基于广泛靶向代谢组学结合高效液相色谱法分析‘紫娟’和‘迎霜’茶树花代谢物差异

为探究茶树品种‘紫娟’和‘迎霜’茶树花之间的风味差异,基于超高效液相色谱-串联质谱法的广泛靶向代谢组学技术,检测2个品种茶树花轻发酵样品中非挥发性代谢物的丰度,并对其进行筛选和鉴定;参照茶叶感官审评方法评价2个样品茶树花各项审评因子,采用高效液相色谱法和比色法检测儿茶素类、黄酮类等滋味成分含量。结果表明：‘紫娟’茶树花滋味甘和较鲜、略苦微涩,‘迎霜’茶树花滋味甘和、微苦略涩。2个品种间有酚酸类（56种）、黄酮类（46种）、脂质（26种）、鞣质（19种）、氨基酸及其衍生物（17种）等219种显著差异代谢物。进一步对其代谢通路进行注释分析发现,氨基酸类物质相关代谢途径以及黄酮和黄酮醇代谢途径是‘紫娟’和‘迎霜’茶树花之间的主要差异代谢途径。此外,‘紫娟’和‘迎霜’茶树花中黄酮类总量、花青素总量、儿茶素类和部分生物碱含量差异显著（P<0.05）,可溶性糖含量差异不显著。上述结果初步说明了黄酮类化合物使茶树花的滋味具有一定苦涩度,相较于‘迎霜’‘,紫娟’茶树花中部分氨基酸及其衍生物含量上调是其茶汤滋味较鲜的主要原因。     

植物生长调节剂对‘紫娟’茶树叶片花青素 及主要生化成分的影响

为了探究植物生长调节剂对‘紫娟’茶树叶片的花青素含量、主要生化成分含量及对茶叶品质的影响,对‘紫娟’茶树叶片分别喷施不同植物生长调节剂（ABA、SA、乙烯利和MeJA）进行诱导处理。采用紫外分光光度计法测量‘紫娟’茶树叶片的花青素含量;根据国标的方法测量‘紫娟’茶树叶片茶多酚、氨基酸和咖啡碱的含量,并对茶树的一芽两叶分制成的干茶进行感官审评。50 μmol·L^-1ABA、300 mg·L^-1 SA、100 mg·L^-1乙烯利和150 mg·L^-1MeJA均显著诱导‘紫娟’茶树叶片花青素及主要生化成分含量的提高,但SA和ABA诱导分别导致了氨基酸和咖啡碱含量的降低。此外,喷施ABA、SA或MeJA后的‘紫娟’茶样感官审评打分均高于对照。在生产中通过喷施适宜浓度的ABA、SA或MeJA不仅可以增加‘紫娟’茶树叶片的花青素及主要生化成分含量,而且还可以提高茶叶的感官品质。结果为调控‘紫娟’茶树叶片花青素及主要生化成分的累积奠定了基础,并为改善茶叶品质提供了新的途径。     

‘鸭梨’钙调素基因的克隆与表达分析

以‘鸭梨’为材料,用RT-PCR及RACE技术克隆CaM,并借助实时定量PCR技术分析‘鸭梨’花、叶及果实不同发育时期的表达模式,获得了2个长度为764和801bp的CaM cDNA序列,分别命名为PbCaM1和PbCaM2,二者均含有450bp完整开放阅读框,编码149个氨基酸,且氨基酸序列相同。‘鸭梨’CaM在系统进化上具有高度保守性,与苹果相比,两者氨基酸序列为100%一致性。PbCaM1和PbCaM2具有时空表达特异性,它们在成叶、盛花期花瓣和幼果期表达量较高。本研究表明CaM具有高度保守性,PbCaM1和PbCaM2在‘鸭梨’果实早期生长发育过程中起着非常重要的作用。     

上饶早梨‘六月雪’和‘黄皮消’全基因组重测序分析

以上饶早梨Pyrus pyrifolia 2个品种‘六月雪’‘Liuyuexue’和‘黄皮消’‘Huangpixiao’试管苗为材料,进行全基因组重测序分析。结果表明:2个样本的总单核苷酸多态位点（SNP）数量分别为6 171 357和6 140 603个,编码区内无义突变位点（nsSNP）分别为335 659和332 280个。对nsSNP的常见变异（common variant,CV）分析发现,共有2 282个nsSNP关联了2 067个基因。2个样本的总插入缺失位点（INDEL）分别为800 388和799 603个,其中15 509和15 274个位于编码区,共5 115个差异INDEL关联到了3 682个基因,烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus）耐药蛋白N,抗病蛋白等关键基因发生变异。差异nsSNP和差异INDEL富集得到的基因本体术语（GO terms）一致。本实验结果可为上饶早梨2个品种‘六月雪’和‘黄皮消’SNP和INDEL相关标记的开发、优异基因的挖掘提供参考。     

茶树花蕾14-3-3蛋白基因的分子克隆及差异表达分析

【目的】从分子水平研究茶树花蕾发育阶段的相关基因表达,了解茶树花蕾的发育机理,利用分子生物学技术抑制茶树的生殖生长、促进营养生长。【方法】利用cDNA-AFLP技术对茶树花蕾发育早期和晚期的差异表达进行分析。采用RACE技术克隆到花蕾发育晚期阶段特异表达的、在花蕾发育中可能起重要作用的14-3-3基因,通过RT-PCR和Western-blot方法研究该基因转录水平和蛋白质表达水平的特点。【结果】在测定的大约1 110个茶树花蕾cDNA片段中,122个（10.9%）是差异性表达的,其中87个在发育晚期特异表达,包括茶树14-3-3蛋白基因（GenBank登录号：DQ444463）,其全长为1 072 bp,包含1个由783个核苷酸组成的ORF,编码260个氨基酸,5′非翻译区和3′非翻译区分别有67和222个核苷酸,该基因与其它植物的14-3-3蛋白基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面均有着比较高的相似性。RT-PCR和Western-blot分析表明该基因在茶树的晚期发育花蕾中特异表达。【结论】14-3-3蛋白仅存在于茶树发育晚期的花蕾中。cDNA-AFLP技术能用于茶树花蕾不同发育时期的基因分离研究。     

三种酶对采后‘海沃德’和‘华特’猕猴桃AsA的氧化作用

【目的】探究‘海沃德’‘华特’猕猴桃果实采后影响抗坏血酸(ascorbic acid,AsA)氧化的相关酶活性及基因表达差异,为猕猴桃采后AsA氧化机制的系统研究,调控果实成熟和衰老进程,并有效保持果实采后品质和延长贮藏时间等研究提供理论依据。【方法】以‘海沃德’‘华特’猕猴桃作为试验材料,测定两个品种的果实在采后25℃贮藏条件下AsA、总抗坏血酸(total ascorbic acid,T-AsA)、脱氢抗坏血酸(dehydroascorbic acid,DHA)、AsA/DHA、与AsA氧化相关的抗坏血酸氧化酶(ascorbic acd oxidase,AO)、漆酶(Laccase)、抗坏血酸过氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)的活性及相关酶基因的表达,研究两个品种猕猴桃果实AsA含量变化与AO、漆酶、APX活性及相关酶基因的相关性。【结果】‘海沃德’猕猴桃采后初期AsA含量为86.9 mg/100g FW,到贮藏末期损失约45%,而‘华特’猕猴桃在采后初期AsA含量较高,为610 mg/100 g FW,中期上升至峰值886 mg/100 g FW,末期...     

外植体取样时间对‘玉妃’和‘超红’桃初代培养的影响

从2012年7月到2013年10月,以‘玉妃’和‘超红’桃当年生枝上带腋芽的茎段为外植体,研究了不同取样时间对初代培养的影响。结果表明,5月份取样‘玉妃’和‘超红’桃的污染率最低,分别为16%和10%;成活率最高,分别为84%和60%以上。5月份是最佳取样时间。     

‘安康紫仁核桃’病虫害调查及防治

为了有效防治核桃病虫害的为害,提高农户种植核桃的效益和积极性,本文针对以地方优良品种‘安康紫仁核桃’为主要栽植品种的核桃示范园区和基地进行定点不定期的调查,调查结果表明：‘安康紫仁核桃’生产中的虫害共有9种,病害6种。同时对该示范园发生最为严重的“三虫一病”问题进行阐述分析并提出相关防治措施,旨在明确‘安康紫仁核桃’发生的病虫害情况、为该品种在本区域快速大面积的推广和发展提供技术支撑和参考,同时也为核桃产业在安康健康可持续发展提供有益指导。     

茶树花不同发育时期的转录组分析

为了揭示茶树花不同发育时期生长发育和生化成分代谢的分子机制,以‘黄棪’茶树品种为研究对象,通过高通量测序技术对茶树花两个发育时期(花苞期、开放期)的转录组进行比较分析.结果显示:转录组测序共获得135 039 271个过滤序列,GC含量为44.30%～45.35%;茶树花两个发育时期共获得18 352个差异表达基因,其中,上调的基因有8 019个,下调的基因有10 333个.对差异表达基因进行基因本体论(GO)及京都基因和基因组百科全书(KEGG)分析,发现其主要富集在与茶树花生长发育、生化成分形成有关的植物激素信号转导、光合作用—天线蛋白、植物的昼夜节律、糖胺聚糖降解等代谢途径上.本研究结果表明,茶树花的发育受到植物激素的调控和光周期的诱导,与氨基酸、可溶性总糖有关的代谢途径随着花的发育发生了变化,该结果为进一步研究茶树花发育过程中的动态变化提供了参考.     

茶树类黄酮3’,5’-羟化酶在大肠杆菌的表达和优化

儿茶素是茶叶主要特征和功能成分之一,其中B环三羟基儿茶素约占儿茶素总量的65%以上。类黄酮3’,5’-羟化酶是类黄酮合成中B环5’羟基化的唯一酶系,与B环三羟基儿茶素合成积累密切相关。采用RACE技术,克隆了茶树类黄酮3’,5’-羟化酶基因的1 944 bp的全长序列,开放阅读框区域为55～1 587 bp,编码510个氨基酸,推测其分子量为57.1 kDa,等电点为9.06。该基因重组至pET-32a(+)表达载体上,在大肠杆菌Rosetta中进行原核表达;优化了原核表达中温度诱导条件;利用钴离子吸附柱纯化了目的蛋白。该研究为开展F3’5’H酶的反应动力学、酶的器官组织定位等研究奠定了基础。     

水稻草状矮化病毒侵染寄主水稻差异表达蛋白的鉴定和分析

【目的】对水稻草状矮化病毒（Rice grassy stunt virus,RGSV）侵染寄主水稻后其叶片的差异表达蛋白进行筛选、鉴定和生物信息学分析,为进一步研究RGSV和寄主水稻互作的分子机制提供线索。【方法】采用双向荧光差异凝胶电泳（Two-dimensional fluorescence difference in gel electrophoresis,2D-DIGE）和Image Master 2D platinum 7.0分析软件寻找差异表达蛋白,MALDI-TOF-MS（Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight tandem mass spectrometry）鉴定差异蛋白,利用BioTools软件搜索NCBI数据库,寻找匹配的相关蛋白质和功能查询。采用GOminer软件对差异蛋白进行GO（Gene ontology）聚类分析,KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库分析差异蛋白所参与的生物通路。【结果】建立了RGSV侵染与未侵染水稻的叶片双向荧光差异凝胶电泳图谱,RGSV病株与健株相比,差异倍数大于1.5的差异蛋白质点有173个,其中表达丰度升高的点有72个,表达丰度下降的点有101个,质谱鉴定了44个差异蛋白质点,25个获得成功鉴定,分属于24种蛋白质,包括RGSV的2种蛋白20.6K非结构蛋白和P5蛋白,水稻中的蛋白推定的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基、景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶前体、推定的酪氨酸磷酸酶、HAD超家族水解酶-亚族IA蛋白变体3蛋白、水稻核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基结合2-羧基阿拉伯糖醇-1,5-二磷酸复合体、类似C1结构域蛋白以及其他一些功能未知蛋白和假定蛋白。对已鉴定蛋白的生物信息分析显示,差异蛋白涉及氮素固定、氮循环代谢过程、含氮化合物代谢过程、单一生物体代谢过程、代谢过程和生物过程等6个生物学过程,在生物功能上分属7类,包括分子功能、酸胺连接酶活性、酰胺连接酶活性、催化活性、谷氨酸氨连接酶、连接酶活性和形成C-N键的连接酶活性,在细胞组件上,差异蛋白分布于不同的细胞位置,涉及细胞组分、细胞器、细胞、膜结合细胞器、囊（泡）、细胞部分、膜结合囊（泡）、胞内、胞内部分、胞内细胞器、细胞质、胞内膜结合细胞器、细胞质部分、质体、细胞质囊（泡）和细胞质膜结合囊（泡）。KEGG通路分析显示,差异蛋白参与了代谢途径、光合生物固碳反应、碳代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢、氨基酸生物合成、丙酮酸盐代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢和氮代谢途径等10个KEGG代谢通路。【结论】RGSV侵染诱导了水稻差异蛋白质表达,获得了一些与RGSV侵染水稻相关的蛋白质分子,差异蛋白涉及到多个功能类别。其中与氮有关的生物学过程和光合作用过程变化较为明显。     

利用iTRAQ蛋白质组技术筛选与鸡喙畸形相关的候选蛋白

【目的】中国地方鸡种如北京油鸡、清远麻鸡存在喙畸形现象,表现为上下喙咬合不全,呈交叉状。严重影响鸡饮水和采食,从而影响个体发育和生产性能的发挥,造成一定经济损失。笔者根据喙畸形个体的系谱记录,发现喙畸形的形成受到遗传因素的影响,但具体机制尚不明确。蛋白是行使各种生物学功能的最终形式之一,喙畸形个体的发生可能是由于核心蛋白或者相关调控蛋白代谢异常造成的。利用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ）技术以及生物信息学分析方法,筛选鸡畸形喙与正常喙中差异表达的蛋白,作为喙畸形相关的重要候选蛋白,为进一步研究北京油鸡喙畸形的遗传机制奠定基础。【方法】挑选3只120日龄喙畸形的公鸡作为试验组,编号为W1、W2、W3,同时,挑选与试验组个体为同胞关系（全同胞或半同胞）的喙正常公鸡作为对照组,编号为Z1、Z2、Z3。将喙畸形与其同胞正常个体作为一个比对组,iTRAQ试验具体包含3个比对组,即W1 vs Z1,W2 vs Z2,W3 vs Z3。屠宰个体后,剔除喙组织周围肌肉和筋膜,分离得到喙上颌骨和下颌骨,提取总蛋白样品,应用6个 iTRAQ标签标记各蛋白样品,经过色谱层析预分离,联合液相串联质谱分析,采用Mascot 2.3.02软件对蛋白进行鉴定和定量分析。试验组（W）与其同胞对照组(Z)样本比较（W1 vs Z1,W2 vs Z2,W3 vs Z3）,选择肽段数≥2,表达差异值＞1.2（上调）或＜0.83（下调）,且P＜0.05的蛋白作为差异表达蛋白。【结果】利用iTRAQ技术一共在喙组织中鉴定到3 372个蛋白,鉴定到的特异性肽段有12 769个。其中原鸡蛋白1 869个,分子质量主要分布在10-100 kD之间。3个比对组共鉴定出159个表达量有显著差异的蛋白质,其中包含70个表达上调的蛋白,89个表达下调的蛋白。统计各比对组蛋白表达差异值发现,表达量差异较大的上调蛋白质有LPL、MLC-2、CO9A1、MATN3、HSP90B1等,表达量差异较大的下调蛋白质有MBP、RLA1、PRVM、HAPLN1等。结合已经报道的这些蛋白的生物学功能,其中CO9A1、MATN3、HAPLN1与软骨合成和软骨骨化相关,CO9A1是带状软骨纤维的组成物质,MATN家族是非胶原性细胞外基质蛋白家族,HAPLN1是软骨细胞外基质的重要组成成分;PRVM是细胞内钙离子结合蛋白,参与调控Ca2+离子信号通路;LPL是多功能酶,主要在脂质代谢和转运过程中起作用,参与调控PPAR信号通路。初步筛选出CO9A1、MATN3、HAPLN1、PRVM、LPL作为与鸡喙畸形相关的候选蛋白。【结论】差异表达蛋白的发现为鸡喙畸形形态的发生提供蛋白质水平上的理论依据。     

苹果叶片不定芽再生过程的差异表达基因鉴定与分析

[目的]筛选分析'GL-3'苹果叶片不定芽再生过程中的差异表达基因(differentially expressed gene,DEG),进一步解析苹果叶片不定芽再生的潜在分子机制,为提高苹果的遗传转化效率提供理论参考.[方法]'GL-3'苹果继代组培苗叶片外植体接种在再生培养基上,分别于0、3、7、14和21 d后取...     

玉米杂交种与亲本苗期叶片差异表达蛋白谱分析

【目的】建立玉米杂交种与亲本苗期叶片差异表达蛋白谱,探讨叶片大小杂种优势形成的分子机理。【方法】以玉米强优势杂交种Mo17/B73及其亲本发芽后第5天的第3片叶为材料,采用双向电泳技术（2-DE）,结合MALDI TOF MS质谱技术,建立叶片细胞分裂和生长关键区域的差异表达蛋白质谱,并对差异表达蛋白进行质谱鉴定。【结果】在检测到的630个蛋白质点中,有52个蛋白质点在杂交种与亲本之间的表达差异达到显著水平,表现为单亲沉默（15个）、偏高亲（13个）、偏低亲（8个）、杂种上调（6个）、杂种下调（7个）和杂种特异表达模式（3个）。另外,还成功鉴定出了其中的28个差异表达蛋白质点,涉及到代谢、胁迫响应、糖酵解、转录调控、蛋白折叠和降解、三羧酸循环、细胞骨架、发育及未知蛋白质等9个功能类别。【结论】玉米杂交种与亲本在蛋白丰度上存在明显的差异,并且差异表达蛋白涉及到多个功能类别,可能与玉米叶片大小杂种优势的形成有关。     

Separation and Identification of Differentially Expressed Proteins in Pistillate Flowers between Different Mulberry Cultivars

[Objective] This study aimed to explore the proteins related to pistillate flower development in different mulberry cultivars. [Method] The total proteins of the pistillate flowers of two mulberry cultivars Dal0 （Morus atropurpurea Roxb.） and SG01 （Morus muIticaulis Perr.） were extracted, separated and detected through two- dimensional electrophoresis （2-DE） and mass spectrometry. [Result] There was sig- nificant difference in the expression of proteins from the pistillate flowers of different mulberry cultivars. From the 2-DE images of Dal0 and SG01, 445_＋17 and 425_＋12 protein spots were respectively detected. The expression levels of 75 protein spots differed significantly. Thirteen spots those were expressed at high levels and well separated were analyzed by mass spectrometry, and nine of them were identified successfully. The nine proteins are involved in the glycometabolism, protein and amino acid metabolism and defense responses during the development of mulberry pistillate flower after they were pollinated. [Conclusion] The findings will provide reference for further study on the molecular mechanism of mulberry pistillate flower de- velopment.     

灰树花菌丝体与原基转录组差异表达分析

为了解灰树花原基形成及子实体分化机制,采用Illumina测序技术对灰树花菌丝体和原基进行了全转录组测序和数据分析,对菌丝体和原基中的差异表达基因进行了研究。结果表明,在菌丝体和原基中分别得到35788532个和32755254个高质量测序标签。差异表达基因分析表明,两个文库中共有显著性差异表达的基因4094个,其中在原基中上调、下调的基因数分别为1886和2208个,只在原基中表达的基因284个。经Blastnr比对,在菌丝体与原基阶段差异表达的基因主要与酸性蛋白酶类、凝集素、细胞色素、NADPH-P450还原酶、酯酶、胺氧化酶、克拉维胺合成酶、糖苷水解酶家族相关。在原基中特异表达的基因主要与糖代谢、脂类代谢、核酸代谢及细胞膜、叶绿体膜有关。GO功能富集分析结果表明,线粒体膜相关基因、谷氨酰胺代谢、脂肪酸生物合成相关基因均上调表达;Pathway功能富集分析结果表明,合成核糖体蛋白的基因均上调表达,表明原基形成时细胞代谢增强,蛋白质合成量增加。     

黄鳝性腺差异表达基因的筛选和克隆

运用ACP—DDRT—PCR技术筛选和克隆了黄鳝不同发育时期性腺组织的差异表达基因。结果显示：利用2个随机ACP引物筛选到2个表达差异显著的基因,并对这2条差异表达片段进行克隆、测序分析,获得这2个基因的部分cDNA序列,长度分别为408bp和421hp。同源性分析结果显示其中一个基因与黄鲈卵巢cDNA文库中的一个基因（Gene BankNo．G0657149．1）高度同源;而另一个基因无同源性序列,视为新报道的基因。进一步半定量RT—PCR检测,结果显示：这两个基因在黄鳝卵巢和间期性腺中的表达差异显著,因此推测其在黄鳝性腺发育以及性逆转过程中起着重要作用。     

广东晒烟大叶密合受青枯病菌侵染后差异表达蛋白分析

[目的]大叶密合是广东封开县地方名优晒烟品种,是当前发现烟草青枯病的优良抗源,深入研究其烟草青枯病抗性机理,寻找其青枯病抗性相关的差异表达蛋白,可为抗青枯病分子机理的深入研究和抗病育种提供参考.[方法]将烟草品种大叶密合、抗病对照品种D101、感病对照品种长脖黄进行青枯病菌室内接种鉴定,并利用蛋白质组学(iTRAQ)和...     

Identification of Differentially Expressed Genes in Sweetpotato Storage Roots Between Kokei No. 14 and Its Mutant Nongdafu 14 Using PCR-Based cDNA Subtraction

The contents of carotenoids in the storage root of sweetpotato, Ipomoea batatas (L.) Lam. vary dramatically among different cultivars. However, so far little is known about the regulation of carotenoids synthesis in sweetpotato. In our laboratory, we identified a novel sweetpotato mutant, Nongdafu 14, which is a homogenous mutant derived from the wild type Kokei No. 14. The contents of carotenoids in the storage root of Nongdafu 14 were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC), and it was found that the amount of carotenoids, b-carotene, lutein and zeaxantion, three major types of carotenoids in sweetpotato storage roots, increased 2–26 folds in Nongdafu 14 compared to Kokei No. 14. Suppression subtractive hybridization (SSH) was used to identify genes that were differentially expressed in Nongdafu 14, and a differentially expressed cDNA library was constructed using the cDNA of Nongdafu 14 storage roots as tester and that of Kokei No. 14 storage roots as driver. Out of the 1 530 clones sequenced, we identified 292 nonredundant ESTs. GO and KEGG analyses of these differentially expressed ESTs indicated that diverse metabolism pathways were affected and candidate genes involved in regulation of carotenoids synthesis are suggested.