基因的单拷贝插入.同时对G2代个体不同发育时期及不同组织进行荧光观察,发现EGFP在转基因家蚕幼虫期的表达较其它时期强,而幼虫时期强烈的EGFP主要由中肠组织的杯形细胞高量表达所致.这些结果初步表明A3启动子在家蚕的不同发育时期及不同组织存在表达的活性差异.     

piggyBac转座子应用研究进展

piggyBac转座子是来源于鳞翅目昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的DNA型转座子。目前piggyBac转座子已成为在昆虫中应用最广泛的转座子之一。近年来国内外研究者更将其应用领域拓宽到了鱼类,寄生虫和哺乳动物等转基因研究中。随着对piggyBac转座子功能和分布的深入认识,piggyBac转座子将更多应用于基因功能研究,基因治疗,转座子介导的细胞系基因诱变及基因工程蛋白表达等基础研究和应用研究中。     

基于piggyBac转座子转hGM-CSF基因家蚕的研究

将由家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制下的hGM-CSF基因克隆到p igA3GFP载体中,构建了家蚕转基因载体p igA3GFP[IE-GMCSF],利用压力渗透法和精子介导法将其与辅助质粒helper p igA3一起导入家蚕蚕卵,获得产生绿色荧光的家蚕,次代产生荧光蚕的比例分别为0.17%,0.15%。将次代荧光蚕与正常蚕交配后代(G1)的荧光蚕个体再相互杂交,连续进行多代选育,获得了稳定遗传的转hGM-CSF基因家蚕品系。     

外源piggyBac转座元件在转基因家蚕中的整合位点分析

以piggyBac转座子为介导的显微注射家蚕早期胚胎的技术,是目前获得转基因蚕的有效和主要方法。基于piggyBac以随机方式发生高频切出和转座的特点,已将其开发成各种遗传分析工具,用于果蝇、小鼠和家蚕等模式生物的基因功能研究。本文旨在分析外源piggyBac转座元件在转基因家蚕中的基因组整合位点特征,以期为更好的利用其开展家蚕转基因研究提供参考。采用反向PCR和生物信息学等方法,获得并分析了转基因家蚕中67个外源piggyBac的整合位点,结果显示:有28个整合位点位于基因间区,22个位于基因内部,但不在外显子区域;在整合位点两侧各10Kb区域范围内,注释基因多为转座酶或反转录酶等,推测其可能为piggyBac插入整合的热点区域(hotspotregions);此外,有47个整合位点可定位至家蚕的18条染色体上。     

piggyBac转座子在畜牧兽医科学中应用研究进展

piggyBac（PB）转座子已被证明是一种高效的非病毒基因工程操作工具,现广泛用于基因操作和转基因动物研究中。借助PB转座子已获得转基因小鼠、鸡、猪、山羊等动物。文中重点就PB转座子在畜牧兽医科学研究中的应用进行综述。     

团头鲂β-actin启动子在家蚕中活性分析

利用双式荧光报告基因检测团头鲂β-actin启动子在家蚕BmN细胞和在家蚕体内的活性。通过脂质体介导法将转基因载体pigA3GFPAβdsRed和辅助质粒(1∶3)混合均匀后转染BmN细胞,48h后,可以检测到同时发绿色荧光和红色荧光的家蚕细胞,表明来自团头鲂的β-actin启动子在家蚕BmN细胞具有活性,能驱动DsRed基因在家蚕BmN细胞中表达。以gfp、dsred的特异引物,可从pigA3GFPAβdsRed转化家蚕BmN细胞基因组内扩增出gfp、dsred相应大小的片段,提示外源基因已经插入到细胞基因组中。随着转化细胞的传代,绿色荧光稳定存在,而红色荧光会逐渐减弱直至检测不到,暗示β-actin启动子在家蚕细胞中容易受到家蚕BmN细胞因子的影响而活性减弱。将转基因载体pigA3GFPAβdsRed和辅助质粒(1∶3)利用精子介导法导入家蚕受精卵,7天后,在部分受精卵中可观察到绿色荧光和红色荧光,进一步证明了β-actin启动子在家蚕体内具有活性。结果显示,含双式荧光报告基因的转基因载体为鉴定β-actin启动子等外源启动子在家蚕中的活性提供了快捷准确的鉴定方法。     

家蚕转基因研究进展

近年来,显微注射和生殖系转化已成为家蚕转基因研究的主流技术与方法.本文简要介绍了近几年来家蚕转基因转座子和启动子选择上的发展以及家蚕转基因在研究家蚕基因功能、生产目的蛋白、改善蚕丝质量与增强家蚕抗病性方面的应用.表明家蚕转基因技术的巨大发展潜力和很高的利用价值.     

利用转基因RNA干涉提高家蚕对BmNPV的抗性初探

基于探讨利用转基因RNA干涉技术使家蚕获得对核型多角体病毒抗性的目的,将家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的DNA聚合酶基因、蛋白激酶(PK1)基因以及bro-d和orf1629基因的部分编码片段,分别以其反向重复的形式与家蚕Actin3启动子连接,构建了基于piggyBac转座子载体的转基因表达载体,通过显微注射于家蚕卵,获得了36~107个G1蛾区,得到了20~23头转基因阳性家蚕。经Southern杂交及RT-PCR分析表明,BmNPV的4个反向重复片段都已经导入家蚕基因组中,并且可以进行转录。攻毒实验结果表明,BmNPV的DNA聚合酶基因和PK1基因反向重复片段对病毒的增殖有抑制作用,从而使家蚕对BmNPV具有一定抗性;而BmNPV的bro-d和orf1629基因反向重复片段对病毒的增殖没有抑制作用。针对特定病毒的转基因RNAi技术有望使家蚕获得对该病毒的抗性。     

转基因家蚕实验用材料蚕的冷藏期限

为了适应转基因家蚕研究对实验用蚕卵的随时需求,探讨了蚕蛹、蚕蛾耐冷藏期限问题.研究结果发现,蚕蛾羽化后用4℃温度冷藏4 d以内,仍然有能交配和产卵的蚕蛾,获得生长发育正常的蚕卵;蚕蛹冷藏期限在12 d之内,对蚕蛾的交配能力及雌蛾产卵能力影响不大;冷藏期限13～20d,蚕蛾交配能力和雌蛾产卵能力逐渐下降,但如果有足够数量的蚕蛹,仍然能够获得能交配和产卵的蚕蛾,获得生长发育正常的蚕卵.     

表达短ie-1 dsRNA的转化细胞对家蚕核型多角体病毒的抑制作用

为了利用RNAi技术提高家蚕对核型多角体病毒(BmNPV)的抗性,根据BmNPV复制必需基因ie-1设计其相应的dsRNA,构建带有ie-1 dsRNA表达盒的转基因载体piggyantiIE-Neo,结果显示:表达短ie-1 dsRNA的稳定转化Bm细胞,对BmNPV的增殖表现出抑制作用,但在病毒感染后期,由于病毒恢复增殖导致RNAi的效果被掩盖。通过反向PCR分析外源DNA片段插入基因组位点,结果显示:在转化细胞中,外源DNA可通过随机整合或按照piggyBac特定的转座位点TTAA插入细胞基因组。     

家蚕转座子表达载体pSVHK1.4的构建

研究利用PCR方法扩增黑腹果蝇 (D .melanogaster)hsp70启动子 ,然后插入到质粒pcDNA3上水母绿色荧光蛋白基因gfp的上游 ,与之顺向拼接构建成含hsp70和gfp的重组质粒pCGH。将家蚕K1 4转座子序列从pUK1 .4亚克隆到真核表达载体pSVL中PvuⅡ位点 ,获得中间载体pSK1 .4。最后将hsp70启动子和gfp报告基因的融合片段从pCGH中亚克隆到质粒pSK1 .4中K1 .4片段上的BglⅡ位点处 ,从而完成对转座子表达载体pSVHK1 .4的构建。     

利用细菌转座子构建适于家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统

为了较好地解决家蚕杆状病毒基因表达系统(BmNPV expression system)在重组病毒构建和纯化过程中存在的重组率低、空斑分析技术繁琐、花费时间长等缺点,借鉴国外AcNPV Bac-to-Bac快速基因表达系统工作原理,对家蚕BmNPV基因组进行了改造。通过同源重组的方法,将含有单拷贝数细菌F复制子、插入有细菌转座子整合靶位点、编码LacZα肽的部分DNA片段和抗性选择标记基因的基因片段重组入家蚕BmNPV基因组,替换多角体蛋白基因,获得了家蚕BmNPV病毒穿梭载体BmBacm id;并利用供体质粒上的表达盒和细菌转座子以及细菌转座子的基因定位转移作用,在细菌体内实现外源目的基因向家蚕BmNPV基因组上的转移整合,快速完成重组BmN-PV病毒的构建。     

BmLSP基因启动子驱动DsRed在转基因家蚕中的表达分析

家蚕幼虫血清蛋白(BmLSP)是由脂肪体细胞合成的一种贮藏蛋白,是研究家蚕幼虫期发育调控的理想靶标。基于家蚕基因组数据,克隆了BmLSP基因5'端侧翼区～1.6 kb的调控序列,构建成以红色荧光蛋白基因DsRed为报告基因的pig-gyBac表达载体并进行转基因注射,在个体水平上验证该启动子的特性。结果表明:BmLSP-DsRed表达框以单拷贝形式整合至家蚕基因组;DsRed在转基因家蚕脂肪体中特异转录表达,其时期表达特征与BmLSP基因基本一致,随发育阶段的不同呈现有规律的变化,即幼虫期表达,但1龄、2龄眠期不表达,3龄、4龄眠期有微弱表达,上蔟后表达量逐渐降低直至化蛾阶段消失。提示BmLSP可能通过其启动子区的特异元件受激素的精确调控而行使功能。     

适用于实用家蚕品种转基因的蚕卵滞育解除方法

实用家蚕品种转基因是利用分子靶标实现家蚕品种改良与创新的最直接和有效手段,建立高效的适合于转基因显微注射的蚕卵滞育解除方法则是目前家蚕转基因在技术层面尚待解决的关键问题之一。采用早期浸酸、低温催青、复式催青3种方法解除显微注射转基因蚕卵的滞育。结果表明,3种人工处理方法均能解除蚕卵滞育,且获得的非滞育性蚕卵可通过显微注射得到转基因阳性个体,其中采用复式催青法处理的子代蚕卵滞育解除率最高,转基因阳性蛾圈率约25.00%,明显优于低温催青和早期浸酸处理。此外,采用早期浸酸处理,日系品种的蚕卵滞育解除率高于中系品种;采用低温催青和复式催青处理,中系品种子代蚕卵滞育解除率则显著高于日系品种。     

家蚕壳聚糖的研究进展

家蚕壳聚糖作为一种生物活性物质,有着相当广泛的用途.本文从壳聚糖的性质、制备方法着手,着重讨论了壳聚糖在蚕桑生产、医药、食品、农业、环保等领域中的应用与研究进展.     

人工诱导家蚕ZZWW型三倍体的细胞遗传学分析

试验以探讨ZZWW型四倍体雌蚕在减数分裂中性染色体行为为目的 ,用玉泽的过冷却处理方法诱发的四倍体雌蚕 (ZZWW )与带有伴性赤蚁基因的二倍体雄蚕 (ZschZsch)交配 ,发现有ZZWW型三倍体发生。根据ZZWW型三倍体发生 ,分析四倍体雌蚕减数分裂中形成配子的种类和比例、遗传学行为及ZZWW型三倍体蚕的形成机制