甘蓝黑腐病黄单胞菌胞外蛋白酶的致病作用

现代分子生物学实验技术,为研究植物病原菌的致病机理提供了有效的手段。目前已在分子水平上,证实了甘蓝黑腐病黄单胞菌产生的胞外蛋白酶在致病过程中起着重要的作用。本文就此病原菌产生的胞外蛋白酶、胞外蛋白酶基因的克隆分析、胞外蛋白酶突变体的构建以及胞外蛋白酶在致病过程中的作用的研究进展作一概述。     

转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获胞外多糖突变体的验证

利用转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５上的抗性基因,通过“鸟枪法”克隆到用这种转座子诱变甘蓝黑腐病黄单胞菌所获得的三个胞外多糖突变体菌株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７中的转座子及其相邻序列的ＤＮＡ片段,并利用含有这些片段的重组质粒,通过标记置换构建了突变体。通过检测标记置换突变体的胞外多糖产量及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交,证实了胞外多糖突变株Ｔ１０６、Ｔ１１３和Ｔ１１７不仅确系转座子插入所致,而且转座子插入的位点分布在染色体的不同区域。从而证实了我们所报道的诱变体系是可行的     

甘蓝黑腐病菌rPf基因簇对胞外蛋白酶Ⅰ基因表达的调控

甘蓝黑腐病黄单胞菌（ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓｃａｍｐｅｓｔｒｉｓＰｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）产生的胞外蛋白酶Ⅰ在致病的早期阶段起重要作用，该酶以及其它胞外酶和胞外多糖的合成受一致病因子调控基因簇（ｒＰｆ基因簇）的正向调控。本研究利用带有β－半乳糖苷酶报道基因（ｌａｃＺ）的转座子Ｔｎ５－Ｂ２０诱变蛋白酶Ⅰ基因克隆，获得了ｌａｃＺ在蛋白酶Ⅰ基因启动子控制下表达的Ｔｎ５－Ｂ２０插入突变质粒。通过将这种突变质粒导入野生型和各ｒｐｆ基因突变体菌株后，测定ｌａｃＺ基因在细胞生长周期中的表达水平，不仅进一步证实了这些ｒｐｆ基因对蛋白酶Ⅰ基因的正向调控作用，而且明确了它们的调控水平．发现ｒｐｆＡ、ｒｐｆＣ、ｒｐｆＥ、ｒｐｆＧ或ｒｐｆＨ突变后，蛋白酶Ⅰ基因的转录会降低９０％左右，而ｒｐｆＢ突变后，蛋白酶Ⅰ基因的转录只降低４８％。     

花生黑腐病抗病品种筛选及抗病相关酶活性测定

花生黑腐病是由冬青丽赤壳(Calonectria ilicicola)引起的花生毁灭性病害。为研究花生品种对该病害的抗性情况和抗性机制,采用幼芽水培接种的方法对128个花生品种进行抗性鉴定。结果发现高抗、中抗、中感、高感的花生品种数分别为1、13、42和72个。高抗品种T09的病情指数仅为8.0,发病率为36.7%;高感品种P562的病情指数高达46.0,发病率为100%。通过室内盆栽试验方法对P562、桂花35、云花生、AS09和T09进行抗病性检验,结果与幼芽水培接种鉴定的结果一致。通过测定T09和P562接种花生黑腐病菌后防卫相关酶活性的变化,T09的苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性分别在接种后0.5和5 d出现2次高峰(最大峰值为451.09 U·g^-1·h^-1FW),其峰值出现时间较高感品种P562早;T09的多酚氧化酶(PPO)活性在接种后0.5 d出现峰值(271.67 U·g^-1·min^-1FW),P562的PPO活性在接种后1 d出现峰值(160.02 U·g^-1·min^-1FW);两个品种的过氧化物酶(POD)活性均升高,T09在接种后0.5 d出现高峰(239.23 U·g^-1·min^-1FW),P562在接种后0.25 d出现高峰(135.75 U·g^-1·min^-1FW);两个品种接种后超氧化物歧化酶(SOD)活性均升高,T09在接种后的第5天出现高峰(28.08 U·g^-1·h^-1FW),P562在接种后第3天出现高峰(16.79 U·g^-1·h^-1FW)。酶活性结果表明,PAL、PPO、POD和SOD在花生抗病性中可能密切相关。本研究结果为后续花生高抗品种的选育及花生黑腐病的抗病机制奠定了基础。     

采用两种突变方法对甘蓝黑腐病菌XC_1348基因的功能解析

为研究甘蓝黑腐病菌Xcc8004基因组中一个功能未知的假定蛋白XC_1348的基因功能,本研究用自杀质粒pK18mob和pK18mobSacB分别通过同源单交换和同源双交换构建XC_1348的非极性整合突变体1348nk和有标记的缺失突变体DM1348Gm,并对两种突变体的表型进行检测,结果显示该基因突变后不影响细菌的胞外多糖（EPS）产量、胞外酶活性以及细菌游动性.有趣的是该基因的两种突变体的致病力存在较大差异,原因可能是Xcc经两种方法定点突变后分别具有的不同基因组结构而影响到某些基因的表达所致.通过研究初步了解了XC_1348基因的功能并为今后改进定点突变方法提供现实依据.     

转座子报告基因Tn5gusA5诱变甘蓝黑腐病菌分离与致病相关的突变体

构建携带报告基因的转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５于广谱性ｃｏｓ质粒ｐＬＡＦＲ１上，利用Ｔｎ５ｇｕｓＡ５诱变野生型甘蓝黑腐病黄单胞菌，筛选与致病性有关的因子（胞外多糖，胞外酶）突变体，通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交和报告基因ｇｕｓ表达验证，突变体是由转座子诱变所致。     

克隆包含以拟南芥为寄主的甘蓝黑腐病菌Xcc1067无毒基因的DNA片段

本研究探索了以拟南芥为寄主的甘蓝黑后病菌的致病条件，观察了其病症的发展．建立了菌株Ｘｃｃ１０６７的ｐＩＪ３２００为载体的基因文库，从基因文库中筛选出拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ为寄主的Ｘｃｃ１０６７菌株的无毒基因克隆，该克隆的进一步分析正在进行。     

水稻白叶枯病黄单胞菌中与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病因子调控基因(rpf 基因)同源基因的分子克隆

DNA-DNA 杂交结果表明,水稻白叶枯病黄单胞菌总 DNA 中存在着与甘蓝黑腐病黄单胞菌致病因子调控基因(rpf 基因)具有同源性的 DNA 外段.应用广谱性寄主载体pLAFRI,在大肠杆菌中建立了水稻白叶枯病黄单胞菌野生型菌株 T3000的基因文库.从文库中筛选到与 rpf 基因具有同源性的克隆 pGXN3000,将重组质粒 pGXN3000通过三亲本接合转入甘蓝黑腐病黄单胞菌 rpf 基因突变体,发现 pGXN3000能互补甘蓝黑腐病黄单胞菌 rpf突变体,恢复其致病性胞外酶和胞外多糖的产生及致病性.转座子 Tn5诱变,缺失分析及DNA-DNA 杂交实验结果表明,重组质粒 pGXN3000中确实含有与甘蓝黑腐病黄单胞菌编码。双组份调控系统”蛋白的 rpfC 基因功能相同的基因,此基因被定位于 pGXN3000中的3kb BamHl 片段中。     

十字花科黑腐病菌分泌蛋白表达谱分析

本文旨在分析Xcc8004菌株分泌蛋白的蛋白表达谱,建立Xcc8004分泌谱分析方法。首先将诱导的Xcc8004分泌蛋白进行液体酶解,通过HPLC阳离子交换柱分离多肽,采用EASY-nLC结合Orbitrap质谱鉴定分泌谱。经过过滤筛选后,共精确鉴定蛋白1532个,SignalP分析其中包含286个含信号肽且不含跨膜区,其中118个为假定蛋白。对286个可能的分泌蛋白进行基因本体评注分析,其中,主要为行驶水解酶类,受体蛋白,信号传导等重要的微生物-植物互作介导蛋白。本研究通过液相色谱-质谱联用能够高效鉴定Xcc8004的分泌蛋白,对这些鉴定的分泌蛋白的信息学分析有利于我们进一步研究Xcc8004的致病机制,为研究微生物植物相互作用鉴定了方法与理论基础。     

十字花科黑腐病菌hrpG基因原核表达

在十字花科黑腐病菌（Xcc）中,hrp基因对寄主的致病性和非寄主的超敏反应中起核心作用,而hrpG对整个hrp基因簇起调控作用。HrpG为OmpR家族的双组分系统感受调控蛋白,含有两个结构域,分别是N端Response_reg和C端Trans reg_C。本研究利用表达载体pQE-30Xa,成功构建了HrpG的表达重组子,在E.coliM15[pREP4]中进行诱导表达。通过调节诱导温度、IPTG浓度和诱导时间最终确定在温度为20℃,IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导表达4h。hrpG基因在宿主细胞E.coli M15获得高效可溶性表达。目前尚未有可溶性HrpG蛋白获得成功表达的报导,本研究中获得HrpG蛋白在大肠杆菌获得大量可溶性的表达,将为in vitro研究HrpG的生理活性,特异的结合位点和调控功能研究打下良好基础。     

十字花科黑腐病菌RNA提取与质量鉴定

十字花科黑腐病菌,学名野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris,简称Xcc）,是一类γ-变形菌纲的革兰氏阴性细菌,能在世界范围内侵染十字花科植物,给农业生产造成重大损失。RNA是分子生物学的主要研究对象之一,提取高质量的RNA是研究十字花科黑腐病菌基因表达调控机理的基础。由于Xcc能产生大量胞外多糖及黄单胞色素,且细菌RNA半衰期较短,目前尚缺少一种大量提取Xcc高质量RNA的有效方法。该研究在参考多种RNA提取方法的基础上,建立了一种简单、有效的适合十字花科黑腐病菌RNA的提取方法。得到的RNA样品经过紫外分光光度法和甲醛变性凝胶电泳检测,证实为完整、均一的总RNA,达到了表达谱分析及cDNA文库构建的要求。     

黑果枸杞基础理论研究进展

黑果枸杞是一种集盐碱地绿化价值、防护林价值、药用价值等于一体的野生优良植物,生态效益和经济效益兼具,是盐碱、沙漠、干旱地区最具开发潜力和价值的植物品种之一。但其目前基本处于野生状态,且原生地自然条件恶劣,植被退化严重,已经对黑果枸杞的生存造成了很大的威胁,甚至有些地区黑果枸杞成片死亡,保护和合理利用这一植物资源迫在眉睫。从国内外对黑果枸杞的研究成果来看,目前还没有系统地进行过研究,从而影响了对黑果枸杞的保护和合理开发利用。     

玉米茎腐病的综合防治措施

1症状 茎腐病是由多种病原菌单独或复合侵染造成根系和茎基腐烂的一类病害的总称。一般在玉米灌浆期开始发病,乳熟期末期至蜡熟期为显症高峰期。在我国茎腐病的症状主要是由腐霉菌和镰孢菌引起的青枯和黄枯为主。     

海南薯蓣茎腐病病原菌的鉴定

为弄清海南薯蓣茎腐病病原,采用离体致病性测定、形态学和分子生物学鉴定等方法,对其进行了研究。从海南临高、海口等薯蓣生产基地采集病样89份,纯化出分离物28个。经致病性试验证实,分离物lp3—1、b16-5、bd6-4和lp2—5为薯蓣茎腐病病原菌。经形态学鉴定,4个分离物均为镰刀菌（Fusariumsp．）。利用真菌18SrRNA基因引物、镰刀菌特异性引物和轮枝镰刀菌特异引物进行PCR扩增,能扩增出510bp大小的镰刀菌DNA片段,不能扩增出轮枝镰刀菌DNA片段。序列分析表明：分子生物学和形态学鉴定结果一致,且镰刀菌Fu3／Fu4区序列分析能进一步确定薯蓣茎腐病是由尖孢镰刀菌薯蓣专化型（Fusariumoxysporumfsp．dioscorea）侵染引起的一类植物真菌病害。     

遮放镇西番莲果腐病的病原菌鉴定

采用Koch法则对西番莲病果样品进行病原菌的分离和致病性测试,并采用形态学与分子生物学相结合的方法鉴定病原菌。结果表明,分离得到的编号为XFL20190803的病原菌为西番莲果腐病的致病菌;对其进行的形态特征观察及菌丝ITS1/ITS4序列在NCBI上的同源性比较结果表明,XFL20190803为烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae)。