伪狂犬病毒早期蛋白0基因缺失对病毒基因表达的影响

应用实时定量RT-PCR分析早期蛋白0(EP0)基因删除对伪狂犬病病毒(PRV)裂解感染培养的猪肾细胞过程中病毒转录本表达的影响。本研究分析表明,在感染早期,EP0对PRV的基因转录有抑制作用,在感染后期对病毒基因的表达是刺激和抑制作用相交替。研究数据表明,EP0的功能可能是逆转早期病毒基因表达的动力学。研究还观察到,EP0促进IE180基因和PRV转录本转录动力学的相互关系的发展,表明EP0的主要功能可能是改变IE180蛋白对PRV转录的影响。     

牛病毒性腹泻病毒感染牛外周血单核细胞对CD80和CD86 mRNA转录的影响

用非致细胞病变（noncytopathic,NCP）和致细胞病变（cytopathic,CP）型牛病毒性腹泻病毒（BVDV）感染临床健康BVDV检测阴性的荷斯坦奶牛外周血单核细胞（PBMC）,利用实时荧光定量PCR技术对感染后共刺激分子CD80和CD86mRNA转录水平的变化进行定量分析。结果表明,在NCP型BVDV感染牛PBMC后CD80在4h（P〈0.05）和12,24h（P〈0.01）出现2次转录高峰,CD86在6h（P〈0.05）出现转录高峰;CP型BVDV感染后,CD80在24h（P〈0.05）出现转录高峰,CD86在6h（P〈0.05）出现转录高峰。尽管CD80在NCP型BVDV感染后呈现较复杂的动态变化,但结果提示NCP型和CP型BVDV感染均可导致牛PBMC的共刺激分子CD80和CD86基因转录在感染早期明显受到抑制,PBMC的抗原呈递能力受到影响。     

鸭瘟病毒UL51基因在感染宿主细胞中的定位和转录特征

对鸭瘟病毒(DPV)UL51基因在感染宿主细胞内的定位和转录时相进行分析,为进一步研究该基因的特性和功能提供有用的试验数据和材料。构建pET32a-UL51原核表达载体,将其转化至E.coliBL21(DE3)中进行IPTG诱导表达后,用Ni2+-NTA琼脂糖凝胶柱层析法纯化该表达产物。以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子,制备兔抗UL51多克隆抗血清,通过间接免疫荧光和RT-PCR法检测该基因在DPV感染的鸭胚成纤维细胞(DEF)内的定位和转录情况。间接免疫荧光结果显示,最早可在感染后8h的胞浆中检测到特异性荧光点,24～36h有大量绿色荧光团块聚集于近核区域,之后随着细胞病变的增强,胞浆中的绿色荧光开始减弱,且在感染晚期的胞核中也出现了少量弥散的绿色荧光。RT-PCR结果显示,DPVU L51基因从感染后4h开始转录,其后转录量不断增大,从6～48h一直保持在较高水平,之后又降低。DPVU L51蛋白主要定位于感染的宿主细胞的胞浆中特别是近核区域,与其在α-疱疹病毒中的同源物的定位结果一致;并且与其他几种α-疱疹病毒的转录情况对比后,可认为该基因是一个晚期(γ类)基因。     

感染Mo对贵州不同品种羊TLRs TRIF通路因子基因转录水平及IFN含量的影响

为了探讨感染绵羊肺炎支原体(Mo)对贵州不同品种羊Toll样受体(TLRs)结构域衔接蛋白(TRIF)信号通路因子TRIF、TRAF6、IRF3、IRF7基因转录水平及干扰素(IFN)含量的影响,试验选择贵州地区的5个主要品种羊,每个品种随机分为对照组(2只)和感染组(3只),感染组试验羊人工感染Mo,用PCR方法检测不同品种羊感染Mo的情况,采用TaqMan RT-qPCR方法检测不同品种羊血液样本中TLRs TRIF信号通路因子基因转录水平,并用ELISA方法检测不同品种羊血液样本中的IFN含量。结果表明：从各品种羊鼻拭子中均检测出与预期大小相符的特异性条带。与对照组相比,相同品种羊在感染Mo后血液样本中TLRs TRIF信号通路因子基因转录水平均出现不同程度的上升,其中以TRIF、IRF7基因转录水平上调较明显(P<0.05或P<0.01);感染后96小时时贵州白山羊和贵州黑山羊TRIF基因转录水平极显著高于其余3个品种羊(P<0.01);感染后96小时时贵州黑山羊和波尔山羊TRAF6基因转录水平显著高于其余3个品种羊(P<0.05);感染后48,96小时...     

禽白血病病毒J亚群感染DF-1细胞后错配修复相关基因转录水平变化的研究

为研究禽白血病病毒J亚群(ALV-J)感染DF-1细胞后错配修复相关基因MMR、BRCA1和p53mRNA的转录水平变化,本研究将ALV-J NX0101株接种DF-1细胞,感染7 d后检测ALV-p27抗原,确定病毒感染是否成功。然后提取细胞中总RNA,采用荧光定量PCR以β-actin基因作为内参对MMR(MSH2、MSH3、MLH1和PMS1)、BRCA1和p53基因的mRNA转录情况进行检测。结果表明,与正常对照细胞比较,病毒感染细胞中的MMR(MSH2、MSH3、MLHl和PMSl)和p53基因的mRNA转录水平升高,而BRCA1基因的mRNA转录水平降低。表明在ALV感染宿主细胞后MMR(MSH2、MSH3、MLHl和PMS)、BRCA1和p53参与了宿主细胞DNA损伤的识别及修复过程,这一结果为ALV的致瘤机理的研究提供了新的思路。     

马立克病病毒超强毒株GX0101感染宿主部分病毒基因表达水平及致病阶段分析

旨在探讨马立克病病毒(MDV)超强毒株GX0101对宿主的感染过程及致病阶段,即"Cornell模型",为进一步使用该毒株研究MDV的致病或致瘤机制奠定基础。用GX0101接种1日龄SPF鸡,建立了感染宿主的动物模型;然后用RT-qPCR分析10个具有代表性的MDV蛋白编码基因在感染不同时间点的动态基因转录水平。结果显示,GX0101感染发病鸡的临床症状及剖检病变与典型的马立克病一致;MDV编码的结构蛋白基因gB、gE和UL6、非结构蛋白基因UL42和UL52、立早期基因ICP4、水平传播相关基因UL13以及磷酸化蛋白基因pp38具有相似的转录水平和趋势,均在GX0101感染后7d上升至第一个峰值,10d降至低谷,14d又逐渐升高并在21d达到第二个峰值,30~60d逐渐下降并处于较低的转录水平;MDV编码的原癌基因meq和毒力相关基因RLORF6在GX0101感染7d即持续升高,并在14~60d的试验周期内较长时间处于高转录水平。结合作者此前研究及本文结果分析,GX0101感染宿主的"Cornell模型":早期增殖性-限制性感染期为1~7d,潜伏感染期约为10d前后,晚期溶细胞性感染及免疫抑制期发生于14~21d,而T细胞转化及淋巴瘤形成阶段可能在14d前后就已经开始。     

MCPIP1基因影响牛病毒性腹泻病毒复制机制的研究

MCP-1诱导蛋白(MCPIP1)可以作为转录因子激活凋亡相关基因的转录、抑制炎症相关基因启动子的激活和诱导细胞分化、血管生成,前期研究发现牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染造成MCPIP1基因的表达显著上调.为了进一步研究MCPIP1基因对BVDV复制的影响,本研究利用CRISPR/Cas9技术建立MCPIP1基因敲除...     

绵羊肺炎支原体感染对贵州不同品种山羊肺脏和血液Toll样受体基因转录水平的影响

绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)可引起山羊、绵羊发生支原体性肺炎,分析绵羊肺炎支原体感染对贵州不同品种山羊Toll样受体(TLRs)基因转录水平的影响。应用TaqMan RT-qPCR对Mo人工感染的贵州黑山羊、贵州白山羊、黔北麻羊和波尔山羊的肺脏和血液样本TLRs基因转录水平进行定量检测与分析。结果显示,不同品种山羊感染Mo后,肺脏样本中贵州黑山羊和贵州白山羊TLR1/2/4/6/8/9/10基因、黔北麻羊和波尔山羊TLR4/6/7/8/10基因转录水平均极显著上调(P<0.01),血液样本中贵州黑山羊TLR2/4/6/7/8/9基因、贵州白山羊TLR2/4/6/7/8基因、黔北麻羊TLR4/6/7/8/9基因、波尔山羊TLR4/6/8/10基因转录水平均极显著上调(P<0.01);且发现不同品种山羊间TLRs基因的转录水平也存在显著差异,最先出现死亡的贵州白山羊、贵州黑山羊肺脏样本中TLR1/6/8/10基因转录水平上调倍数显著高于其余品种山羊(P<0.05),而TLR2/4/5/7/9基因转录水平上调倍数显著低于黔北麻羊和...     

藏鸡和隐性白羽鸡感染柔嫩艾美耳球虫后免疫相关基因的表达变化分析

试验旨在从免疫遗传学的角度初步探讨藏鸡（TC）和隐性白羽鸡（RWC）对柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）易感性差异的分子机制,分别用1×10⁵个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊感染对球虫具有抗性的藏鸡和易感的隐性白羽鸡。应用实时荧光定量PCR检测藏鸡和隐性白羽鸡感染前0 d和感染后第2、4、6和8天脾脏、盲肠、胸腺、法氏囊中γ-干扰素（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）、IL-16、Toll样受体（TLR3）和TLR15免疫相关基因的转录水平变化。结果显示,藏鸡脾脏IFN-γ、IL-2、IL-16及TLR3、TLR15免疫相关基因转录水平于感染后第4和8天明显上调,隐性白羽鸡则无明显变化。藏鸡盲肠IFN-γ转录水平在感染后第2天显著上调（P<0.05）,TLR3在感染后第4天起显著上调（P<0.05）,其余免疫相关基因变化幅度不大;隐性白羽鸡盲肠IFN-γ转录水平在感染后第8天显著上调（P<0.05）,IL-2在感染后第2天起显著上调（P<0.05）,IL-16在感染后第6天起显著上调（P<0.05）,TLR3在感染后第2和8天显著上调（P<0.05）,TLR15变化幅度不大。各免疫相关基因在2个品种鸡胸腺和法氏囊中均出现上调或下调,但除藏鸡法氏囊TLR3和TLR15转录水平变化幅度相对较大外,其余免疫相关基因与感染前相比变化幅度不大。以上结果显示,球虫感染主要导致藏鸡和隐性白羽鸡脾脏和盲肠中的各免疫相关基因出现显著变化,表明宿主的遗传背景在一定程度上可影响球虫感染的免疫应答。     

利用SCOTS技术筛选鸡白痢沙门菌感染巨噬细胞的转录序列

沙门菌在巨噬细胞内的存活是其在宿主内长期定植的主要因素之一,研究利用选择性捕获转录技术(SCOTS)筛选鸡白痢沙门菌S06004株在感染鸡巨噬细胞系HD-11过程中细菌表达的基因.结果显示:鸡白痢沙门菌以MOI值为100:1感染HD-11细胞1h后,感染率达11.75％;选取感染1h时间点作为研究对象,利用SCOTS技术获得了12个鸡白痢沙门菌的转录序列,包括与沙门菌感染相关的毒力基因调控因子invF;构建了invF、tehB和tolC基因插入突变株.突变株侵入HD-11的能力明显低于野生株,反映了SCOTS筛选获得的基因在鸡白痢沙门菌感染巨噬细胞时发挥重要的作用,为深入揭示鸡白痢沙门菌的感染机制提供了基础.     

猪传染性胃肠炎病毒诱导PK-15细胞凋亡相关基因mRNA转录水平变化的研究

为探究PK-15细胞感染猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)后相关凋亡基因Bcl-XL、MCL-1及PUMA mRNA转录水平差异以及TGEV增殖与细胞凋亡之间的关联,本研究在TGEV感染PK-15细胞前后,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率,结果显示TGEV具有诱导PK-15细胞发生凋亡的能力;并利用建立的q PCR方法对凋亡相关基因Bcl-XL、MCL-1和PUMA mRNA的转录水平进行测定,结果显示,感染TGEV (实验组)后Bcl-XL、MCL-1和PUMA mRNA转录水平与未感染病毒组(对照组)有明显差异,进一步表明TGEV感染PK-15细胞诱导了细胞凋亡的进程。本研究为了解TGEV诱导PK-15细胞凋亡的机制提供了实验依据。     

牛副流感病毒3型感染MDBK细胞后影响天然免疫基因表达的筛选与验证

为筛选与验证牛副流感病毒3型(BPIV3)感染MDBK细胞后天然免疫相关基因的差异表达变化,通过细胞病变观察、Western blot验证病毒HN蛋白表达,以及病毒增殖复制动力学曲线,确定病毒复制情况。利用转录组测序技术,对1MOI基因C型SD2014BPIV3毒株感染MDBK细胞的12h对照组与感染组的差异表达基因进行筛选,最后收集BPIV3感染MDBK不同时间点细胞样本,应用RT-qPCR在转录水平验证了天然免疫相关显著差异基因的表达变化情况。结果表明,BPIV3毒株在MDBK细胞上有较强的复制能力,从病毒感染12h的转录组数据中获得了1 401个显著差异基因,经过筛选获得了9个与天然免疫相关的基因,最后在转录水平验证了MDA5、IRF7、STAT1、ISG65、TRIM25等9个与天然免疫相关基因的表达变化,并验证了其上、下游通路或同一家族基因的表达变化。结果表明,筛选与验证的BPIV3感染MDBK细胞差异表达天然免疫相关基因,为宿主细胞影响病毒复制的分子机制研究奠定了基础。     

禽腺病毒血清4型感染鸡组织中NLRP3基因转录水平的实时荧光定量PCR分析

旨在分析禽腺病毒血清4型(FAdV-4)感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平,本研究设计鸡NLRP3特异性引物,利用RT-PCR扩增NLRP3基因180 bp片段并克隆至pMD-18T载体,制备重组质粒pMD-18T-NLRP3。以pMD-18T-NLRP3质粒作为标准品进行荧光定量PCR并建立标准曲线。通过反应条件优化,成功建立了检测NLRP3基因的实时荧光定量PCR方法,并利用该方法对致病性FAdV-4感染鸡组织中NLRP3基因的转录水平进行了分析。结果显示,所设计的NLRP3引物可特异性扩增鸡NLRP3基因,建立的实时荧光定量PCR对鸡NLRP3标准质粒的扩增曲线良好,标准品的拷贝数与Cq值呈现良好的线性关系。与对照组相比,NLRP3分子在FAdV-4感染鸡肝和脾中的转录水平极显著高于对照组(P0.001),在盲肠扁桃体和法氏囊的表达显著高于对照组(P0.01)。本研究所建立的鸡NLRP3基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR可以检测FAdV-4感染鸡不同组织中NLRP3的转录水平;致病性FAdV-4感染所造成的组织炎症损伤与NLRP3分子密切相关。     

C型产气荚膜梭菌感染鹿肠道中关键基因和途径的转录组分析

鹿的产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens,C.perfringens)病主要表现为肠毒血症,致死率高。本研究旨在探究C型产气荚膜梭菌感染鹿肠道的关键基因和途径。通过构建C型产气荚膜梭菌感染鹿空肠结扎环模型,HE染色检测C型产气荚膜梭菌感染后空肠的病理学变化,采用Illumina NovaSeq对C型产气荚膜梭菌感染鹿肠道进行转录组测序,并利用qPCR技术进一步验证部分差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs);最后通过STRING网站预测多基因蛋白互作网络。结果显示：形态学分析显示,产气荚膜梭菌感染后鹿肠道组织出现明显的坏死和出血。转录组分析显示,一共存在705个差异表达基因,其中,在感染组肠道中有276个上调的差异基因,有429个下调的差异基因。GO富集分析显示,DEGs主要富集在生物调节、对刺激的反应和免疫系统过程;KEGG富集分析显示,DEGs富集的通路主要是T细胞受体信号传导途径、Toll样受体信号通路和造血细胞谱系等,造成肠道损伤和出血,促进鹿肠毒血症的进程。此外,qPCR结果证实了分析结果准确可信。DEG...     

旋毛虫T668基因转录及表达的时空特性鉴定

采用RT-PCR和免疫荧光染色技术,分别检测T668基因mRNA及蛋白在旋毛虫不同发育时期中的时空表达情况。RT-PCR结果显示,该基因从旋毛虫新生幼虫出生即开始转录,随着日龄的增加,T668基因mRNA逐渐减少,在感染后11～14 d T668基因的转录趋于停止。免疫荧光染色结果表明,在感染后1d,旋毛虫虫体即有T668蛋白表达;感染后6～13d,T668蛋白分泌到肿大的肌细胞核上;14～20d,肿大的肌细胞核上基本观察不到T668蛋白,但整个虫体仍有很强的蛋白表达。这提示在旋毛虫的寄生过程中,T668基因的转录及表达呈一定的时空特点,这可能对旋毛虫包囊形成有着重要作用。     

新型鹅细小病毒感染鸭的肝、胸腺、回肠转录组差异表达分析

旨在探究新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)与宿主细胞相互作用的分子致病机制.本研究采用转录组测序技术对感染NGPV SD株14 d雏鸭的肝、胸腺和回肠进行分析.结果 显示:感染组回肠上调基因有78个,下调基因有31个;感染组胸腺上调基因有111个,下调基因有78个;感染组肝中上调基...     

猪流行性腹泻病毒感染Vero-E6细胞诱导凋亡机制的研究

为研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)诱导体外细胞凋亡的机理,本研究利用荧光定量PCR方法结合流式细胞术检测PEDV感染Vero-E6细胞后凋亡分子的变化情况.荧光定量PCR结果表明,抑制细胞凋亡因子Bcl-2在PEDV感染后基因转录水平迅速升高,在24 h达到峰值后被抑制;而促凋亡因子的蛋白水解酶caspase8和caspase3在PEDV感染后基因转录水平也随之提高,在48 h达到峰值.流式细胞术结果表明PEDV感染细胞48 h后促凋亡分子中的蛋白水解酶Caspases被活化.该研究结果揭示了PEDV感染细胞能够拮抗细胞存活信号通路,引起细胞凋亡,其中凋亡调节因子Bcl-2、caspase3和caspase8在细胞凋亡发生过程中起关键作用.     

BHV-1感染MDBK细胞lncRNA表达谱系及lncRNA与mRNA的关联性分析

为探究牛疱疹病毒1型(BHV-1)感染MDBK细胞的长链非编码RNA(lncRNA)表达谱系变化及lncRNA与m RNA的关联性,本研究将BHV-1感染MDBK细胞,以未感染BHV-1的MDBK细胞作为对照,于感染后采用Illumina HiSeqTM4000测序,测序数据基于stringtie进行转录本重构,得到7 935个lncRNA转录本,再用CPC和CNCI两个软件进行新转录本编码能力的预测,获得681个新产生的lncRNA转录本。利用DESeq2软件对差异表达的lncRNA进行分析,结果显示,实验组共获得839个差异表达的lncRNA转录本,其中表达上调转录本508个,表达下调转录本331个。利用RNA plex软件对反义lncRNA与mRNA进行关联性分析,得到lncRNAmRNA相互作用的靶基因对1 227个,其中差异表达的lncRNA-mRNA相互作用靶基因对42个;顺式作用lncRNA与m RNA关联分析,获得lncRNA-mRNA靶基因对3 793个,差异表达的lncRNA-mRNA靶基因对149个;反式作用lncRNA与mRNA关联分析,获得lncRNA-mRNA靶基因对268 409个。通过基因本体论(GO)注释和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路富集分析进一步对与lncRNA关联mRNA的功能和途径进行分析,结果显示,关联的mRNA在细胞进程、单组织代谢过程、代谢过程及生物学调节等过程显著富集。随机选取10个差异表达的lncRNA,利用qRT-PCR方法进行验证,结果显示,其表达变化趋势与高通量测序数据趋势一致。本研究为进一步研究lncRNA在病毒感染中的作用奠定了基础,同时为进一步阐述BHV-1的发病机制、致病机理提供参考。     

绵羊肺源大肠杆菌cyaA基因缺失对小鼠肺泡巨噬细胞感染的影响

为研究cyaA基因编码的腺苷酸环化酶(AC)在绵羊肺源大肠杆菌XJ10感染小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)中的作用，本研究以绵羊肺源大肠杆菌XJ10野毒株(XJ10WT)为对照，通过荧光定量PCR检测XJ10 cyaA基因缺失株(XJ10ΔcyaA)在感染MH-S细胞过程中与黏附侵袭相关的motA、crl、fimH、pap基因的m RNA转录水平，结果显示，与XJ10WT相比，XJ10ΔcyaA在感染MH-S细胞过程中与黏附侵袭相关的motA、crl、fimH、pap基因的m RNA转录水平在感染后0和6 h时均极显著降低(P<0.001),crl和pap基因的m RNA转录水平分别在2 h和12 h时均极显著上调(P<0.001)。进一步通过吉姆萨染色观察XJ10WT和XJ10ΔcyaA黏附MH-S细胞情况，采用细胞和细菌共培养方式分析XJ10ΔcyaA对MH-S细胞的黏附及侵袭能力，并通过CCK-8法分析细菌对MH-S细胞增殖的抑制情况。结果显示，XJ10ΔcyaA和XJ10WT在感染后3 h黏附MH-S细胞的活菌数量达峰值并持续至5 h，随后逐渐下降，在感染后1 h～5 ...     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染猪肺泡巨噬细胞的差异转录基因文库构建

为鉴定高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN4株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)后,细胞内转录发生差异的基因,本研究采用抑制性消减杂交技术,以HP-PRRSV HuN4株感染后48 h的PAM细胞mRNA为实验方(Tester),以未感染的PAM细胞为驱动方(Driver)进行消减杂交,得到了HP-PRRSV HuN4株感染后PAM内转录后发生上调的基因.反之,实验方与驱动方互换进行消减杂交,得到了HP-PRRSV HuN4株感染后PAM内转录后发生下调的基因.将2种杂交所得的差异转录基因经PCR扩增后分别克隆到T载体中并转化大肠杆菌感受态细胞,从而构建了正向(上调)和反向(下调)的差异cDNA文库.随机挑取文库中的多个克隆用PCR方法进行鉴定,结果表明差异文库中的cDNA具有较好的多样性.本研究为下一步的文库克隆的序列测定与差异基因的功能分析奠定了基础.