松材线虫BxPrx基因抗H2O2胁迫的转录模式及功能

为探究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)响应H_2O_2胁迫的分子机制,利用荧光定量PCR测定松材线虫过氧化物还原酶基因BxPrx在不同浓度(2.5、5.0、7.5、10.0mmol/L)H_2O_2胁迫下的转录水平;利用RNA干扰技术,沉默松材线虫BxPrx基因,比较H_2O_2胁迫下BxPrx基因沉默组与非基因沉默组松材线虫存活率的差异。结果显示:松材线虫的存活率与H_2O_2胁迫浓度呈负相关;松材线虫BxPrx在H_2O_2胁迫下的转录水平均提高;在5.0、7.5、10.0 mmol/L H_2O_2胁迫下,经过BxPrx基因沉默处理的松材线虫存活率显著低于对照组。     

松材线虫磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1基因的克隆及表达

应用BLAST比对技术,在松材线虫基因组数据中鉴定得到模式线虫pdk–1的同源基因Bxpdk–1。结合RT–PCR技术进行Bxpdk–1基因完整蛋白编码区(CDS)扩增,得到CDS区全长2298bp。Bx PDK–1蛋白含有"STKc_PDK1""PH_PDK1"2个保守结构域,属于磷酸肌醇激酶超家族。序列比对及进化树分析显示,松材线虫Bx PDK–1蛋白与捻转血矛线虫PDK–1蛋白(CDJ88126.1)同源性为50%,进化树聚在同一小分支上,亲缘关系较近。原位杂交试验表明,Bxpdk–1基因主要在线虫的头部神经元及咽部神经处表达。q PCR结果分析显示,Bxpdk–1基因表达响应鱼藤酮药剂胁迫处理。RNAi试验显示,Bxpdk–1在dsRNA处理12 h时,基因表达量显著下降,基因被沉默。     

松材线虫效应因子基因筛选及Bx-Hh-grl功能研究

  目的  通过对松材线虫效应因子基因的克隆和功能研究,揭示Bx-Hh-grl对松材线虫致病性的作用,为防治松材线虫提供理论依据。  方法  用松材线虫Bx1022株系接种黑松,20 d后提取线虫总RNA进行转录组测序,将该转录组设为松材线虫植食阶段转录组。提取由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）培养的Bx1022的总RNA进行转录组测序,将该转录组设为菌食阶段转录组。比较分析两个转录组,筛选到差异表达基因Bx-Hh-grl。对Bx-Hh-grl编码蛋白质的跨膜结构域和信号肽进行预测。利用原位杂交检测Bx-Hh-grl表达部位。应用RNAi技术干扰Bx-Hh-grl表达以探究Bx-Hh-grl对松材线虫致病性的作用。通过Q-PCR验证,确定RNAi效果显著。将经RNAi处理的松材线虫接种3年生黑松枝条,以未经处理的松材线虫（CK组）和ddH₂O（Mock组）处理的黑松作为对照,比较黑松发病情况进而比较不同处理后松材线虫的致病性差异。  结果  筛选出植食阶段与菌食阶段转录组差异表达基因Bx-Hh-grl,其编码蛋白质具有跨膜结构域和信号肽。原位杂交试验结果显示Bx-Hh-grl在松材线虫食道腺表达,符合效应因子基因特征。Q-PCR结果显示经RNAi处理后的松材线虫Bx-Hh-grl表达量下调,RNAi处理效果显著。接种实验表明,Bx-Hh-grl-RNAi组显症的时间明显晚于CK组,Mock组黑松一直保持健康状态。  结论  Bx-Hh-grl是与松材线虫致病相关的效应因子基因。明确Bx-Hh-grl功能有利于进一步了解松材线虫致病机理,为降低松材线虫危害,防治松材线虫奠定理论基础。      

低温调控Bx-SCD促进松材线虫脂肪积累

为探究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)低温胁迫条件下进入滞育状态的分子机理,应用Blast比对技术,在松材线虫基因组中鉴定得到秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)scd的同源基因,命名为Bx-SCD。应用PCR技术进行Bx-SCD完整蛋白编码区扩增,分析了低温胁迫下Bx-SCD表达量,并采用改良油红-O染色法测定低温胁迫后松材线虫脂肪相对积累率。结果表明:PCR扩增得到779 bp产物,Bx-SCD编码338个氨基酸,等电点为8.77,相对分子质量为39.532 78 ku。该蛋白属于质膜-脂肪酸去饱和酶域超家族蛋白,具有fa_desaturase结构域。低温胁迫下Bx-SCD表达量显著上调,同期松材线虫脂肪相对积累率显著上升。低温胁迫正向调控Bx-SCD基因表达,促进松材线虫脂肪积累,有助于松材线虫在低温胁迫条件下进入滞育状态并存活。     

松材线虫RNA聚合酶基因的RNA干扰研究

克隆了松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)RNA聚合酶基因片段,构建大量表达松材线虫RNA聚合酶基因片段的特异双链RNA(dsRNA)表达载体,并用表达的双链RNA(dsRNA)对松材线虫进行了RNA干扰实验。结果表明,松材线虫浸泡在20℃的RNA聚合酶基因双链RNA(dsRNA)溶液中干扰24 h后再培养12 d,其繁殖倍数为73.2;对照处理的繁殖倍数为322.8,两者的繁殖倍数相差4.4倍;松材线虫浸泡在4℃的RNA聚合酶基因双链RNA(dsRNA)溶液中干扰24 h后再培养12 d,其繁殖倍数为120.8。RNA聚合酶基因的双链RNA(dsRNA)浸泡明显的抑制了松材线虫的繁殖;并且发现利用浸泡法对线虫进行干扰试验,双链RNA(dsRNA)20℃浸泡的干扰效果要好于前人报道4℃浸泡的干扰效果。     

褐飞虱海藻糖酶基因在表皮几丁质代谢中的调控作用

【目的】昆虫海藻糖酶能够调控几丁质代谢并控制蜕皮过程。本研究通过TRE表达被抑制后,检测褐飞虱(Nilaparvata lugens)蜕皮状况、几丁质含量及几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)和几丁质酶(chitinase,Cht)基因表达情况,探究不同的海藻糖酶(trehalase,TRE)在褐飞虱表皮中对几丁质代谢的调控作用。【方法】采用RNAi技术,以实验室饲养种群褐飞虱为材料,通过向其体内注射双链RNA(dsRNA)分别抑制单个海藻糖酶基因或同时抑制多个海藻糖酶基因,注射48 h后通过Trizol法提取褐飞虱总RNA,反转录试剂盒合成第一链DNA后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测该基因的表达情况,确定RNAi效果。氢氧化钾法测定48 h褐飞虱整体几丁质含量变化并对蜕皮困难虫体进行拍照;最后采用qRT-PCR检测褐飞虱CHS和Cht在mRNA水平上的相对表达量变化,分析TRE在调控几丁质代谢中的作用。【结果】与注射dsGFP相比较,其余各注射组褐飞虱整体几丁质含量显著下降,其中dsTRE1混合注射组与Validamycin注射组呈极显著下降,同时褐飞虱出现蜕皮困难等现象。qRT-PCR检测结果显示单个TRE的dsRNA注射后该基因的表达被抑制,但是部分TRE的表达有互补性上升。其中TRE1-2和TRE2在各注射组处理下表达均下降,dsTRE1s对TRE2的表达也有抑制效果,整体上dsTRE1混合注射组和海藻糖酶抑制剂Validamycin抑制效果明显;dsTRE注射组抑制CHS表达效果不明显,Validamycin能够显著降低CHS1和CHS1a在表皮中的表达,且2种dsTRE1注射后CHS1表达在上升,dsTRE1-2注射后表皮中的CHS1a的表达上升;Cht1和Cht8在dsTRE各注射组及Validamycin处理中表达下降或显著下降,dsTRE1-1注射后Cht2和Cht5表达显著上升;dsTRE1-2注射后Cht1、Cht6和Cht8表达下降,Cht2和Cht4表达显著上升;dsTRE2处理组中Cht1、Cht8和Cht10表达下降而Cht9表达显著上升;dsTRE1s注射后,Cht1和Cht5表达显著下降,而Cht9表达显著上升;Validamycin注射组中10个几丁质酶基因表达都显著或者极显著下降。【结论】TRE能够通过调控褐飞虱几丁质代谢途径来控制几丁质的合成,结果可为开展和筛选有效的海藻糖酶抑制剂控制褐飞虱等害虫提供理论依据。     

松材线虫细胞色素cyp-13A11基因RNA干扰载体的构建及其功能分析

[目的]构建松材线虫cyp-13A11基因RNA干扰载体,研究cyp-13A11基因的功能,为松材线虫病的生物防治提供理论依据.[方法]本文通过设计特异性引物,扩增松材线虫cyp-13A11基因片段,构建至pEASY-T1干扰载体上并转入Trans1-T1大肠杆菌菌株.采用浸泡法对松材线虫进行RNA干扰,通过qRT-P...     

海藻糖在酿酒酵母抗铜胁迫中的作用

 【目的】研究铜胁迫下,酿酒酵母胞内海藻糖的积累情况及海藻糖对酿酒酵母的保护作用,为探讨铜胁迫下酿酒酵母的防御保护机制提供理论依据。【方法】以改良模拟葡萄汁为发酵培养基,分别对菌株AWRI、BH8和Freddo进行直接铜胁迫处理（Cu2+浓度为1.00 mmol•L-1）、热激预处理（37oC,1 h）、再铜胁迫处理,同时,设定无铜培养为对照。测定各种处理下酿酒酵母的存活率、胞内海藻糖的积累和6-磷酸海藻糖合成酶（TPS1）酶活性的变化。【结果】与对照相比,1.00 mmol•L-1Cu2+胁迫处理使酵母细胞内海藻糖的含量增加,TPS1酶活性提高。热激预处理可诱导海藻糖的积累,且铜胁迫下细胞的存活率也显著高于直接铜胁迫处理。相同处理条件下,菌株Freddo胞内海藻糖的含量最多,细胞存活率也最高。【结论】铜胁迫处理可诱导胞内海藻糖的积累,并且这一积累对铜胁迫下的酿酒酵母起到一定的保护作用。     

松材线虫P糖蛋白在药物代谢过程中的功能研究

  目的  探究松材线虫对药物敏感能力产生的分子机制，为防治松材线虫提供理论基础。  方法  本研究从松材线虫基因组中获得秀丽线虫同源解毒基因Bx-pgp23，并对该基因蛋白编码区进行PCR扩增，随后通过生物信息学对蛋白质Bx-PGP23理化性质、亲疏水性、跨膜区分布、磷酸化位点、二级结构和三级结构进行了分析和预测。并通过RNAi技术对Bx-pgp23进行沉默处理，分析Bx-pgp23沉默与否对松材线虫药物敏感程度的影响。  结果  生物信息预测结果显示PGP蛋白稳定系数为38.31，亲水系数为?0.018，三级结构预测PGP蛋白具有多个氨基酸参与构成α螺旋和β折叠并且具有多个核苷酸结合域和跨膜结构域。应用RNAi技术对Bx-pgp23基因进行基因沉默，沉默后的Bx-pgp23基因表达量变为原来的42.65%。药剂敏感性检测实验结果显示，在1.5和2.5 g/L苦参碱溶液处理24 h后，RNAi组松材线虫死亡率与对照组相比升高了7.2%和6.4%，在1.5和2.5 g/L的苦参碱溶液处理48 h后，RNAi组松材线虫死亡率与对照组相比升高9.0%和7.2%。  结论  蛋白质Bx-PGP23是一种稳定的亲水蛋白，具有跨膜外排功能。成功克隆Bx-pgp23基因并合成了该基因dsRNA。Bx-pgp23基因沉默影响了松材线虫对苦参碱的敏感性，在相同质量浓度的苦参碱胁迫下，RNAi组线虫死亡率明显高于对照组，说明Bx-pgp23基因在松材线虫药物代谢调控中发挥着正向调控作用。      

小麦HMW-1Bx17基因启动子的功能验证

[目的]小麦HMW-1Bx17基因是在小麦胚乳中特异高表达的基因,该基因启动子的获得可为进一步研究小麦高分子量麦谷蛋白种子特异表达的调控模式提供基础材料,并为小麦品质改良的基因工程研究奠定基础。[方法]本文以改良的CTAB法提取小麦"舜麦1718"基因组DNA为模板,根据已知序列设计引物,利用嵌套PCR扩增1Bx17基因启动子片段。构建1Bx17基因启动子启动下的GUS(β-葡糖苷酸酶)基因表达载体,用基因枪法分别导入小麦根、茎、叶、胚乳及胚中进行瞬时表达,同时构建了1Bx17基因启动子驱动的抗菌蛋白Gnk2-1基因表达载体用于小麦幼胚稳定转化。[结果]X-gluc染色检测表明,GUS基因在该启动子的驱动下能在小麦胚乳中特异表达。通过对再生抗性植株的RT-PCR鉴定,初步表明已获得转基因植株,并进一步证明了启动子的驱动功能。[结论]本文所获得小麦1Bx17基因的启动子在小麦基因工程遗传改良等方面具有一定的利用潜力。     

叶面喷施外源ABA对胡椒抗寒生理生化及ABA信号转导相关基因的影响

[目的]筛选出能提高胡椒抗寒性的脱落酸(ABA)适宜浓度,明确低温胁迫条件下外施适宜浓度ABA对胡椒叶片ABA信号转导相关基因SnRK2和PYL表达的影响,为生产上提高胡椒抗寒技术及揭示ABA信号在胡椒抗寒中的作用机理提供依据.[方法]以热引1号胡椒为试验材料,通过叶面喷施0(CK)、25(T1)、50(T2)、75(T3)、100(T4)mg/L ABA及4℃低温胁迫处理,测定各处理胡椒叶片叶绿素荧光参数、抗氧化酶活性(POD、CAT和SOD)、H2O2和MDA含量.在筛选出适宜ABA喷施浓度的基础上,进一步运用实时荧光定量PCR分析ABA信号转导相关基因的表达情况.[结果]低温胁迫后,不同浓度ABA处理的胡椒POD、CAT和SOD活性与CK相比均显著上升(P<0.05,下同),其中T2处理的POD活性升高最显著,T3处理的CAT和SOD活性升高最显著;随着ABA处理浓度的升高,H2O2和MDA含量呈先下降后上升的变化趋势,以T3处理含量最低,即一定浓度外源ABA处理对胡椒抗寒生理发挥积极作用.低温胁迫0 d时,不同ABA浓度处理的胡椒Fv/Fm和Fv/Fo无显著变化;低温胁迫4d时,其Fv/Fm和Fv/Fo均显著降低,但T3处理缓解Fv/Fm和Fv/Fo下降效果显著,即ABA预处理能够在一定程度上缓解低温对胡椒光系统潜在活性的抑制.低温胁迫0 d时,不同ABA浓度处理胡椒的qP和Yield无显著变化,但qN随着ABA处理浓度的升高明显下降,即正常生长条件下,外施不同浓度ABA对胡椒叶片的qP和Yield无影响,但会减弱胡椒的光保护能力;低温胁迫4 d时,不同ABA浓度处理的胡椒叶片qP、qN和Yield均有不同程度的下降,随着ABA处理浓度的升高,qN呈现下降、上升再下降的变化趋势,qP呈先下降后上升的变化趋势,T3处理成为转折点,即在低温胁迫下外源ABA能够提高胡椒的光保护能力,其中T3处理效果相对较好.低温胁迫条件下,ABA预处理可诱导ABA信号转导相关基因SnRK2和PYL提前并高表达.[结论]外源ABA通过提高胡椒抗氧化酶活性、降低H2O2和MDA含量及缓解低温对其光系统活性的伤害,从而提高胡椒抵抗低温胁迫的能力.外源ABA还能诱导胡椒ABA信号转导相关基因表达,启动和引发植株固有抗冻性基因的表达,进而提高其耐冻性.     

α和β-蒎烯胁迫下松材线虫转录组特征

为研究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)对寄主蒎烯胁迫反应的分子机制,按m(α-蒎烯)∶m(β-蒎烯)=1.0∶0.4配制α和β-蒎烯混合液,并以该混合液处理下的松材线虫为研究对象,通过高通量测序技术平台Illumina HiSeq 2000对其转录组进行测序。结果表明:α和β-蒎烯混合液对松材线虫繁殖率存在显著影响,低质量浓度时抑制松材线虫的繁殖,高质量浓度时促进松材线虫的繁殖。α和β-蒎烯混合液质量浓度为17.16 g L-1时对松材线虫的繁殖抑制效果最明显,从该质量浓度处理下松材线虫的转录组中筛选出差异表达基因146条,其中上调表达116条,下调表达30条,主要包括细胞色素酶P450基因家族、葡萄糖醛酸脱氢酶家族。GO富集生物学过程主要包括氧化还原作用、单体生物代谢过程以及血红素结合等功能分类,KEGG富集的代谢通路主要包括外源物质的P450代谢通路和药物代谢通路。松材线虫在蒎烯胁迫过程中细胞色素酶P450基因家族和葡萄糖醛酸脱氢酶家族可能发挥了关键作用。     

海藻糖代谢及其调控昆虫几丁质合成研究进展

海藻糖为一种非还原性糖,广泛存在于细菌、藻类、真菌、植物和无脊椎动物中。海藻糖被称为昆虫“血糖”,源于该糖为昆虫血淋巴中的主要糖类物质,在昆虫生长、发育、蜕皮等正常生理活动中有着重要的作用。昆虫的海藻糖先由海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,TPS）生成海藻糖-6-磷酸,然后通过海藻糖磷酸脂酶（trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP）最终合成海藻糖,在能量需求时通过海藻糖酶（trehalase,TRE）降解为葡萄糖,用于能量供给。几丁质为昆虫表皮、中肠围食膜和气管系统的主要组成成分,昆虫在发育过程中需要蜕掉旧表皮,形成新的表皮,该过程一直是害虫控制的重要靶标途径。海藻糖酶为昆虫几丁质合成途径的第一个酶,在几丁质合成通路中有着重要的功能。那么海藻糖代谢又是如何调控几丁质合成途径来控制昆虫的蜕皮及几丁质代谢的呢？随着国内外海藻糖代谢相关基因功能研究的深入开展,研究结果表明昆虫海藻糖供给在几丁质合成中具有重要的作用,海藻糖酶分为可溶性和膜结合型两类,可溶性TRE和TPS在不同昆虫种类中具有多个同源基因,表明昆虫海藻糖代谢进化途径多样化。其次,海藻糖代谢直接调控几丁质合成途径,不论是海藻糖合成酶还是海藻糖酶基因的低表达,均能控制海藻糖使其供给不平衡,从而导致几丁质合成途径受阻,特别是几丁质合成酶基因表达降低而造成几丁质含量下降,该调控作用可进一步引起昆虫蜕皮困难、翅发育畸形等,甚至大量死亡。再次,海藻糖酶抑制剂能够抑制可溶性和膜结合型两类海藻糖酶活性、引起几丁质合成通路相关基因及几丁质酶基因表达的显著下降,导致几丁质含量显著降低,产生高比例的昆虫个体死亡。这些结果充分表明,一旦昆虫海藻糖代谢的供给平衡被打破,会直接影响到昆虫的几丁质合成乃至昆虫的蜕皮与发育过程。本文综述前人在海藻糖代谢调控几丁质合成方面的最新研究成果,为将来开发和利用海藻糖酶抑制剂及海藻糖合成酶抑制剂等绿色农药防治害虫提供理论依据。     

湖北三峡地区松材线虫的耐寒性

为了探究松材线虫的耐寒性,以采自湖北省宜昌市夷陵区的松材线虫（ Bursaphelenchus xylophilus）为试验对象,研究低温及低温驯化对松材线虫存活情况的影响。结果表明：松材线虫有较强的耐低温能力,在10、5、0、－5、－10℃低温条件下,随着处理时间的延长,松材线虫存活率逐渐降低,各温度半致死时间分别为20．17、35．63、30．65、1．17 d,其中－10℃低温条件下短暂暴露,线虫全部死亡。此外,在0℃和5℃条件下经不同时间驯化后,－5℃暴露处理24 h,松材线虫的存活率显著提高,表明松材线虫耐寒性随着驯化时间的延长显著提高,但是0℃和5℃两种驯化温度对松材线虫的耐寒性增加差异不显著。     

拟南芥膜定位蛋白At CP2调控抗冻性的功能分析

COR家族成员在调控植物响应低温胁迫过程中发挥重要作用。从拟南芥中克隆一个新的低温胁迫响应基因At CP2,其属于COR基因家族中的COR413亚家族,编码区612 bp,编码203个氨基酸,分子量22.75k Da,等电点9.44。亚细胞定位和基因表达模式分析结果表明:At CP2定位在叶绿体膜上,对ABA、PEG、Na Cl和低温四种非生物胁迫均有响应。基因功能分析结果显示:功能缺失性突变体cp2冷处理后存活率明显高于野生型拟南芥(WT),相对电导率和MAD均低于WT,证明At CP2基因负向调控植物抗冻性。蛋白质组及qRT-PCR分析结果证明At CP2通过负向调控4个ABA及低温胁迫相关基因(包括ABA2、KIN1、COR47和COR15B)的表达影响植物抗冻性。总之,At CP2基因的功能分析结果对了解COR413基因家族的功能提供了参考。     

绿盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因原核表达、 纯化与酶学特性

【目的】在前期克隆了绿盲蝽水溶性海藻糖酶（ALTre-1）基因的基础上,以获得具有酶活性的重组蛋白,明确酶促反应的最佳pH值及最适温度,为绿盲蝽海藻糖酶分子调控机制及其抑制剂的应用研究奠定基础。【方法】将含有绿盲蝽ALTre-1基因的T载体经Nde I和Not I双酶切,构建ALTre-1基因原核表达载体（pET28a-ALTre-1）,表达载体经诱导表达和蛋白纯化,获得ALTre-1功能区纯化蛋白。在蛋白浓度为0.3 mg•mL-1的条件下,以海藻糖为底物,对纯化得到的重组Tre-1蛋白进行活性检测,确定其酶促反应的最佳pH值和最佳温度。【结果】ALTre-1基因在大肠杆菌中BL21中能够高效表达,纯化获得的重组蛋白在试验条件下有较高的海藻糖酶水解活性（（184.83±13.39）nmol•μg-1•min-1）。重组ALTre-1蛋白活性最适pH值为7.0（酶活性为（202.04±13.76）nmol•μg-1•min-1）,表明重组ALTre-1蛋白是1个在中性环境中具有最佳活性的海藻糖酶,同时重组ALTre-1蛋白酶活性最适温度为55℃（酶活性为（228.59±4.62）nmol•μg-1•min-1）。【结论】本研究克隆得到了ALTre-1全长基因,获得了具有海藻糖酶活的重组蛋白,该重组蛋白在pH 7.0、温度55℃条件下酶活性最高。     

黔北黑猪骨骼肌中肌纤维类型转化相关circRNAs的筛选

选取9头6月龄健康黔北黑猪,随机分成3组,采集背最长肌(LDM)和腰大肌(PMM)肌肉组织,通过RNA–seq构建环状RNA(circRNAs)的表达谱,筛选差异表达的circRNAs,在黔北黑猪2种肌肉中共鉴定出63个差异表达circRNAs,其中31个在LDM中表达上调,32个表达下调;对差异表达circRNAs的源基因进行GO、KEGG富集分析,结果表明,差异表达的circRNAs的源基因主要富集在磷酸酶活性的调控、肌节组织活动、肌球蛋白–轻链–磷酸酶活性的正调控等条目;富集的KEGG通路中与肌纤维类型转化相关的通路包括肌动蛋白细胞骨架的调控、ECM–受体互作、PI3K–Akt信号通路。预测差异表达circRNA的靶miRNAs,并筛选对应的靶mRNAs,构建的circRNA–miRNA–mRNA调控网络显示,circ_0003749–miR–27a–MSTN、circ_0003749–miR–27a–PPARγ、circ_0012316–miR–23a–Myh1/2/4、circ_0007093–miR–214–3p–MEF2C、circ_0010118–miR–132–FoxO1和circ_0010118 –miR–374a–5p–FoxO1可能通过ceRNA网络调控肌纤维类型的转化。     

菊花CmDREBa-2基因的功能验证

为探究CmDREBa-2基因的抗性功能,了解CmDREBa-2调控菊花参与高、低温防御反应及响应白色锈病的分子机制,构建了过表达载体pBI121-CmDREBa-2,利用农杆菌介导法转化菊花'C029'。对转基因植株进行45℃高温、-4℃低温及接菌处理后,观察表型并分析下游基因表达量。结果表明:PCR检测共获得2个阳性植株,半定量与qRT-PCR表明CmDREBa-2成功高表达。在45℃的高温胁迫处理下,转基因株系存活率显著高于野生型,并显著提高了热胁迫基因CmHsp90、CmHsfA2、活性氧清除基因SOD的表达。低温胁迫处理下,转基因株系OE-5,OE-8的存活率分别为90%和85%,而野生型仅为10%,同时,抗寒相关基因COR413、COR6.6和抗逆基因rd29a的表达较处理前升高,且高于野生型。接种白色锈病病原菌32h时,转基因株系中CmDREBa-2的表达量激增,同时CmDREBa-2的过表达也不同程度地促进了病程相关基因PR1和PDF1.2的表达。其中,PR1基因的表达更为明显。综上,CmDREBa-2可能直接或间接调控胁迫相关基因增强菊花对高温胁迫和低温胁迫的耐受性。CmDREBa-2通过SA介导的抗病信号途径,参与菊花抵抗白色锈病反应。     

松材线虫耐药基因克隆及其功能

为探究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)耐药的分子机理,对松材线虫耐药基因Bx-mrp1进行鉴定并对其蛋白结构及功能进行了研究。在松材线虫基因组数据中得到松材线虫与秀丽线虫(Caenorhabditis elegans) mrp1具有同源性的基因,命名为Bx-mrp1,并比较了松材线虫Bx-mrp1与相近线虫属之间的mrp基因差异。对松材线虫Bx-mrp1完整蛋白编码区(CDS)进行PCR扩增后,运用RNAi技术对该基因进行基因沉默,分析沉默该基因后对松材线虫死亡率的影响。通过PyM OL软件对Bx-MRP1蛋白质进行三维结构预测。结果表明:在NCBI中,通过BLAST比对,Bx-mrp1与秀丽线虫mrp1同源性为43%。Bx-MRP1蛋白质包含32个α螺旋和18个β折叠,以及含有3个TMD和2个NBD结构,具有多个跨膜结构域,表明Bx-mrp1具有跨膜运输的功能。通过PCR得到松材线虫Bx-mrp1基因CDS区全长为4 659 bp。在对Bx-mrp1基因沉默后,发现RNAi处理组的松材线虫在同质量浓度的苦参碱药剂胁迫下的死亡率有所增加,在多药耐药生理过程中起正向调控作用。     

两个褐飞虱海藻糖转运蛋白基因的结构及调控海藻糖代谢功能

【目的】海藻糖是昆虫中的主要血糖物质,在昆虫的发育及生理活动中发挥重要功能。其中,海藻糖转运蛋白（Tret）在将海藻糖从其生成组织（例如脂肪体）运输到其消耗组织的过程中起着重要作用。本研究通过分析褐飞虱（Nilaparvata lugens）两条Tret1的序列结构,进一步抑制NlTret1的表达,探讨这两个NlTret1在褐飞虱体内的生物学功能。【方法】以褐飞虱两条Tret1序列为研究对象,利用生物信息学技术分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。采用RNAi（RNA interference）技术将合成的外源dsRNA（double-stranded RNA）注射到实验室饲养褐飞虱种群体内,抑制其体内NlTret1的表达,分别在注射48 h后取材,抽取总RNA并用反转录试剂盒合成第一链cDNA,采用qRT-PCR（quantitative real-time PCR）技术检测dsNlTret1的干扰效果以及RNAi后褐飞虱体内海藻糖代谢通路中相关基因的表达,最后测定葡萄糖、海藻糖和糖原含量以及海藻糖酶活性。【结果】生物信息学分析表明,NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1的开放阅读框长度分别为1 920和1 578 bp,分别编码639和525个氨基酸,预测蛋白分子量分别为69.29和58.71 kD,等电点分别为8.32和8.36;NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1的二级结构主要包含螺旋和卷曲;保守结构域分析显示它们均属于MFS家族。进化分析结果显示,不同昆虫的Tret1蛋白具有较高的同源性,且褐飞虱与其他半翅目昆虫具有较近的亲缘关系;与注射dsGFP组相比,注射靶标基因的dsRNA后均能够显著沉默本基因的表达;褐飞虱体内糖原、葡萄糖在注射dsNlTret1-like X1和dsNlTret1-2 X1后,其含量均无显著变化,然而不同于注射dsNlTret1-2 X1组,在注射dsNlTret1-like X1后褐飞虱体内海藻糖含量极显著升高;干扰NlTret1-like X1 48 h后褐飞虱体内TPS1、TPS2、TRE1-1、TRE1-2和TRE2的表达均极显著下调;而干扰NlTret1-2 X1 48 h后褐飞虱体内TPS1、TPS2和TRE1-1的表达虽也极显著下降,但TRE1-2和TRE2极显著上调;在注射dsNlTret1-like X1后,试虫可溶性海藻糖酶和膜结合型海藻糖酶的活性均极显著降低,而在注射dsNlTret1-2 X1后无显著变化。【结论】褐飞虱的两个Tret1在不同组织间发挥着不同的功能,其中NlTret1-like X1在特异性转运海藻糖参与能量供应中起到更为显著的作用。研究结果有助于探索Tret1在昆虫或无脊椎动物中调控海藻糖代谢平衡的调节机制,可为将来通过调控血糖平衡来控制褐飞虱等害虫提供理论依据。