运用PCR检测猪圆环病毒的研究

设计和合成了一对引物，建立PCR反应，用于检测猪圆环病毒。结果表明，PCR对猪圆环病毒细胞毒，病毒基因克隆具有较好的特异性和灵敏性，提示用PCR试验检测猪圆环病毒是一种较好的方法。     

应用复合PCR法检测猪圆环病毒

根据基因库中猪圆环病毒（PCV）的基因序列设计引物，建立复合PCR方法，对2株PK－15细胞进行了PCV检测。结果2株PK－15细胞都可扩增出PCV－1的基因片段，其中1株还扩增到了PCV－2的DNA片段。由此可见，应用设计的引物进行复合PCR快速检测PCV是可行的，这为PCV的检测、分型及PCV相关疾病的诊断奠定了基础。     

猪圆环病毒病的PCR检测分析

猪圆环病毒(PCV)的聚合酶链反应(PCR)实验用于猪血清和组织中PCV的检测、诊断和流行病学调查。该检测试验是利用离心柱内惰性大分子膜提取病料DNA作为模板,中温时在TaqDNA聚合酶作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,沿模板合成一条新链。每个环节包括高温变性、低温退火和中温延伸三个过程,使特异DNA片段的拷贝数放大1倍。经过35次循环,最终使扩增DNA片段放大了数百倍。将扩增的产物进行电泳,经染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到DNA片段的扩增带。分别利用PCV1和PCV2阳性对照进行检测,PCV-1阳性对照出现652bp扩增带和PCV-2阳性对照出现1154bp扩增带,阴性对照无带出现(引物带除外)时实验结果成立。从该实验中充分了解检测过程中的每一个步骤以及注意事项,充分掌握PCR检测的要点,同时更加全面地了解猪圆环病毒的知识。     

PCR技术在猪圆环病毒2型检测中的应用

参照Gen Bank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因序列,设计合成1对引物,建立了检测猪场疑似病例临床样本中PCV-2的PCR方法。结果显示,PCV-2的ORF2扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,呈现1条630 bp的特异性条带,与预期目的片段大小一致。应用该方法对安徽省3个猪场的30份病料进行了PCV-2检测,结果有9份检测出PCV-2,阳性率为30%。结果表明,该试验建立的PCR方法,是一种快速、灵敏、高效的PCV-2检测技术。     

PCR快速检测猪圆环病毒2型的方法建立及应用

根据GenBank公布的猪圆环病毒2型保守序列设计了一对引物,建立了检测猪圆环病毒2型的PCR方法,并对其特异性、敏感性进行了研究.该PCR方法对猪圆环病毒2型扩增结果为阳性,对照毒株扩增结果均为阴性;对猪圆环病毒2型检测的灵敏性为1pg总DNA量.结果表明,该PCR方法特异性强、敏感性高、简便、快速,可用于猪圆环病毒2型的早期确诊和病毒鉴定.     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

根据GenBark中登录的猪圆环病毒2型基因序列,应用PrimerPremier5.0设计筛选一对扩增ORF2基因引物,建立从猪病料中直接检测PCV2感染的PCR方法。扩增PCV2阳性样品出现一条447bp的特异性DNA条带,扩增产物测序结果证实为PCV2ORF2基因序列。应用本方法扩增猪瘟病毒(HCV)、猪繁殖与障碍综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)等常见猪病原均未出现特异性条带,表明方法特异;敏感性试验结果表明,样品DNA模板检测浓度可达到9.8×10-4ng/μL;重复性和稳定性试验结果表明,用本试验建立的PCR方法进行PCV2检测,结果稳定可靠。经病猪临床检测应用,在66份病猪样本中,PCV2感染阳性率为27.27%,且多与PRRSV、PRV、HCV、PPV等一种或多种病毒混合感染,混合感染比例达72.22%。     

应用套式PCR方法检测猪圆环病毒2型

根据Genbank中发表的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因序列,设计2对PCV2特异性引物,建立套式PCR检测方法。外测引物p1、p2扩增片段长度为647bp(92-738),内测引物p3、p4扩增长度为219bp(319-537)。其中用外部引物可扩增DNA含量到10-5mg/mL,而套式PCR则比普通PCR灵敏性还要提高103倍。用该方法对山东、安徽和河北10省的899份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测,结果有329份样品检测出阳性,平均阳性检测率达36.6%。由此可见,PCV2感染在全国范围内的发病猪群中普遍存在。     

猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立

根据已发表的PCV—1和PCV-2全基因组序列，设计了3条引物，组成PCV-2的特有引物对和PCV-1、PCV-2的共有引物对，分别扩增长度为472bp和339bp的片段。为验证PCR扩增的特异性，将472bp的扩增产物纯化后，克隆到pMD18-T载体，转化大肠埃希氏菌TG1，对阳性克隆进行酶切及PCR鉴定，并测序。将该序列递交NCB1进行BL-AST同源序列比较，发现它与美国、加拿大及我国台湾的PCV-2毒株核苷酸序列的同源性均在99％以上，与PCV—1毒株的同源性为86％。结果显示，该方法最少可用于3μg病料组织和0．75pg DNA的PCV-2检出．具有很高的灵敏性。应用该PCR方法检测了浙江省和上海市47份“猪高热综合征”病料，PCV-2感染阳性率为36．17％，PCV—1单独感染阳性率为34．04％。     

PCR技术在猪圆环病毒2型检测中的应用

根据猪圆环病毒2型（PCV-2）ORF2基因序列,设计并合成了一对引物,以本室分离鉴定的PCV-2为模板,筛选最佳反应条件,建立了检测PCV-2的PCR方法。应用该方法对PCV-2进行基因扩增,获得长度为559bp的特异性目的DNA片段,而对PRRSV、CSFV、PPV等病毒进行同条件检测,结果均为阴性,无交叉反应;敏感性试验表明,该体系可检测到10．8pg的PCV-2基因组DNA。对2004年-2005年期间送检的81份临床样品进行检测,阳性率为22．2％。表明所建立的PCR技术可用于PCV感染的诊断和流行病学调查。     

猪圆环病毒2型感染的PCR检测

对山东省日照市某规模化猪场发现的患有断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)典型症状的病猪,采用针对猪圆环病毒2型(PCV2)开放阅读框2(ORF2)设计的特异性引物进行PCR检测,从病猪的组织样品中检测PCV2。从10头发病猪的组织样品中检测PCV2,结果有7头呈阳性结果。     

猪圆环病毒2型和猪细小病毒双重PCR检测方法的建立及应用

根椐Gen Bank中登录的猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)核苷酸序列,分别设计2对引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化双重PCR反应条件,建立了2种病毒的双重PCR检测方法,用这2对引物对同一样品中的PCV2和PPV核酸模板进行双重PCR扩增,结果可同时扩增PCV2的245 bp、PPV的475 bp的特异性片段,而对其他4种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出1 pg的PCV2和1 pg的PPV模板。用105份临床病料对本研究双重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法具有特异、快速、准确的特点,可用于对这两种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

猪圆环病毒的研究进展

猪圆环病毒(PCV)分为两个血清型PCV1和PCV2。目前认为PCV2是断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的主要病因,另外,还与猪的多种疾病有关,PCV已经成为目前危害养猪业的主要病毒之一。本文对PCV的特性、流行特征、致病机理、诊断方法以及防治措施作了较全面的综述。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型 (porcine circovirus 2,PCV2) 衣壳蛋白（capsid protein,CAP）基因,构建了重组质粒p-18T-CAP,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2 ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特异探针,通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒p-18T-CAP为标准品进行TaqMan荧光定量PCR扩增,建立了一种检测PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法与猪圆环病毒 1 型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒等均无交叉反应;该方法最低可检测到4.53×10²拷贝/μL,比PCR检测方法高100倍;其标准曲线线性范围是10²～10⁹拷贝/μL,且具有良好的重复性。     

猪圆环病毒2型巢式PCR检测方法的建立与初步应用

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)给养猪业造成了重大的经济损失,建立经济、快速的检测方法尤为重要。本研究旨在利用巢式PCR技术,建立高灵敏度PCV2检测平台,以加强对猪圆环病毒病的防控。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计内、外2对巢式PCR引物,通过优化PCR反应条件,建立巢式PCR检测方法,并对猪场临床样本进行检测。结果显示,本研究建立的巢式PCR检测方法灵敏度高、重复性强,最低检出量为10拷贝/μL,检出率达97.3%。本研究建立的巢式PCR检测方法为快速、高效地检测PCV2以及为猪圆环病毒病的防控提供有力手段。     

Establishment and Preliminary Application of Nested PCR for the Detection of Porcine Circovirus Type 2

Porcine circovirus type 2 (PCV2) caused significant economic losses of swine industry,it's very important to establish a economy and rapid detection method.To strengthen the prevention and control of porcine circovirus disease,rapid and high sesitive detection method of PCV2 was established using nested PCR.According to PCV2 ORF2 gene conservative region,we designed two pairs of nested PCR primers,constructed ORF2 gene recombinant plasmid for standard template and optimizated the PCR reaction conditions to establish nested PCR detection method of PCV2 and detect the clinical samples of pig farms.Our results showed that the sensitivity and repeatability of this method were very high,the minimum detection level was 10 copies/μL and detection rate of clinical samples was 97.3%.In brief,the established nested PCR detection method of PCV2 in this study provided powerful means for quick and efficient detection of PCV2,and prevention and control of porcine circovirus disease in the swine industry.     

Detection of Porcine Circovirus Type 2, Porcine Parvovirus and Porcine Pseudorabies Virus from Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome by Multiplex PCR

Multiplex PCR was established to detect porcine circovirus type 2 (PCV-2), porcine parvovirus (PPV) and porcine pseudorabies virus (PRV) and applied to samples from 137 piglets exhibiting clinical signs of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). PCV-2 DNA was detected from all samples. Moreover, 43 samples were positive for PPV but negative for PRV; 11 samples were positive for PRV but negative for PPV; and 35 samples were positive both for PPV and PRV. These results suggests that PCV-2 co-infection with PRV and PPV may play an important role in PMWS. Also, multiplex PCR is an appropriate candidate method for diagnosis of PCV-2, PRV and PPV simultaneously in field cases.     

猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)和猪圆环病毒2型 (porcine circovirus type 2,PCV2)基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PPV 的VP2、PRV的 gD、和PCV2的ORF2基因为各病毒的诊断靶序列,设计特异性引物,在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了3种病毒的多重PCR技术,可同时扩增PPV 313 bp、 PRV 217 bp和PCV2 447 bp的特异性片段。用多重PCR技术与单项PCR技术对比检测试验证明两者的符合率为100％,表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可同时鉴别诊断这3种病毒。从10个发病猪场和门诊病例的病猪采集的211份样品,用建立的多重PCR检测方法,检出PPV阳性42份,阳性率为19.91%;PRV阳性26份,阳性率为12.32%;PCV2阳性56份,阳性率为26.54%;2种以上病毒混合感染25份,混合感染阳性率为11.85%。检测结果表明,山西省猪群已感染这3种疫病。     

猪圆环病毒病实验室检验技术研究进展

随着规模化养猪业的不断发展,猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)引起的疫病呈上升趋势,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。作者简要介绍了猪圆环病毒分类、分子结构特征、理化特性、生长特性等,对PCV-2的ORF1、ORF2、ORF3蛋白的功能、特性及在疫苗、临床检测等方面的应用进行了阐述。主要就实验室检验技术,如免疫组织化学技术、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应、原位核酸杂交试验等研究进展进行了综述。     

猪圆环病毒2型PCR检测方法的建立及应用

根据Genbank中PCV2全基因组序列设计了扩增片段大小为262bp的引物P1/P2,建立了检测猪圆环病毒2型PCR方法。引物对P1/P2从PCV2阳性病毒感染基因组中扩增出特异性条带的最低DNA含量为10-9ng/mL(约100个PCV2病毒)。用该方法对陕西和甘肃的103份临床发病猪的肺脏和淋巴结样品进行检测,结果有68份样品检测出阳性,阳性率为66%。