不同H9N2亚型禽流感病毒株致病力的比较试验

参照NDV评价毒力的方法对1998—2008年间收集的25株H9N2AIV的致病性进行了比较研究。结果显示,25株H9N2AIV不同毒株间致病性有较大差异,大致分为3类：致病性偏强、致病性中等和致病性较弱。从中选出致病力有差异的8个毒株进行了1日龄雏鸡脑内接种指数（ICPI）、6周龄鸡静脉接种指数（IVPI）以及8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,结果证明大部分毒株ICPI和IVPI基本上为0,排毒散毒的高峰期在攻毒后第5天到第6天。在25个毒株中,3#和12#表现出了比较高的致病性,不仅其EID50值最高（分别为10-8.8/0.2mL和10-8.8/0.2mL）、ELD50值最高（分别为10-7.9/0.2mL和10-8.7/0.2mL）,而且鸡胚平均死亡时间也最短（分别为66.5,69h）。3#、12#还出现了1日龄雏鸡脑内接种指数（分别为0.238,0.437）和6周鸡静脉内接种指数（分别为0.34,0.51）。在8周龄SPF鸡人工感染排毒试验中3#和12#毒株的排毒量大,排毒时间也明显长于其他毒株（第2～9天）。以上试验结果表明我国H9N2AIV不同毒株致病性有明显差异,呈多态性,致病性偏强的毒株造成鸡群较高的死亡率。     

H9N2亚型禽流感病毒疫苗研究进展

H9N2亚型禽流感病毒在世界范围内广泛存在,给养禽业造成巨大的经济损失,并危害人类健康。流感病毒抗原易发生漂移和转换,使流感病毒的防控变得困难。疫苗接种是防控禽流感最有效的手段之一,全病毒灭活疫苗保护效果好,制备简单,是流感病毒常用的疫苗,但该疫苗局部副反应大,并伴随生物安全问题。随着分子生物学技术的发展,活载体疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗等新型疫苗的开发,给H9N2亚型禽流感病毒的防控提供了新的手段。新型疫苗除具有传统疫苗的保护效果外,在生物安全和普遍防控方面具有广泛的优势,是流感病毒疫苗发展的新方向。     

13株H9N2亚型禽流感病毒HA基因变异分析

为了从分子水平上掌握我国H9亚型禽流感的病原变异情况和流行规律,本研究汇集近年来从我国部分省市养殖场分离的13株H9N2亚型禽流感毒株,采用RT-PCR技术对其HA基因进行扩增、克隆和测序,并对所得全序列进行同源性和遗传进化分析。结果显示,13株病毒的HA基因在遗传进化树中均属于欧亚分支中的类Y280-like亚分支,与A/DK/HK/Y280/97的HA基因核苷酸序列同源性为92.2%～97.6%,与中国最早的分离株A/Chicken/Beijing/1/94(简称BJ94)相距较远,初步说明H9亚型禽流感病毒随着流行时间而发生了遗传分化。推测的HA糖基化位点的氨基酸序列12株病毒均与上述亚系相似,但有一株病毒由于一个核苷酸的变异,缺失了HA上218～220位的一个潜在的糖基化位点。     

我国部分地区H9N2亚型禽流感病毒HA基因遗传进化分析

于2008～2013年从江苏、山东、河南、河北等地分离鉴定出45株H9N2亚型禽流感病毒,采用PCR扩增分离株HA基因,并进行HA基因测序、核苷酸同源性分析及遗传进化分析.同源性比较结果显示:45个毒株的HA基因与我国现有疫苗株的HA基因核苷酸同源性为89.1％～94.4％,其中与HP株和F98株的HA基因核苷酸同源性分别为91.3％～94.4％和89.1％～92.0％.遗传进化分析结果显示,分离株的HA基因均属于欧亚谱系A/DK/HK/Y280/97-like分支亚系,证明当前我国大部分地区的H9N2亚型禽流感病毒在同源疫苗的免疫选择压力下,其HA基因与现有疫苗株相比已发生了较大的遗传漂变.     

免疫鸡群H5N1和H9N2亚型禽流感病毒混合感染及H9N2亚型病毒进化分析

本研究分析了免疫鸡群H5N1和H9N2亚型禽流感病毒混合感染中H9N2亚型分离毒株A/chicken/Yuyao/01/2010(H9N2)的基因组特征。氨基酸序列分析显示,HA蛋白裂解位点为PSRSSR/GL,具有低致病性禽流感病毒特征,HA受体结合位点出现了人流感病毒结合位点226L,D基因出现了S31N的突变。遗传分析表明,A/chicken/Yuyao/01/2010病毒的HA基因、NA基因和NS基因在进化上属于CK/BJ/94-Like谱系,D基因和PB2基因属于G1-Like谱系,NP基因、PA基因和PB1基因属于Ck/SH/F/98-Like谱系。结果表明,从H5N1和H9N2亚型混合感染鸡体内分离的H9N2亚型禽流感病毒是一株来源于CK/BJ/94-Like谱系、G1-Like谱系和Ck/SH/F/98-Like谱系的重组病毒。     

2015—2016年广州市部分活禽市场H9N2亚型禽流感病毒的流行病学调查

为了解广州市活禽市场禽流感病毒(AIV)的流行和变异情况,本研究于2015年5月至2016年6月从广州市部分活禽市场采集禽咽喉拭子1 579份,对样品处理之后进行分离和RT-PCR鉴定,通过对HA、NA基因进行遗传进化分析后,共检测到9株H9N2亚型禽源流感病毒。9株分离株的HA基因属于BJ/94-like分支,核苷酸相似性为93.2%~99.7%;有8株分离株的HA基因裂解位点的序列为P-S-R-S-S-R,1株的HA基因裂解位点的序列发生了P/L-S-R-S-S-R的替换。HA蛋白第226受体结合位点的氨基酸均为亮氨酸(Leu),具有人流感受体结合的特征。6株分离株的NA基因属于BJ/94-like分支,3株属于HK/G9-like分支,说明不同分支的病毒开始出现重组。本研究通过对广州市部分活禽市场分离到的禽流感病毒序列分析,掌握活禽市场流感病毒的流行变异趋势,为流感病毒的综合防控及保障公共卫生健康提供参考。     

免疫鸡群中分离的H9N2亚型禽流感病毒的分子特征研究

为研究浙江省禽流感病毒(AIV)的流行病学情况,本实验应用鸡胚传代方法从AIV疫苗免疫鸡群中表现典型呼吸症状的产蛋鸡体内分离1株H9N2亚型AIV A/Chicken/Jiande/01/2009(H9N2)。氨基酸序列分析显示,HA受体结合位点出现了人流感病毒结合位点226L,M基因出现S31N的突变。遗传进化分析显示,A/Chicken/Jiande/01/2009的M基因和PB2基因属于G1-Like谱系,HA基因、NA基因和NS基因属于Ck/BJ/1/94-Like分支,而NP基因、PA基因和PB1基因属于Ck/SH/F/98-Like谱系。这些资料表明,A/Chicken/Jiande/01/2009(H9N2)为一株重排病毒。     

H5N1亚型禽流感病毒进化的研究进展

H5N1亚型禽流感病毒是重要的人兽共患病病原,其基因组为分节段的负股单链RNA,这种特殊的基因组结构使得流感病毒的进化机制跟其他病毒有所不同。本文对流感病毒的进化机制、H5N1亚型禽流感病毒的进化规律和生物信息学在流感病毒进化中应用等方面的研究进展予以综述。     

H9N2亚型禽流感病毒的研究现状

H9N2亚型禽流感病毒已在世界范围内的禽类中分离确认,并被证实可以传播到人类和低等哺乳类动物。对于它存在的潜在危害已经越来越多地受到关注,相关的研究也相继开展。许多遗传进化的分析为禽或猪流感可以直接感染人提供了证据,通过在人体的适应或与人流感病毒基因重组,可以形成新的病毒株,引起人类流感疫情暴发。文章提示应当密切监控H9N2亚型禽流感病毒,防止人类流感大流行。     

H9N2亚型禽流感病毒原位杂交检测方法的建立

根据已知禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)核蛋白(NP)基因序列，选取其中保守区域设计出1时引物。以RT-PR方法扩增出543bp的NP基因片段，采用地高辛标记制备探针。MDCK细胞人工感染H9N2亚型禽流感病毒后，不同时间取样制备细胞涂片，进行原位杂交，研究了禽流感病毒时MDCK细胞的感染。探讨了原位杂交的条件及其应用于检测AIV感染的可行性。结果显示，感染24h后，原位杂交可检测出细胞内的病毒RNA，并且杂交信号的强度与感染时间的长短有关。研究表明。原位杂交检测禽流感病毒，不但能很好地表现病毒和细胞的位置关系,而且具有较好的特异性和灵敏性，为禽流感病毒的组织原位杂交检测奠定了实验基础。     

3种消毒剂对H5N1和H9N2亚型禽流感病毒灭活作用

采用悬浮灭活试验，以鸡胚感染法，研究奇露、卫可、泛福露益选3种消毒剂在一系列浓度下，分别与H5N1和H5N2亚型禽流感病毒作用5，10min，对禽流感病毒的灭活作用。结果表明：1：200、1：280、1：400、1：800、1：1000浓度的卫可，1：320、1：600、1：800、1：1000浓度的泛福露益，1：200、1：400、1：600浓度的奇露对四亚型禽流感病毒可完全灭活31：200、1：280、1：400、1：800浓度的卫可，1：320、1：600、1：800浓度的泛福露益，1：200、1：400浓度的奇露对比亚型禽流感病毒可完全灭活。     

6株H9N2禽流感病毒分子进化及对小鼠的致病性

2009年从山东不同地区的规模化肉鸡场中分离到6株H9N2亚型流感病毒,对其分子特征进行分析,发现6株病毒可以分为2个不同的基因型,并且其中一个基因型是CK/SH/F/98（H9N2）和CK/SH/Y2/2008（H9N2）的重组病毒。为阐明H9N2流感病毒对哺乳动物致病性,分别以106 EID50剂量攻毒6周龄BALB/c雌性小鼠,6株病毒都能在小鼠肺脏中复制,而且2株病毒能在攻毒7d后引起小鼠死亡。结果表明,H9N2亚型流感病毒对哺乳动物毒力有增强趋势。     

3株H9N2亚型禽流感病毒全基因组序列进化分析

为明确3株不同源性的H9N2亚型禽流感病毒(AIV)A/Chicken/Jilin/22/13(简称JL22)、A/Chicken/Jilin/24/13(简称JL24)、A/Duck/Jilin/37/13(简称JL37)基因组的遗传变异情况,本试验采用RT-PCR技术,分别扩增出3株AIV的8个基因片段,克隆后进行序列测定。结果显示,3株H9N2亚型AIV的主要致病基因均属于经典的欧亚种系。氨基酸比对发现JL22的HA氨基酸序列与A/Chicken/Hong Kong/G9/97和A/Duck/Hong Kong/Y280/97的HA氨基酸序列相比,在551位多了1个潜在糖基化位点。JL22、JL24、JL37的HA序列,在226位的氨基酸残基均为Leu,具有同哺乳动物唾液酸受体结合的特性,说明对人的感染性增强。M基因在31位上均发生了Asn取代Ser的现象,说明这些病毒对金刚烷胺产生了耐药性。由系统进化树可知3株毒株亲缘关系较远,各个基因所属分支也不具有统一性,且部分基因分别与鸡源、鸭源和猪源3种源性流感病毒株高度同源,推测这3株毒株是不同动物不同毒株经过长时间进化而发生自然重排的产物。     

上海市三株H9N2鸭禽流感病毒全基因遗传进化分析

为了解上海市鸭群中H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）的遗传变异特征,以及与疫苗株A/Chicken/Shan dong/6/1996和A/Chicken/Shanghai/F/1998之间的遗传距离,对2007年和2009年分离自上海市鸭气管和泄殖腔样品采用荧光RT-PCR检测,将H9亚型禽流感病毒核酸阳性样品处理后,经鸡胚尿囊腔接种分离病毒,HI进一步确定血凝素（haemagglutin,HA）亚型,随后进行了全基因测序,并结合GenBank中的相关序列进行遗传进化分析。结果表明：3株分离毒株为H9N2亚型鸭禽流感病毒,HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为PARSSRGLF,符合低致病性禽流感病毒特征,均属于经典的H9N2 Ck/Bei群系;NA基因均属于Y280系;NP、PA基因和A/Goose/Guangdong/1/1996（H5亚型）归为一群;PB2和M基因属于Qa/HK/G1/97系;NS基因仍为Ck/Bei系;2007年的分离株和2009年的分离株在PB1基因上分属不同亚群。3株病毒的HA1基因与疫苗株A/Chicken/Shandong/6/1996和A/Chicken/Shanghai/F/1998之间的遗传距离均大于7%。由此可见,3株鸭H9N2亚型毒株可能是由不同禽流感病毒基因亚群间发生自然重排的产物,现有疫苗对分离株的保护性需要进一步评估。     

2019年上海地区H9N2禽流感病毒分子特征及演化分析

为了解上海市活禽市场H9N2亚型禽流感病毒(AIV)分离株的遗传变异情况,本研究对2019年分离的4株H9N2AIV的8个基因节段进行PCR扩增、克隆和测序,并对获得的8个基因序列进行同源性以及基因进化分析,对与病毒适应性增加的关键氨基酸位点进行了分析,并和目前我国使用的H9N2流感疫苗毒株HA上的抗原位点进行了比较....     

华东地区家鸭中N2亚型低致病性禽流感病毒神经氨酸酶基因的重排

为研究华东地区家鸭中低致病性禽流感病毒NA基因的遗传进化规律,对2000年～2006年分离的包括H3N2,H5N2,H6N2,H9N2和H11N2的44株禽流感病毒的NA基因进行了遗传进化分析.44株病毒NA基因之间的同源性为82.9%～99.9%,4株H9N2病毒的NA基因同源性为96.9%～99.9%,所有H3N2病毒的NA基因同源性为92.3%～99.9%,H5N2、H6N2和H11N2病毒的同种亚型毒株间的NA基因同源性变化幅度较大,相反,有些不同HA亚型毒株间的NA基因同源性反而很高.进一步分析NA基因推导的氨基酸序列也表现出相似的规律.华东地区家鸭中N2亚型的禽流感病毒正处于不断地进化状态中,不同N2亚型的禽流感病毒之间已存在NA基因的重排.     

25株H9N2亚型禽流感病毒HA基因的遗传进化分析

为了解山东省不同地区H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的变异情况,本研究汇集了2012-2013年间从山东省不同地区发病家禽中分离到的25株H9N2亚型AIV,采用RT-PCR技术扩增其HA基因,并进行测序和遗传进化分析。结果显示,25株病毒HA基因的开放阅读框全长为1 683bp,共编码560个氨基酸,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.5%~100.0%和93.8%~100.0%;遗传进化分析表明25株病毒分离株均属于欧亚分支中的Y280-like亚分支;HA蛋白有7~9个潜在糖基化位点,其中218位糖基化位点缺失,145位新增糖基化位点;25株病毒分离株HA蛋白裂解位点均为RSSR↓GIF,符合低致病力AIV的特征。受体结合位点较保守,234位受体结合位点均为L(亮氨酸),仅198位受体结合位点存在变异。分离的病毒株具有与人唾液酸α-2,6受体结合的特性,此类毒株的流行在公共卫生上值得重视。     

3株H9N2亚型禽流感病毒HA基因变异分析

对近10年来在同一地区分离到的3株H9N2亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因进行扩增和序列分析,探讨H9N2亚型流感病毒变异情况.3个毒株的HA基因全长1 683bp,编码560个氨基酸;其裂解位点均为R-S-S-R,属于低致病力毒株;推导的HA基因氨基酸序列均含7个相同的潜在糖基化位点,受体结合位点为禽源性流感病毒特异性序列,左侧臂氨基酸均为NGQQG,右侧臂均为GTSKA.3个分离株与参考株核苷酸与氨基酸同源率均较高,仅有一些非关键位点突变.它们均属欧亚种系,与A/Duck/Hong Kong/Y280/97代表株亲源关系较近.研究结果从分子水平上证明H9N2亚型禽流感病毒近年来未发生较大变异.     

H9N2禽流感病毒分离株NS基因同源性分析

经RT-PCR扩增了三株国内H9N2亚型禽流感病毒(ATV)分离株的非结构(NS)蛋白基因,并把扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体中测序,获得了NS1和NS2蛋白的完整编码序列.经与GenBank中发表的核苷酸序列比较表明,这三株病毒的NS基因之间的同源性为96%～98%;与1994年以来香港、韩国H9N2亚型分离株NS基因的同源性均在90%以上;其NSI蛋白的C-末端都缺失13个氨基酸,不同于香港分离株;在AIV NS基因系统发育进化树中,三者都处于等位基因A类的亚洲禽-猪群分枝.