不同品系小鼠精子冷冻及冻融精子体外受精的研究

采用小鼠精子冷冻、冻融精子体外受精的方法,进行小鼠保种、引种、生物净化及品系标准化的可行性研究,并初步探究小鼠精子冷冻的影响因素。实验选用同一年龄5种不同品系小鼠分别进行精子冷冻、复苏,并比较各品系冷冻效果及冻融精子的体外受精(IVF)率。结果显示,冷冻后各品系小鼠精子复苏存活率约在15%～50%之间;冻融小鼠精子体外受精结果随遗传背景的不同差异显著,受精率分别为:KM小鼠68.4%、ICR小鼠30.3%、DBA/2J小鼠47.2%、C57BL/6J小鼠6.8%、BALB/cA小鼠25%。冻融精子IVF得到的胚胎可以耐受体外培养。     

小鼠超排后的取卵时间对体外受精率的影响

为了提高小鼠的体外受精率，对ICR和C57BL／6J小鼠进行超数排卵，并观察超排后12-18h内每间隔1h所取卵的态及其体外受精(IVF)率。结果显示，注射hCG后13h、14h所取卵的体外受精率最高；其中超排后14h取卵的异常卵比例最低。实验表明。ICR和C57BL／6J小鼠IVF的最佳取卵时间为超数排卵后14h。在这之前或之后。体外受精率均有不同程度的下降。因此，准确掌握超数排卵后的取卵时间是提高体外受精率的关键之一。     

绵羊不同直径卵泡卵母细胞特征及染色体形态分析

[目的]剥离不同直径卵泡卵母细胞,比较卵母细胞成熟前后的特征.[方法]测量绵羊卵巢表面卵泡直径后进行剥离,研究卵泡表面直径与卵泡实际直径之间的关系.按表面直径分组(1.0 mm以下、1.0～2.0mm、2.1～4.0 mm、4.1 mm以上),比较各分组间卵母细胞透明带厚度、卵丘复合体质量、卵母细胞成熟前后的染色体形态变化的差异.[结果]随着卵泡直径的增大,卵泡实际直径差异极显著(P＜0.01);各组间透明带厚度差异不显著(P＞0 05),但有降低的趋势;卵丘复合体质量分为A级、B级和C级,A级有增加的趋势,B级C级有降低的趋势;卵母细胞成熟后GV/GVBD比率有下降的趋势,MAT -I、NII有增加的趋势.[结论]随着卵泡直径增大,未成熟卵母细胞的质量提高,卵母细胞核成熟比例增加.     

体内外成熟与老化对小鼠卵激活刺激敏感性的影响

小鼠体外成熟卵母细胞组的乙醇激活率显著低于体内成熟卵母细胞组水平,在体外成熟过程中（培养液：ＴＣＭ－１９９＋ＦＣＳ（２０％）＋ｈＣＧ（２ＩＵ／ｍｌ））卵丘细胞的存在极显著地降低了成熟卵的乙醇激活率,卵激活率由５８．７％（裸卵）降为１３．８％（卵丘卵母细胞复合体）超排卵子随着卵龄的增加,卵子的乙醇激活率逐渐升高,而且体内卵的激活率高于体外老化同龄组的水平。     

冷冻对猪体外成熟卵母细胞透明带消化时间和皮质颗粒分布的影响

采集猪卵巢表面直径2～5 mm卵泡中卵丘-卵母细胞复合体,经体外成熟后进行玻璃化冷冻,观察其解冻后透明带消化所需时间和皮质颗粒分布状况,探讨冷冻对体外成熟卵母细胞透明带消化时间和皮质颗粒分布的影响.结果表明:卵母细胞冷冻-解冻后,透明带消化时间显著缩短,皮质颗粒仍呈线状排列于细胞质膜下.     

金黄地鼠超排后未排卵泡卵母细胞的成熟度和受精能力的观察

为了证实金黄地鼠超排后卵巢中未排卵卵泡卵母细胞的成熟程度和受精能力,用促性腺激素PMSG和HCG进行4次超排处理,其中选择12只超排效率低下的金黄地鼠,回收输卵管和卵巢卵母细胞,观察卵母细胞的成熟程度、体外培养成熟能力及体外受精能力。结果显示,输卵管中回收超排卵数平均为22.6±7.8枚/只,从超排后卵巢中回收卵丘扩展卵数平均为23.2±3.9枚/只,卵丘未扩展卵数平均为13.4±3.7枚/只。卵丘扩展卵经0.1%透明质酸酶消化,裸卵占86.1%,带放射冠卵占11.5±2.4%。裸卵中排出极体的成熟卵占卵丘扩展卵的80.4±2.3%,无极体裸卵占5.7±0.8%。经体外培养2h,无极体裸卵的成熟率达100%,带放射冠卵的成熟率仅为6.3±9.4%,而卵丘未扩展卵未见有成熟卵。人精子穿透试验显示,卵巢回收成熟卵的受精率44.1±6.0%,同超排卵的受精率45.4±4.7%比较,无显著差异(P<0.05)。从低超排率的金黄地鼠卵巢中可获取与超排卵数相近的成熟卵母细胞,且具有可利用于去透明带金黄地鼠卵子穿透实验(HOP)及相关发育生物学研究的潜能。     

山羊不同来源卵母细胞体外受精的研究

从屠宰场搜集的小母羊(3-6月)卵巢卵母细胞(A组)、成年母羊卵巢卵母细胞(B组)及成年母羊超排后活体所取母细胞(C组)进行了体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)及受精后早期胚胎体外培养(IVC)的比较研究.研究发现:(1)A组平均每个卵巢获取的卵母细胞数极显著高于B组(10.6±2.6 vs 2.5±1.5,P＜0.01),与C组相比差异不显著(10.6±2.6 vs11.0±2.0,P＞0.05),但获取的优良可用卵丘卵母细胞复合体(COCS)数A组极显著高于B组(4.5±2.5 vs 1.6±1.5,P＜0.01),却显著低于C组(4.5±2.5 vs 8.5±2.5,P＜0.05);(2)A,B,C组获取的可用卵母细胞在M 199±10%EGS±20 ng/mL EGF培养液中培养后的体外培养成熟率分别为63.8%,65%和68.3%,差异均不显著(P＞0.05);(3)3种来源途径的可用卵母细胞体外成熟后用mDM液获能受精处理并培养于TCM 199-卵丘颗粒细胞饲养层(cc)共培养体系中的卵裂率(37.5%,35.0%和40%)无显著差异;12枚活体来源卵母细胞生产的2-8细胞胚移植给4只同期化受体,其中1只母羊怀孕并产下2只"试管"羔羊(16.7%).研究表明:初情期前小母羊比成年母羊可提供更多可用于体外受精的卵母细胞,进而提高雌性动物的早期繁殖潜能;对遗传性能较好的品种或个体可通过超数排卵处理后利用合适的采卵设备进行活体采卵,以进行有针对性的体外受精及相关胚胎工程研究,提高体外受精和胚胎生产效率.     

猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟关系的研究

 以猪卵丘卵母细胞复合体（COC）为实验对象研究了猪卵丘扩展与卵母细胞核成熟之间的关系,结果表明,（1）全程培养均暴露于激素环境中不利于卵丘的扩展;（2）卵丘扩展良好与卵丘扩展不好的卵母细胞核成熟比例无统计学差异（P>005）;（3）去除卵母细胞的COC培养后,卵丘细胞仍然能发生扩展;（4）培养24h后去掉COC的卵丘细胞不仅不影响卵母细胞的核成熟,而且极体完整的卵母细胞数目还显著增多（P<0.01）;但去颗粒细胞组卵母细胞的质膜不如对照组光滑;（5）带有壁颗粒细胞（mural granulosa cell,MGC）的COC扩展情况明显优于不带MGC的,其中含有极体的成熟卵数也显著高于后者（P<0.01）。     

血管内皮生长因子对水牛卵母细胞体外受精的影响

[目的]探讨血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）对水牛卵母细胞体外受精的影响,为优化水牛卵母细胞体外培养体系及提高水牛体外胚胎生产效率奠定基础.[方法]以带有3层以上卵丘细胞的卵丘—卵母细胞复合体（COCs）为材料,分别在水牛卵母细胞体外成熟液和受精液中添加重组人VEGF165,研究VEGF对水牛卵母细胞体外成熟、体外受精和早期胚胎发育的影响.[结果]在成熟液中添加10ng/mLVEGF,水牛卵母细胞的第一极体排出率由57.3％提高到72.3％,差异显著（P＜0.05,下同）;体外受精后的受精卵分裂率由41.0％显著提高到53.3％.在受精液中添加10 ng/mL VEGF,水牛体外受精的受精卵分裂率由41.9％提高到63.0％,差异极显著（P＜0.01,下同）,囊胚形成率由17.0％显著提高到32.6％.在成熟液和受精液中同时添加10ng/mLVEGF,水牛体外受精的受精卵分裂率和囊胚形成率由43.4％和19.0％极显著提高到64.3％和27.2％,囊胚细胞数由89.5显著提高到106.8.[结论]VEGF能促进水牛卵母细胞体外成熟、体外受精及早期胚胎的发育,因此可将VEGF用于水牛卵母细胞体外受精体系的优化,提高水牛体外胚胎生产效率.     

牛卵泡卵母细胞冷冻保存的研究

研究了用 3种不同方法 (A法 :程序冷冻 ;B法 :超快速冷冻 ;C法 :玻璃化冷冻 )冷冻保存的牛 GV期卵母细胞的发育潜力。结果表明 ,解冻后 ,C组卵母细胞形态正常率显著高于 A、B组 ;3种方法冷冻的卵母细胞成熟培养后 ,平均卵丘扩展率为 6 5 % ,其中 C组最高 (6 9% ) ;3组冷冻卵母细胞的体外成熟率、体外受精率和卵裂率分别为 14 .3% ,17.1% ,2 1.6 % ;11.1% ,12 .6 % ,15 .1%和 5 .6 % ,9.1% ,11.1%。结果还表明 :玻璃化冷冻的卵母细胞损伤较轻。     

利用淘汰奶牛卵巢生产体外受精胚胎

以淘汰奶牛卵巢为材料,研究了卵巢采集方法、卵丘细胞和颗粒细胞对卵母细胞体外受精后发育的影响。结果表明奶牛屠宰后取其卵巢,用剖解法(平均9.1枚/卵巢),可比抽吸法(平均6.5枚/卵巢)得到更多的可用卵母细胞(p<0.01)。周围无卵丘细胞包围的裸露卵母细胞经成熟培养和体外受精后,卵裂率为41.8%,但仅27.5%停留在8～16-细胞期,最高发育阶段为16-细胞期;有3层以上卵丘细胞紧密包围的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-OocyteComplex,COC)经成熟培养和体外受精后,卵裂率(64.5%VS54.7%,p<0.01)和囊胚发育率(34.0%VS18.2%,p<0.01)显著高于卵丘细胞包被不全的卵母细胞。在培养液中添加颗粒细胞虽然没有促进牛受精卵的卵裂率,但提高了囊胚率及其细胞数(p<0.01).     

C57BL/6和A/J两品系小鼠脾脏消减cDNA文库的构建及差异基因分析

【目的】检测健康C57BL/6和A/J小鼠常规免疫指标,构建脾脏消减cDNA文库并筛选差异表达基因,以探讨两品系小鼠对猪链球菌抗病性差异的分子机制。【方法】利用ELISA法检测血清常规免疫指标,抑制性消减杂交（suppression subtraction hybridization,SSH）技术构建8周龄小鼠脾脏差异表达基因的cDNA文库。【结果】试验结果表明,A/J品系小鼠血清中IgA水平明显高于C57BL/6品系小鼠（P＜0.05）,而血清IgG和IFN水平在两品系小鼠间均无显著差异。对筛选的149个阳性克隆进行测序,去除冗余的cDNA序列载体并聚类拼接后获得56条差异表达序列标签（ESTs）。利用Genebank的BLAST分析核酸和蛋白质同源性比较,26个不同的基因或ESTs具有高度的同源性,2条ESTs未找到同源序列。【结论】筛选到很多EST与信号转导、细胞凋亡及免疫等重要功能基因高度同源,为研究猪链球菌的致病机理和防治提供了实验依据。     

体外培养前黄牛卵母细胞的分类、形态结构及成熟能力的研究

 自1-5mm卵泡中抽取的卵母细胞在实体显微镜下，按形态可分为四类：⑴外观正常的；⑵少丘带斑的；⑶扩展后退化的；⑷少丘均质的。通过中性红/台盼蓝染色，二乙酰荧光素染色，电镜观察和体外成熟实验等方法系统地研究了这四类卵母细胞的形态和发育能力，为牛卵母细胞体外成熟和体外受精提供了基础数据。研究结果说明，第一类卵母细胞处于最佳生理状态，体外成熟率最高；其它三类卵母细胞生理状态欠佳，成熟率很低。     

山羊不同卵母细胞体外成熟研究

实验对山羊不同分级卵母细胞体外成熟进行了微滴法培养,得出A、B、C三级卵母细胞成熟后,第一极体排出率分别为71 8%;43 3%和10 9%(P<0 01)。结果表明,卵母细胞胞质均一致密,外围至少有3层以上的颗粒细胞包裹,而且包裹致密的卵母细胞能用来生产体外胚胎。     

不同化学激活方法及卵丘细胞层数对牛体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

为探索适宜的牛体外成熟卵母细胞孤雌激活方式,提高核移植效率及研究胚胎孤雌发育。研究比较了不同浓度的乙醇( EH)、离子霉素(ionomycin)、钙离子载体A23187与蛋白激酶抑制剂6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、细胞松驰素(cytochalasin B, CCB)对牛卵母细胞激活发育的影响,并在相同条件下,比较了不同卵丘细胞层数对卵母细胞激活后胚胎发育能力的影响。结果表明: (1) 5 μmol·L-1 Ionomycin,10 μmol·L-1 A23187,7% EH分别联合2 mmol·L-1 6-DMAP,CCB均可以有效地激活牛孤雌胚,其中以Ionomycin＋6-DMAP+CCB组囊胚发育率极显著高于其他各组(P<0.01),并且激活液中CCB的存在对牛孤雌胚胎的发育有利;(2) 卵母细胞包被的卵丘细胞层数不同对卵母细胞成熟激活有显著的影响,卵丘细胞层数3～5层和多于6层的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)孤雌激活的分裂率和囊胚率分别为69.09%,31.58%和75.14%,38.85%,这2组之间差异不显著(P>0.05), 但其显著高于1～2层组与混合组(P< 0.05), 因此,这2组细胞是最佳的试验研究材料。     

卵丘细胞对牛体外受精效果的影响

[目的]探索卵丘细胞对牛体外成熟卵母细胞体外受精效果的影响.[方法]试验采用体外成熟后卵母细胞脱除卵丘细胞组、部分脱除组及不脱除组.[结果]与卵丘细胞共培养时,部分脱除组的卵裂率及囊胚率(74.4％±4.1、53.7％±5.1)好于不脱除组(72.7％ ±5.1、52.4％±3.5),差异不显著(P＞0.05)、两者都好于全部脱除组(39.6％±4.5、l8.8％±4.6),差异显著(P＜0.05),且都显著优于对照组.卵丘细胞与褪黑素两者联合使用时,效果最佳.部分脱除组的卵裂率及囊胚率(79.8％±3.7、56.5％±5.1)好于不脱除组(78.2％±2.6、55.8％±4.6),差异不显著,两者都好于完全脱除组(48.3％±5.5、22.7％±4.3)及对照组,且差异显著(P＜0.05).[结论]该研究对奶牛和肉牛的生产提供了技术支持.     

Repression of colony formation reversed by antiserum to mouse thymocytes

Marrow cells derived from C57BL/6 mice form many fewer splenic colonies in irradiated C57BL/6 x C3H F1 hybrid recipients than in irradiated C57BL/6 recipients (repression of colony formation). This effect is reversed by treatment of the hybrid recipients with active antiserum to mouse thymocytes. The repression phenomenon cannot readily be explained in immunological terms; hence the effect of the antilymphocyte serum on this phenomenon may not result from immunosuppression in the usual sense.     

Granulosa cell ligand NPPC and its receptor NPR2 maintain meiotic arrest in mouse oocytes

Granulosa cells of mammalian Graafian follicles maintain oocytes in meiotic arrest, which prevents their precocious maturation. We show that mouse mural granulosa cells, which line the follicle wall, express natriuretic peptide precursor type C (Nppc) messenger RNA (mRNA), whereas cumulus cells surrounding oocytes express mRNA of the NPPC receptor NPR2, a guanylyl cyclase. NPPC increased cGMP levels in cumulus cells and oocytes and inhibited meiotic resumption in vitro. Meiotic arrest was not sustained in most Graafian follicles of Nppc or Npr2 mutant mice, and meiosis resumed precociously. Oocyte-derived paracrine factors promoted cumulus cell expression of Npr2 mRNA. Therefore, the granulosa cell ligand NPPC and its receptor NPR2 in cumulus cells prevent precocious meiotic maturation, which is critical for maturation and ovulation synchrony and for normal female fertility.     

A cytoplasmically transmitted, diet-dependent difference in response to the teratogenic effects of 6-aminonicotinamide

The frequency of congenital cleft palate produced by maternal treatment with 6-aminonicotinamide during pregnancy is lower in the C57BL/6J than in the A/J inbred mouse strain. In the C57BL/6J strain the frequency is lower when the mothers are maintained on Purina Lab Chow than when they are on Breeder Chow. A/J females do not show this effect of diet. There is a matroclinous reciprocal cross difference in frequency of induced cleft palate which persists in the back-cross when the F(1) mothers are maintained on Lab Chow but not on Breeder Chow.