冬小麦春化期间玉米赤霉烯酮结合蛋白的研究

采用放射配体结合分析法结合生化技术分析屯冬小麦春化期间的玉米赤霉烯酮特异结合蛋白。表明在冬小麦幼苗中存在着ＺＥＮ的特异结合蛋白。ＺＢＰ对ＺＥＮ的结合具有可饱和的性质，Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析表明解离常数Ｋｄ＝１．９×１０＾－７ｍｏｌ．Ｌ＾－１结合位点数目ｎ＝６．２ｐｍｏｌ．ｍｇ＾－１可溶性蛋白。３０％饱和硫酸铵沉淀可使ＺＢＰ纯化３－４倍。对ＺＢＰ进行的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明＾３Ｈ－ＺＥＮ结合到两     

玉米赤霉烯酮的研究

自京郊分离的玉米赤霉菌(Fusarium roseum graminearum)BAU-z 8菌系的培养物(大米培养基)中提出了一种具有动物雌性激素作用的物质。根据其熔点、紫外和红外光谱等理化性质,被鉴定为玉米赤霉烯酮(zearalenone)。一公斤大米制备的培养基经接种发酵后,可提出1.4克的玉米赤霉烯酮结晶。本文报导了玉米赤霉菌的选育和培养,玉米赤霉烯酮的提取、纯化的方法,以及有关玉米赤霉烯酮的生物学效应的研究。试验表明,玉米赤霉烯酮可显著刺激小白鼠子宫增重和促进北京鸭生长。幼令小白鼠经用玉米赤霉烯酮油剂皮下注射,三天后剖检,其子宫鲜重可达对照者4—5倍,甚至7倍。北京鸭于填鸭开始时,每日口服含0.7mg 玉米赤霉烯酮胶囊,10天内其平均体重比对照者增约16.5%(P<0.01)未发现副作用。值得注意的是,我们发现已渡过春化的冬小麦生长锥中也存在类似玉米赤霉烯酮的物质,其生长锥的乙酸乙酯抽提液经薄板层析后,在硅胶薄板层析谱上有和玉米赤霉烯酮相同 R_f 值的兰萤光斑点,并可被 FeCl_3显紫红色。可是经含100ppm 玉米赤霉烯酮的 NaHCO_3水溶液浸种处理的冬小麦,于常温、长光照下分别播种于温室...     

自然越冬过程中冬小麦体内玉米赤霉烯酮含量的变化

用放射免疫分析法首次测定了冬小麦自然赵冬期间不同部位中玉米赤霉烯酮含量。发现越冬冬小麦的分蘖节中玉米赤霉烯酮含量呈双峰曲线，１０月底和１月初分别出现最高值。根尖中含量与分蘖节中的含量变化基本同步，但前期无明显峰值。在１月初根尖和分蘖节同时出现峰值时，根尖中的含量约为分蘖节中含量的１０倍。０２－１０以后，各部位含量的均降至较低水平。说明冬小麦体内玉米赤霉烯酮含量变化与春化过程密切相关。鉴于根尖和分蘖     

油菜的玉米赤霉烯酮类似物与春化作用

用硅胶薄层层析法(TLC)从春化的油莱茎尖中分离出玉米赤霉烯酮类似物,其在254nm 紫外灯下与玉米赤霉烯酮标准品具有相同的 Rf 值及亮兰色荧光斑点。该物质的动态变化与春化深度密切相关。未经春化的油莱茎尖中未见有此类物质存在。用玉米赤霉烯酮标准品溶液浸种处理油菜,有促进花芽分化的作用。     

自然越冬过程中冬小麦体内玉米赤霉烯酮含量的变化

用放射免疫分析法首次测定了冬小麦自然越冬期间不同部位中玉米赤霉烯酮含量。发现越冬冬小麦的分蘖节中玉米赤霉烯酮含量呈双峰曲线,10月底和1月初分别出现最高值。根尖中的含量与分蘖节中的含量变化基本同步,但前期无明显峰值。在1月初根尖和分蘖节同时出现峰值时,根尖中的含量约为分蘖节中含量的10倍。02-10以后,各部位含量的均降至较低水平。说明冬小麦体内玉米赤霉烯酮含量变化与春化过程密切相关。鉴于根尖和分蘖节含量远高出其他部位,推测分生组织是玉米赤霉烯酮生物合成的活跃部位。     

冬小麦和棉花开花结实过程中玉米赤霉烯酮含量的变化

用免疫学方法检测了冬小麦和棉花开花期间雄、雌蕊中玉米赤霉烯酮的含量。发现随雄、雌蕊的发育进程,其中的玉米赤霉烯酮含量逐渐增多,开花当时达高峰;冬小麦的种胚形成过程中玉米赤霉烯酮的含量比开花后稍有增长,籽粒在成熟时大量积累淀粉,此时玉米赤霉烯酮的含量下降到最低点。     

冬小麦幼苗中玉米赤霉烯酮的免疫组织学定位

应用免疫组化方法结合共聚焦激光扫描显微技术,研究了小麦春化幼苗的根尖和茎尖中玉米赤霉烯酮的存在及分布。结果表明,玉米赤霉烯酮在根中集中存在于根尖最前端约1mm长的区域,即根冠和分生组织区,至伸长区逐渐减少。在茎尖中,生长锥下方的分蘖节中的玉米赤霉烯酮含量很高,与生长锥相邻的叶原基内侧也有较高量的分布。顶端分生区的荧光反应较弱,侧芽(分蘖)原基呈负反应。     

玉米赤霉烯酮浸种对玉米幼苗抗冷性的影响

玉米赤霉烯酮浸种（２４ｈ）提高了玉米幼苗的抗寒性。在低温处理中，玉米赤霉烯酮浸种使玉米幼苗叶片的相对电导值较低，超氧化物歧化酶活性较高，游离脯氨酸含量升高，可溶蛋白含量较稳定。０．１ｍｇ／Ｌ浸种所产生的抗逆效果均优于０．０１ｍｇ／Ｌ。     

冬小麦不同发育时期内源玉米赤霉烯酮含量变化对抽穗的影响(简报)

本文报道通过连续检测冬小麦从萌动到拔节抽穗期间内源玉米赤霉烯酮含量变化时首次发现在光周期阶段亦出现玉米赤霉烯酮含量高峰,并直接影响以后的拔节抽穗。1 材料与方法1.1 春化处理用乙酸乙酯漂洗冬小麦(品种燕大1817)[Triticum aestivum L.cv.YanDa 1817]干种子以除去表面污染物,蒸馏水洗净后,浸泡于 HgCl_2液中消毒2min,无菌水洗净。种子分别在无菌水(pH5.8)和10ppm 马拉硫磷水溶液(pH5.8)中吸涨过夜。吸涨     

玉米赤霉烯酮浸种对玉米幼苗抗冷性的影响

玉米赤霉烯酮浸种(24 h)提高了玉米幼苗的抗寒性。在低温处理中,玉米赤霉烯酮浸种使玉米幼苗叶片的相对电导值较低,超氧化物歧化酶活性较高,游离脯氨酸含量升高,可溶蛋白含量较稳定。0.1 mg/L 浸种所产生的抗逆效果均优于0.01 mg/L。     

牛精子膜麦芽凝集素结合糖蛋白的分离与定位

牛精子膜用非离子去污剂 NP-40增溶,经固相凝集素亲和层析,初步分离了精子膜麦芽凝集素结合糖蛋白,经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染色显示出了四条蛋白质带,分子量分别为78,60.42和33 kD。用分离到的糖蛋白制备抗血清,对牛精子进行免疫细胞化学标记,结果顶体区显示为强阳性,与麦芽凝集素亲和细胞化学的染色一致。用抗血清处理精子再进行亲和细胞化学染色时,顶体区的麦芽凝集素结合糖残基多数被封闭,揭示麦芽凝集素结合糖残基是构成抗原决定簇的成分。     

水稻GS3蛋白及其与Gβ蛋白复合物的表达及结晶初筛

【目的】阐明GS3蛋白在水稻中的调控机制,为解析植物G蛋白的结构及完善G蛋白的调控网络打下基础。【方法】分别采用表达载体pGEX-6p-1和pET-28b-sumo诱导表达GS3蛋白N端结构域OSR和GS3蛋白C端结构域,再使用凝胶过滤柱Superdex 200/7510/300和阴例子交换层析柱Mono Q 5/50纯化表达蛋白,通过筛选优化晶体和X射线衍射的方法对GS3及GS3与Gβ共表达复合物的结构进行研究。【结果】将构建的重组蛋白OSR-pGEX-6p-1与GβN- pET-28b-sumo转入大肠杆菌BL21(DE3)中共表达,经GST beads亲和层析可获得2条条带,分别为OSR-GST(31 kD)和GβN-sumo(26 kD),再过Ni2+ beads亲和层析同样有2条条带,而SDS-PAGE凝胶电泳结果显示有4条条带,分别为GST(26 kD)、sumo(17 kD)、GβN(9 kD)和OSR(5 kD)。经阴例子交换层析柱Mono Q 5/50分离纯化可获得GβN(9 kD)和OSR(5 kD)二者的复合物。将纯化后的复合物浓缩至12 mg/mL进行晶体初筛,但未获得结晶。【结论】GS3和Gβ互作是通过GS3蛋白N端结构域OSR与Gβ N端结构域的结合而实现,其结果符合经典的G蛋白异源三聚体模型。     

稻瘟菌Rac1蛋白的原核表达与纯化

Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)是Rho族蛋白主要成员,在稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)的侵染致病过程中发挥重要作用.本研究目的是采用结构生物学的方法进一步探究Rac1结构与功能以及与其他蛋白互作的机制,进一步阐释其致病机制.试验以稻瘟菌的cDNA为模板,根据Ras相关的C3肉毒素底物1基因(MoRac1)序列设计特异性引物进行PCR扩增,克隆了MoRac1基因并构建原核表达载体pHAT2-Rac1,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-PAGE检测与Western blot分析表明,pHAT2-Rac1在BL21(DE3)中表达,大小为25kD.通过亲和层析、离子交换与分子筛对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白.该蛋白的表达与纯化对其结构功能的研究奠定了基础.     

枯草芽孢杆菌XM16分泌蛋白的抑菌作用及抗菌蛋白的分离纯化

以苹果腐烂病菌等22种植物病原真菌为供试菌,研究了枯草芽孢杆菌XM16无菌滤液的抑菌活性,结果表明,该无菌滤液对供试的植物病原菌具有强烈的抑制作用,抑菌谱非常广。无菌滤液经硫酸铵盐析,然后过Sephacryl S-100HR凝胶柱进一步分离纯化,获得2种不同组分的具强抑菌作用的抗菌蛋白。SDS-PAGE电泳显示,2种蛋白的分子量分别为21kD和30kD。     

人参水溶性蛋白的纯化工艺研究

为研究人参中几种水溶性蛋白的提取纯化工艺,采用中性缓冲液抽提和硫酸铵分级沉淀法提取人参总蛋白,应用超滤、亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析等方法进行分离、纯化,得到5种水溶性人参蛋白。经SDS-PAGE电泳和高效凝胶过滤色谱分析,其分子量分别为65.8,65.5,24.7,15.1,7.6 kD。研究结果表明,本试验所确定的人参水溶性蛋白纯化工艺路线简便、可行。     

猪肌生成抑制素C-端功能区蛋白的分离纯化

为研究猪肌生成抑制素(myostatin,MSTN)蛋白的功能及为制备此蛋白的单克隆抗体提供材料,将原核表达菌种MSTN-PGEX-4T-1-BL21进行融合表达,用亲和层析的方法对GST-MSTN和MSTN C-端成熟蛋白进行分离纯化。12%SDS-PAGE结果表明,纯化后的GST-MSTN在38 kD得到清晰目的带,薄层扫描分析显示,目的蛋白质纯度达86.1%。每升菌液提取约4.5 mg融合蛋白。15%SDS-PAGE结果表明,MSTN C-端成熟蛋白功能区在12 kD有明显条带出现。每升菌液提出约1.3 mg MSNT C-端成熟蛋白,占融合蛋白表达量的29%。     

柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体基因的构建及表达产物的生物学活性分析

 【目的】构建鼠源抗柑橘溃疡病菌二硫键稳定Fv抗体(dsFv)片段基因,原核表达并将其复性为具有免疫活性的dsFv抗体。【方法】采用PCR定点突变的方法构建dsFv重链(VH)及轻链可变区(VL)基因,分别将其连接入表达载体中,于E.coli BL21(DE3)中诱导表达,表达产物溶解后稀释入复性缓冲液中使其重折叠为dsFv抗体并纯化。SDS-PAGE及Western-blot分析表达及复性产物,BIAcore检测dsFv与Xac-LPS的亲和力,ELISA验证dsFv的特异性及稳定性。【结果】测序结果表明在VH的44位和VL的100位成功引入了半胱氨酸突变位点,实现了高效的原核表达,表达产物主要以包涵体的形式存在。SDS-PAGE分析显示VH和VL的大小为23 kD,并将其成功复性,复性后大小为46 kD。BIAcore分析表明dsFv对Xac-LPS保持了很高的亲和力,亲和常数(KD)达到3.40×10-10M。ELISA证明dsFv具有较高的抗原特异性并且热稳定性较scFv提高近20℃。【结论】成功表达并复性了dsFv抗体,为柑橘溃疡病菌的免疫诊断提供了高效优质的重组抗体。     

四种方法对鲢血清免疫球蛋白的纯化及分子量测定

采用mannan-binding protein(MBP)、TG及免疫亲和层析法和饱和硫酸铵沉淀法纯化鲢血清免疫球蛋白IgM,并比较了4种纯化方法的纯化效果.SDS-PAGE显示鲢血清免疫球蛋白的重链和轻链分子量分别为76.4 kD和27.2 kD,推算其总分子量约828.8kD     

飞蝗几丁质脱乙酰基酶的真核表达、亲和纯化及酶活性

【目的】体外真核表达飞蝗(Locusta migratoria)几丁质脱乙酰基酶1和2(chitin deacetylase 1and 2,LmCDA1和LmCDA2)并测定其酶活性,为进一步明确飞蝗LmCDA1和LmCDA2在几丁质降解途径中的生理功能及研发新型绿色环保杀虫剂提供依据。【方法】使用BLASTP和SMART软件在线预测LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的结构域;PCR克隆获得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全长序列,并分别构建p Fast Bac-LmCDAs重组质粒,转化获得Bacmid重组质粒后,转染至昆虫Sf9细胞进行目的蛋白的体外表达。采用Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱和阴离子(Q-Sepharose)交换层析柱对蛋白产物进行纯化。12%SDS-PAGE检测蛋白纯度后,采用分光光度法以对硝基乙酰苯胺为底物检测目的蛋白的酶活性,T检验法对LmCDA2a和LmCDA2b酶活力进行差异显著性分析。【结果】BLASTP和SMART软件预测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b均含有4个结构域:N-端信号肽(signal peptide)、几丁质结合域(chitin binding peritrophin-A,Ch BD)、A型低密度脂蛋白受体结构域(low-density lipoprotein receptor class A,LDLa)和脱乙酰基酶催化结构域(catalytic domain,CDA)。3个基因的几丁质结合域中均包含6个保守的半胱氨酸。LmCDA2a和LmCDA2b两个剪切子除在其第3个半胱氨酸和第4个半胱氨酸之间(67—84 aa)的氨基酸数目和组成及在第4和第6个半胱氨酸(84—106 aa)之间的序列存在差异外,其余部分完全一致。Western blot结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的蛋白分子量约为61 k D左右,与预测的蛋白分子量大小一致,表明Bacmid重组质粒在昆虫Sf9细胞中成功表达。采用12%SDS-PAGE胶电泳对各蛋白纯化组分进行检测,结果显示Ni-NTA亲和层析柱可将大部分杂蛋白洗脱,而Q-Sepharose交换层析柱可对蛋白进行更彻底地纯化。酶活检测结果显示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力分别为0.268、0.354、0.228 U·μL~(-1),并且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力存在显著差异。【结论】体外真核表达LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b蛋白并进行酶活测定后发现三者均具有几丁质脱乙酰基酶活力,且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力具有显著性差异,推测前期研究中沉默LmCDA2a和LmCDA2b后分别出现不同飞蝗表型的原因可能是由于它们酶活力存在显著性差异。     

间接竞争ELISA检测大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白

采用酸沉淀、亲和层析(ConA-Sepharose 4B)等手段,成功地分离纯化了大豆11S球蛋白和7S伴球蛋白,SDS-PAGE检测表明2种蛋白纯度分别达到95%和90%。将纯化的11S球蛋白和7S伴球蛋白分别免疫大白兔获得抗血清,并建立起间接竞争ELISA检测大豆豆粕及其深加工产品中11S和7S抗原蛋白含量的方法。