绵羊肺炎支原体膜蛋白p74基因的克隆、分子特征及反应原性研究

【方法】利用PCR方法对绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,MO)新疆分离株MO-XJ p74基因进行扩增、克隆及测序,分析其分子特征。将P74蛋白抗原集中区编码序列亚克隆至表达载体p ET-32a(+),构建重组表达载体p ET-32a(+)-p74C,转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达。【结果】MO-XJ p74基因全长2016 bp,编码671个氨基酸;对编码的氨基酸序列分析发现,该蛋白不含信号肽序列,9~31位氨基酸序列含有1个跨膜区,有16个N-糖基化位点、7个N-酰基化位点、17个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点及5个蛋白激酶C磷酸化位点。同源性分析显示MO-XJ P74蛋白氨基酸序列与标准株MO-SC01氨基酸序列同源率为86.5%,其羧基端为P74蛋白抗原集中区。SDS-PAGE检测结果显示,表达的P74蛋白抗原表位集中区片段对分子质量约为35.5 k Da,与理论值相符;Western blot分析表明重组P74蛋白具有较强的反应原性。【结论】本研究为进一步筛选MO亚单位疫苗及血清学诊断的候选抗原奠定了前期基础。     

鸭坦布苏病毒E蛋白的原核表达

在大肠杆菌中表达鸭坦布苏病毒(duck tembusu virus,DTMUV) 奉贤株的主要结构蛋白E。本研究利用RT-PCR方法扩增出E基因, 将其克隆至原核表达载体pET-30a,构建重组质粒pET-E。将其转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导培养下重组蛋白成功获得了表达。SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子量为63 ku。Western blot分析表明,该蛋白能与抗His标签的鼠单克隆抗体发生特异性反应。以上结果表明,在大肠杆菌中成功表达了DTMUV主要结构蛋白E。     

鸭坦布苏病毒E蛋白线性化B细胞抗原表位的鉴定

为鉴定鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的B细胞抗原表位,以纯化的DTMUV YY5株为抗原制备了2株单克隆抗体AE4和BD10,研究证实BD10为线性化表位,其结合的抗原表位位于E蛋白的第三结构域(DomainⅢ,D_Ⅲ)。将DTMUV E蛋白D_Ⅲ结构域基因截短为具有末端相互重叠的15段,与MBP融合表达后以单克隆抗体BD10进行肽库扫描,结果筛选出DTMUV一个B细胞线性表位_(385)LVGSGKGQI_(393)(EP385)。该表位原核融合表达产物免疫小鼠制备的抗体,能够和DTMUV E蛋白反应,表明EP385表位具有良好的免疫原性,可为DTMUV多肽疫苗的研制及特异血清学诊断方法的开发奠定基础。     

鸭坦布苏病毒XZ-2012株的分离鉴定与基因变异分析

[目的]2012年10月徐州地区某鸭场的樱桃谷种鸭突然发生产蛋下降,疑似鸭坦布苏病毒病.为了确诊病因,本试验进行了剖检与病原的分离鉴定.[方法]将病料匀浆处理后尿囊腔接种SPF鸡胚,分离病毒,接种BHK细胞培养,应用RT-PCR扩增病毒全基因,测序并进行基因进化分析.[结果]分离到一株鸭坦布苏病毒,命名为DTMUV XZ-2012株.该病毒株能适应鸡胚,无血凝活性,在BHK-21细胞上第5代的病毒滴度为5×104 PFU·mL-1.测序结果表明该病毒株基因组全长为10 990 nt,编码的多聚蛋白含3 426个氨基酸.DTMUV XZ-2012株与BYD株、YY5株和JS_2010株等分离株的全基因同源性为98.5％ ～99.3％.与最早分离的BYD株等相比,XZ-2012株的基因变异主要分布于E基因、NS1基因、NS2基因和NS5基因,提示该病毒在自然界的流行存在一定的免疫压力.[结论]本试验成功分离鉴定了一株鸭坦布苏病毒,为鸭坦布苏病毒候选疫苗株的筛选及病毒分子流行病学研究提供了参考信息.     

羊口疮病毒安徽株023基因的原核表达与生物信息学分析

试验旨在克隆表达羊口疮病毒安徽株023基因,对该基因进行PCR扩增、亚克隆及表达,通过蛋白表达纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,并利用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域等。结果显示,023基因全长819 bp,编码272个氨基酸,蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体的形式表达且有良好的反应原性。生物信息学分析表明,该蛋白是亲水稳定蛋白,其中α-螺旋(h)占27.57%,延伸链(e)占17.28%,β-转角(t)占12.13%,无规则卷曲(c)占43.01%,无信号肽区域和跨膜结构域,可能存在30个磷酸化位点,4个B细胞抗原表位,3个CTL表位和3个Th表位。研究结果不仅有助于了解羊口疮病毒023基因的结构与功能,还能为建立快速诊断的检测方法提供参考。     

建兰花叶病毒广东分离物TGBp1生物信息学分析及抗血清制备

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)是危害兰花的重要病毒。为对建兰花叶病毒广东分离物运动蛋白TGBp1进行研究,本试验制备了TGBp1多克隆抗血清,将CymMV广东分离物TGBp1基因克隆到原核表达载体中,诱导表达融合蛋白,以其为抗原制备多克隆抗血清,并对TGBp1进行生物信息学分析。结果表明,TGBp1融合蛋白的相对分子质量约为31.5 kD,该融合蛋白以包涵体形式存在;并以纯化的融合蛋白为抗原成功制备了TGBp1多克隆抗血清。Western blot分析表明,该抗血清与融合蛋白有较强的免疫反应;间接ELISA结果显示其效价高达524 288倍。生物信息学分析表明,该蛋白结构特征与已报道的CymMV其他分离物基本一致。本研究所制备的TGBp1多克隆抗血清具有专化性,为该蛋白质的生物学功能研究奠定了基础。     

鳗鲡疱疹病毒FJ株ORF51基因的克隆及生物信息学分析

为了解本课题组分离的鳗鲡疱疹病毒福建株（AngHV-FJ） ORF51的结构特征,扩繁了 AngHV-FJ ,提取其基因组DNA ,经PCR扩增,获得ORF51基因,将其克隆至pMD19-T载体中,进行DNA测序,用生物信息学方法分析AngHV-FJ ORF51基因及其编码蛋白的结构和功能。结果显示,扩增到长约720 bp的ORF51基因序列,其与GeneBank上鳗鲡疱疹病毒欧洲株（AngHV-1） ORF51基因的序列完全一致。该基因编码239个氨基酸;预测ORF51基因编码蛋白的分子量为26107.1 Da ,等电点为7.66,是疏水性蛋白且偏碱性;有4个跨膜域;抗原表位预测显示抗原性较好;结构预测显示,存在1个N-糖基化位点、1个O-糖基化位点、10个磷酸化位点;亚细胞定位预测显示其主要存在于内质网。本研究为解析ORF51的功能及开展AngHV的基因工程疫苗研究奠定了基础。     

鹅副粘病毒M基因主要抗原位点片段的原核表达及鉴定

根据GenBank中发表的GPMV SF02株M基因核苷酸序列设计合成一对引物,通过RT-PCR扩增JS/1/97/G0株M基因主要抗原位点片段M1,将其克隆入pMD18-T载体,序列测定和分析表明,所扩增的M1基因核苷酸长为444 bp,共编码148个氨基酸.将M1同载体PGEX-6P-1连接后,转化入E.coli BL21(DE3)PlysS,经IPTG诱导表达出目标蛋白,与预计相符.对表达的M1蛋白进行Western blot鉴定,表明所表达的M1蛋白可以与GPMV SF02株阳性血清发生特异性反应.     

表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性

为开展鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联苗的研究,将密码子优化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因插入转移载体p EP-BGH-end构建了p EP-BGH-E重组表达质粒。在鸭瘟病毒疫苗株细菌人工染色体(p DEVvac)的基础上,首先通过Red E/T两步重组法构建了EF1启动子替换GFP基因CMV启动子的p DEV-EF1突变体克隆,并将p EP-BGH-E质粒上的重组表达框p CMV-E-BGH-p A再次通过两步重组克隆至p DEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带有外源基因DTMUV E的突变体克隆p DEV-E。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)获得了重组病毒r DEV-E。病毒蚀斑大小测定结果显示,r DEV-E在CEFs上的蚀斑面积较亲本株相比稍有减少。Western blotting分析表明,外源蛋白E在病毒感染的CEFs细胞中成功表达。     

种番鸭减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因的克隆与序列分析

运用PCR技术从表现产蛋异常的种番鸭分离鉴定的减蛋综合征病毒(EDSV)E05株中分段扩增六邻体蛋白基因,分别与克隆载体pMD18-T连接后,转化感受态细胞,对经PCR鉴定和酶切鉴定均为阳性的克隆进行测序.结果表明,E05株六邻体蛋白基因长度为2733 bp,共编码910个氨基酸.序列分析表明,该株病毒与鸡源EDSV 127株和鹌鹑源EDSV QU株六邻体蛋白基因的核苷酸同源性分别为99.6%和96.0%,氨基酸同源性分别为99.9%和99.3%.     

Virulence,E Gene Sequence and Antigenic Difference of 4 Duck Tembusu Virus Isolations

【Objective】The research aimed to compare the virulence of Duck Tembusu Virus (DTMUV), and to analysis its envelope protein gene sequence analysis and antigenic difference. 【Method】Susceptible 10-day-old duck embryos were inoculated with four different DTMUV strains, including DTMUV-HB isolated in 2011, DTMUV-AH isolated in 2014, DTMUV-GX1 isolated in 2012 and DTMUV-GX2 isolated in 2015. The median embryo lethal dose (ELD₅₀) of the four strains was measured with 6-day-old SPF chicken embryos. According to that, forty 180-day-old healthy Peking duck were challenged respectively with four strains which were diluted into 100 ELD₅₀/0.5 mL. The clinical, virological, pathological features of different DTMUV strains infection in ducks were characterized. The viral RNA of eight DTMUV strains were extracted from the allantoic fluid, and then the E gene were amplified by RT-PCR and sequenced. Then the similarity analysis of nucleotide and amino acid sequence and phylogenetic analysis were carried out. The HI titers of 4 antisera against 4 DTMUV strains were determined with duck Tembusu virus hemagglutination inhibition test. The neutralization titers of 4 antisera against 4 DTMUV strains were determined by neutralization assay using C6/36 cell lines. We analyzed the antigenic difference of 4 DTMUV strains by R value, which contained cross hemagglutination inhibition test and cell cross neutralization test. 【Result】(1) The median embryo lethal dose (ELD₅₀) were 10 ^-4.7-10 ^-5.3/0.1ml. The artificial infection test suggested that, feed intake and egg production of the challenged group decreased significantly on 3 days post inoculation (dpi), and the virus positive isolation rate were more than 85% on 2 dpi. The gross lesions of the reproductive system were mainly deformed and hemorrhaged follicular by necropsying on 8 dpi. (2) The results of sequence analysis showed that nucleotide sequence similarity was 95.7% - 100%, and the similarity of amino acid sequence was 98.2%. Genetic evolutionary analysis illustrated that all the DTMUV isolates in this study gathered into the same clade. (3) The R value showed antigenic difference of cross hemagglutination inhibition test were 0.79-1.12, and that of cell cross neutralization test were 0.79-1.20. 【Conclusion】There were no significant difference in virulence, E gene sequence and antigenicity of four DTMUV strains isolated in this study.     

重组鸭瘟病毒载体中筛选高效表达鸭坦布苏病毒E蛋白启动子

【背景】鸭瘟和鸭坦布苏病毒是鸭的两种重要传染病,鸭瘟属于疱疹病毒科,具有开发成病毒载体的优势。为了优化鸭坦布苏病毒E基因在重组鸭瘟病毒载体中的表达,之前探讨了不同形式鸭坦布苏病毒E蛋白在重组鸭瘟病毒载体中的表达,发现以鸭为宿主进行密码子优化的E基因C端截短形式(E451-dk,简称为Es)表达量最高。【目的】探讨不同启动子对Es在重组鸭瘟病毒载体中表达的影响,为鸭瘟病毒—坦布苏病毒二联苗的研制奠定基础。【方法】将pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)启动子通过常规基因克隆的方法替换转移载体pEP-BGH-Es中的pCMV启动子,构建不同启动子调控Es表达的重组表达框pro-Es-BGH-pA。在鸭瘟病毒(DEV)疫苗株细菌人工染色体克隆pDEV-EF1的基础上,将5个重组表达框分别通过"Red E/T两步重组"克隆至pDEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带不同启动子调控的Es突变体克隆pDEV-pro-Es。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)拯救获得相应重组病毒rDEV-pro-Es,并对重组病毒感染细胞蚀斑大小和Es蛋白表达情...     

鸭坦布苏病毒E蛋白及其结构域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对DEF细胞周期与凋亡的影响

【目的】探究鸭坦布苏病毒(Duck Tambusu virus,DTMUV) E蛋白全长及其结构域I、II和III (DI、DII和DIII)对鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblast,DEF)的细胞周期与凋亡的影响。【方法】本研究设计、合成DTMUV E蛋白全长及其DI、DII和DIII真核表达质粒,并转染至DEF,用流式细胞仪检测不同蛋白引起的DEF细胞凋亡和细胞周期的变化。【结果】细胞凋亡结果显示：质粒转染细胞24 h后,E蛋白全长及DI、DII、DIII诱导的DEF早期凋亡率分别是16.4%、15.1%、14.0%和17.2%;质粒转染细胞36 h后,E蛋白全长及DI、DII、DIII诱导的DEF早期凋亡率分别是23.4%、18.5%、26.7%和29.4%。细胞周期检测结果显示：E蛋白全长及DI、DII、DIII的质粒转染细胞24、36 h后,DNA合成期(S期)细胞比例都明显高于pEGFP-N1空载体转染组。质粒转染24 h后,E蛋白及DI、DII、DIII的S期细胞比例分别为5.43%、22.58%、12.75%和12.80%;质粒转染细胞36 h后,...     

实时荧光技术在鸭坦布苏病毒 RT-LAMP检测方法中的应用

由鸭坦布苏病毒(DTMUV)引起的蛋鸭产蛋急剧下降给我国的养鸭业造成了巨大的经济损失.针对DTMUV E基因保守区域设计一套LAMP引物,利用实时荧光技术建立了DTMUV的实时RT-LAMP病原检测方法.该方法检测RNA的最低检测极限可达到7.8 copies,其灵敏度是普通RT-PCR的100倍,且只能特异性扩增DTMUV的RNA,对其他常见鸭源病毒核酸均无特异性扩增.该方法简单快速、特异性强和灵敏度高,判定结果只需要观察扩增曲线,适用于DTMUV早期感染的诊断、分子流行病学调查和疫情监测.     

鸭坦布苏病毒一步法RT-PCR检测方法的建立和应用

鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV)是一种新发现可引起鸭产蛋下降的新型黄病毒,建立一种病原学检测方法对于疫病的诊断和流行病学研究具有重要意义。在对DTMUV序列的比对分析的基础上,设计了1对特异性引物,通过优化PCR反应条件,建立了DTMUV的一步法RT-PCR检测方法。该方法具有特异、快速、敏感、准确等特点,可以检出1.82个TCID50的病毒核酸。对2010年至2011年6月份前的106份产蛋下降鸭群临床病料进行了检测,结果显示样品阳性率为46.2%,表明DTMUV在浙江及其周边省份的产蛋鸭群具有较高的感染率。     

鸭坦布苏病毒对雏鸭血清生化指标、细胞因子和病毒复制情况的影响(英文)

为了解鸭坦布苏病毒(DTMUV)的致病性,试验以1×10~4EID_(50)的剂量DTMUV肌肉注射5日龄樱桃谷雏鸭,采用生化指标检测试剂盒对血清样品进行生化指标检测,采用荧光定量PCR方法检测排毒情况、组织载毒量和细胞因子的变化情况。结果表明,DTMUV对肝脏、肾脏、心脏和肌肉组织都有严重损伤;DTMUV可以在肝脏、脾脏、肺脏、脑中增殖,并于攻毒后第5天在肝脏和脑中达到高峰,于攻毒后第9天后在肺脏和脾脏中达到高峰,且脑、肝脏、脾脏中病毒含量最高;攻毒后第1天DTMUV就可引起脾脏中γ干扰素(IFN γ)、α干扰素(IFN α)、白细胞介素6(IL-6)、β干扰素(IFN β)、白细胞介素1β(IL-1β)、Toll样受体7(TLR-7)、白细胞介素2(IL-2)、主要组织相容性复合体Ⅰ型(MHC-Ⅰ)、主要组织相容性复合体Ⅱ型(MHC-Ⅱ)细胞因子过渡表达,在脑中第1,2,3 d均引起促炎性细胞因子IL-6、IL-2的过度应答。     

Hemagglutinating Activity of Duck Tembusu Virus

【Objective】 The objective of this paper was to study the hemagglutinating activity of duck Tembusu virus (DTMUV). 【Method】The DTMUV was inoculated intracerebrally in the 1-3-day-old sucking mice of BALB/c in different dilution to observe the morbidity. The brains of sucking mice were collected and purified according to the referenced methods. The purified virus fluid was inactivated by suitable inactivator, followed by the inactivated inspection in 6-day-old SPF chicken embryo. The virus fluid was evaluated the hemagglutinating activity with the erythrocyte suspension of chicken, duck, goose, pigeon and swine. The concentration of the erythrocyte suspension used in the hemagglutination test was compared to select the proper concentration. The pH value of the reaction system between 6.0-7.0 and the reaction temperature including 4℃, room temperature and 37℃ were compared. 【Result】 In the 6 day after inoculation , the sucking mice inoculated with 1:10 dilution appeared severe clinical symptoms including twitch, paralysis, and most of them were in agonal stage, while the symptoms of the sucking mice inoculated with 1:50 and 1:100 dilution were slighter. The purified DTMUV fluid was pinkey and clarified. It could be inactivated by formaldehyde but not β-propiolactone that would produce lots of flocks and change the property of the fluid. The DTMUV could hemagglutinate with the erythrocyte suspension of chicken, duck, goose, pigeon and swine, and the agglutination graphics was clear and stable when the concentration of the erythrocyte suspension was 0.33%. The hemagglutinating activity of DTMUV could be showed when the reaction system pH value was 6.0-6.8, while the highest hemagglutination titer appeared during the pH 6.0-6.2. Furthermore, the hemagglutinating activity could be appeared at 4℃, room temperature and 37℃, respectively, although the time required for hemagglutination at 4℃ was much longer. 【Conclusion】The DTMUV proliferated in the sucking mice of BALB/c had a broad spectrum of hemagglutinating activity that could hemagglutinate with the erythrocyte suspension of chicken, duck, goose, pigeon and swine. The hemagglutinating activity was stable and could hemagglutinate with the goose erythrocyte at 4℃, room temperature and 37℃. The suitable reaction conditions were 0.33% concentration of the erythrocyte suspension and pH 6.0-6.2 of the reaction system.     

一株鸭坦布苏病毒的分离鉴定及全基因组序列分析

2010年我国爆发了使蛋鸭产蛋量急剧下降、由一种鸭黄病毒引起的疾病,通过对来自山东某发病鸭场的病料进行分离,得到实验室分离株Du/CH/LSD/110128。对其进行全基因组序列测定分析,确定该株病毒全基因组含有一个开放阅读框,编码一个由3 426个氨基酸组成的多聚蛋白。将试验测得株Du/CH/LSD/110128株与黄热病毒(Yellow fever virus)、登革热病毒(Dengue virus)、伊利乌斯脑炎病毒(Ilheus virus)、西尼罗病毒(West Nilevirus)、巴格扎病毒(Bagaza virus)和其他一些已公布序列的坦布苏病毒进行核酸同源性比较和遗传进化树分析,发现Du/CH/LSD/110128株与巴格扎病毒亲缘关系较近但介于病毒种的水平上,与其他株坦布苏病毒核酸同源性在87%以上,可以确定Du/CH/LSD/110128株属于新型鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus)。     

非洲猪瘟病毒(Malawi LIL 20/1株)k8R基因的表达与鉴定

蛋白多肽二级结构的电脑预测表明,非洲猪瘟病毒（ＭａｌａｗｉＬＩＬ２０／１株）ｋ８Ｒ基因编码带有多个疏水氨基酸小区的２７ｋＤａ蛋白质。该基因的ＰＣＲ产物克隆入质粒ｐＧＥＸ－２Ｔ后,在大肠杆菌中表达４２～５４ｋＤａ不溶性ＧＳＴ－ｋ８Ｒ融合蛋白。此表达蛋白能被针对不同非洲猪瘟病毒株的猪免疫血清识别。在非洲猪瘟病毒细胞适应株感染的细胞中,针对ｋ８Ｒ大肠杆菌表达产物的单抗能检测出２７ｋＤａ特异病毒蛋白。进一步鉴定表明,ｋ８Ｒ基因编码的蛋白质为病毒非结构蛋白,不发生糖基化,出现于病毒感染周期的晚期,主要集中于靠近细胞核的病毒复制部位。用大肠杆菌表达的ＧＳＴ－ｋ８Ｒ融合蛋白免疫猪未能抵抗ＭａｌａｗｉＬＩＬ２０／１强毒株攻击。