荧光素酶标记无致病力青枯雷尔氏菌的生物学和定殖特性

为示踪青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum无致病力菌株FJAT1458在番茄植株及根际土壤中的定殖特性,采用电击法对菌株FJAT1458进行荧光素酶(luciferase,LUC)基因标记,并于室内采用生测法测定标记菌株的生物学特性、遗传稳定性、致病力及在番茄植株和根际土壤中的定殖能力。结果表明,成功将luc基因整合至无致病力菌株FJAT1458染色体上,标记菌株FJAT1458-LUC发出强烈的荧光,且PCR扩增出1 612 bp的luc基因片段;与野生型菌株FJAT1458相比,标记菌株FJAT1458-LUC的生长明显滞后,培养8h之后标记菌株FJAT1458-LUC的OD_600nm值均小于野生型菌株FJAT1458;且标记菌株FJAT1458-LUC连续传代20次后菌体浓度显著增加,发光菌体比例显著降低,LUC活性和luc基因表达量均随着传代数增加而显著降低;标记前、后菌株FJAT1458的弱化指数分别为0.90和0.89,且接种番茄植株30 d均未引起植株发病。标记菌株FJAT1458-LUC能在番茄根际土壤、根及茎中定殖,定殖数量呈...     

青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株的构建及其防效评价模型分析

 利用青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)无致病力菌株防治番茄青枯病具有很好的应用潜力。作者通过分离筛选自然弱毒株、⁶⁰Co辐射诱变和EZ-Tn5插入诱变,分别获得3、12和40株青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株。经盆栽番茄苗致病性检测,15 d后均未发病,证实均为无致病力青枯雷尔氏菌。进一步对番茄青枯病的防治试验表明,从番茄青枯病发病田块分离的无致病力突变菌株FJAT1458的防治效果最好,防效达100%。该菌株能定殖番茄植株根系土壤、根部和茎部,定殖数量均表现为“先增后减”的趋势,并且接种浓度越大、苗龄越小,定殖数量越大。从构建的防效模型可以看出,不同接种浓度条件下,植株发病率随时间变化符合的回归方程不同,相关系数R值也不同,接种浓度越大,R值越小。本研究获得的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株FJAT1458对番茄青枯病具有很好的防病效果。     

青枯雷尔氏菌无致病力hrpB突变菌株的纯化分离及其异质性研究

获得纯度高的青枯雷尔氏菌无致病力菌株,是研发青枯病植物疫苗和防治青枯病害的一种新途径。作者以青枯雷尔氏菌强致病力菌株FJAT-91为出发菌株,通过对hrpB基因敲除,获得无致病力突变菌株FJAT-91ΔhrpB。高效离子交换色谱分离结果表明:FJAT-91和FJAT-91ΔhrpB色谱峰型不同,主要表现在峰的保留时间上,FJAT-91只有单一色谱峰,保留时间为6 min;FJAT-91ΔhrpB有P_1和P_2 2个色谱峰,保留时间分别为0.6 min和4.5 min。利用高效离子交换色谱对FJAT-91ΔhrpB进行纯化,获得只有P_1峰的高纯度菌株FJAT-91ΔhrpB-P。FJAT-91ΔhrpB和FJAT-91ΔhrpB-P与其出发菌株FJAT-91的菌落和菌体形态差异明显。致病力测定结果表明:FJAT-91接种4 d番茄植株开始发病,10 d发病率达100%;FJAT-91ΔhrpB和FJAT-91ΔhrpB-P接种20 d均未发病。防效试验结果表明:纯化后的菌株FJAT-91ΔhrpB-P对番茄青枯病的防效(81.64%)比未纯化FJAT-91ΔhrpB防效(61.04%)提高了33.75%。本研究获得一株高纯度的青枯雷尔氏菌无致病力突变菌株FJAT-91ΔhrpB-P具有良好的生防潜力。     

生防菌对青枯雷尔氏菌强致病力和无致病力菌株生长竞争的影响

采用共培养法研究了不同温度下青枯雷尔氏菌强致病力菌株F-01-V与无致病力菌株F-01-A之间的生长竞争、生防菌ANTI-8098A胞外物质对F-01-V和F-01-A生长的影响以及对F-01-V与F-01-A之间生长竞争关系的影响.结果表明,在15、20、25、30和35℃,菌株F-01-V、F-01-A单独静置培养48 h后,F-01-V活菌数的增长率最高可达123.7%,F-01-A的活菌数下降,最大降幅为60.7%;当F-01-V与F-01-A等量混合培养时,F-01-V能继续增长,但48 h后的增长率不如单独培养时的高,F-01-A的生长受到促进,使得这两个菌株的活菌数之比（F-01-V/F-01-A）与混合前的比值（0.97）相近;生防菌胞外物质对F-01-V有较强的抑制作用,抑制率与温度呈正相关,对F-01-A具有促进生长的作用,促长率也与温度呈正相关;生防菌胞外物质对F-01-V的抑制作用和对F-01-A的促进生长作用,导致在生防菌液、F-01-V与F-01-A共存的环境中,F-01-V与F-01-A之间的生长竞争向着有利于F-01-A的方向发展,使F-01-A成为优势菌株,特别是在30℃以上的温度下,F-01-V/F-01-A小于0.01,F-01-A的优势极为明显.     

无致病力青枯菌FJAT-a RS01的固态发酵及对茄果类蔬菜青枯病的防治效果

利用无致病力青枯菌研发植物疫苗防治青枯病是植物病害防治研究中的新途径。无致病力青枯菌FJAT-aRS01具有防效高和稳定遗传等特性。为了进一步开发利用该菌株,本研究以巨菌草渣为其主要发酵培养基,通过正交试验优化培养基配方和发酵条件,固态发酵FJAT-a RS01,并进行质量检测。结果表明,优化后菌株FJAT-aRS01固态发酵培养基配方为巨菌草渣36.36%、玉米粉27.27%、米糠27.27%和稻壳9.09%;发酵条件为接种量15%(10⁸ CFU/mL),料水质量比为1:0.8,装袋量为150 g/袋,发酵时间为48 h;在该发酵条件下,FJAT-aRS01的固态发酵物活菌数可达到1.80×10⁹ CFU/g,其营养成分含量超过微生物肥料的国家标准(NY/T 798-2015);FJAT-a RS01固态发酵物浸提液的50倍稀释液能促进番茄种子萌发,其100倍稀释液能促进辣椒和茄子种子萌发;在栽培基质中添加质量百分比≤15%的FJAT-aRS01固态发酵物能促进植株生长,添加质量百分比25%的FJAT-a RS01固态发酵物对于番茄、辣椒...     

青枯雷尔氏菌噬菌体的研究与应用进展

青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的烟草等茄科作物青枯病,是一种世界性重大细菌病害,危害严重且防治困难。利用“噬菌体疗法”防治细菌性病害是近年来生物防治研究的热点。由于近年来抗药性和超级细菌的出现,噬菌体作为病害控制的新方法重新受到重视。综述了噬菌体的发现历程、青枯雷尔氏菌噬菌体发现与分类、挖掘利用,并讨论了噬菌体应用中的问题及发展方向。     

青枯菌无致病力菌株FJAT-1458与强致病力株FJAT-91的竞争生长作用

为了明确青枯菌无致病力菌株FJAT-1458的生防竞争机制,本研究采用体外共培养方法研究了碳源、氮源和培养时间对菌株FJAT-1458和青枯菌强致病力菌株FJAT-91竞争生长的影响;同时,研究了菌株FJAT-1458和FJAT-91在番茄植株体内的竞争生长。结果表明,碳源含量低于20%时,菌株FJAT-1458不能生长,而菌株FJAT-91可生长;无氮源条件下,FJAT-1458和FJAT-91均不能生长;碳源和氮源含量达100%时,FJAT-1458的菌体浓度（2.16×10⁹ cfu/mL）显著低于FJAT-91的菌体浓度（3.24×10⁹ cfu/mL）。混合培养24 h前,FJAT-1458生长量大于FJAT-91,24 h后则相反。在单独接种或混合接种5 d后,FJAT-1458和FJAT-91均在番茄植株体内出现最大定殖量,随后迅速减少;FJAT-91在单独接种15 d时,定殖数量为0;两种菌株单独接种的定殖数量均大于混合接种（接种15 d除外）。先接种FJAT-1458,3 d后接种FJAT-91对番茄青枯病的防效（100%）显著高于同时接种FJAT-1458和FJAT-91（74.67%）。本研究表明,在体外无致病力菌株FJAT-1458对碳源和氮源的营养竞争能力弱于强致病力菌株FJAT-91;在体内无致病力菌株FJAT-1458会抑制强致病力菌株FJAT-91的生长;因此,FJAT-1458的生防竞争机制中,营养竞争起非主导作用,而位点竞争可能是主导因素。     

无致病力青枯菌株对番茄青枯病的防治效果

用紫外诱变法获得的青枯无致病力菌株ATm0 4 4和Asp0 6 1对致病菌没有直接的抑制作用 ;处理番茄后对青枯病产生抗性 ;两菌株可在番茄体内定殖并繁殖 ,移栽浸根是最佳的处理方法。盆栽试验结果表明 ,番茄经ATm0 4 4和Asp0 6 1处理后 ,分别较对照推迟 9和 7d发病 ,2 0d后的防效达 56 .7%和 53.4 %。田间小区试验结果表明 ,经ATm0 4 4和Asp0 6 1菌悬液浸根处理番茄 ,1 5d后对青枯病的防治效果分别为 53.8%和 37.7%。     

生防菌ANTI-8098A对青枯雷尔氏菌致病力的影响

经生防菌蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus菌株ANTI-8098A处理后,番茄青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum强致病力菌株弱化为无致病力菌株,弱化指数由0．40转变为0．86,回接番茄苗发病率由100．0％转变为0。同时,生防菌处理后的无致病力菌株在培养24h以前菌体生长能力显著增加,其中在12h时生长速率增长最快,达到了5．6倍;紫外-可见光吸收值明显下降,OD450nm由0．5740降为0．2644;高效液相离子交换色谱的表征由前峰〈后峰转变为前峰〉后峰;对生防菌异源蛋白的吸附由2种蛋白质（97．4kD和116．0kD）转变为1种蛋白质（97．4kD）。结果表明：ANTI-8098A对青枯雷尔氏菌具有致弱作用,并使其生理生化特性产生显著的变化。     

青枯雷尔氏菌温度相关致病基因yqhE功能研究

不同温度下青枯雷尔氏菌表达谱PPI网络分析发现,yqhE可能是青枯雷尔氏菌新的温度相关致病基因。克隆青枯雷尔氏菌CBM613的yqh E基因,结果发现该基因长度为831 bp,共编码276个氨基酸。基因敲除结果显示,28℃培养的yqhE突变株较野生型菌株致病力降低,病程延长,但并未彻底丧失致病力。20℃和28℃培养的yqh E突变株维生素C的生物合成皆被抑制;与28℃相比,20℃培养下野生型菌株维生素C的合成能力降低。突变株在20℃和28℃培养下甲基乙二醛（MG）和丙二醛（MDA）明显积累,其中20℃积累更多;20℃培养的野生型菌株MG和MDA比28℃积累更多。维生素C的生物合成被抑制导致青枯雷尔氏菌自由基清除能力减弱与氧化应激反应增强,MG和MDA积累产生细胞毒性,上述结果可能与28℃培养的突变株致病力减弱,20℃培养的野生型菌株致病力丧失有关。综上结果表明yqhE是青枯雷尔氏菌温度相关致病基因。     

烟草青枯病菌在烟草根际的定殖及最适发病条件

为明确烟草青枯病菌在根际的定殖情况和最适发病条件,采用绿色荧光蛋白(gfp)标记病原菌,监测其在根际的定殖位置及数量动态变化,并运用荧光定量PCR法测定病原菌在根际和土体土壤的数量,通过响应曲面法探索病原菌致病的临界浓度、发病最适温湿度以及对烟株青枯病发病的影响。结果表明,从贵州省烟田土壤中分离到烟草青枯病病原菌茄科劳尔氏菌Ralstonia solanacearum,gfp-标记的茄科尔劳尔氏菌主要定殖于根尖和根毛区,少数菌落定殖于初生根的延长区,定殖部分表现为非连续性;第10、15、20天根际土壤的茄科劳尔氏菌数量均显著高于土体土壤数量,分别是土体土壤中的1.15、1.33、1.42倍;当土壤中每克土病原菌数量为106.82 CFU、温度为30.55℃、相对湿度为81.42%以上时,烟草青枯病的病情指数最高为91.13,烟株易发生青枯病。表明茄科尔劳尔氏菌在根际土壤中比土体土壤更易定殖,烟草青枯病发病条件主要取决于病原菌浓度、温度以及相对湿度3项指标。     

烟草青枯病菌与其拮抗菌解淀粉芽胞杆菌的代谢表型差异分析

为探究解淀粉芽胞杆菌X60作为烟草青枯病生防菌剂的潜力,采用Biolog代谢表型技术比较了2种细菌的不同代谢表型。结果表明,烟草青枯病菌和解淀粉芽胞杆菌分别能代谢19%、41%的碳源,43%、77%的氮源,95%、86%的磷源以及100%、69%的硫源,分别有94、91种生物合成途径,49、95种渗透压表型以及19、94种pH代谢表型;解淀粉芽胞杆菌比烟草青枯病菌代谢显著的碳源有L-果胶糖、D-甘露糖等34种,氮源有腺苷、胞苷等29种;烟草青枯病菌比解淀粉芽胞杆菌代谢显著的碳源有D-糖二酸、半乳糖醇等9种,氮源有缩二脲、葡萄糖苷酸等11种;解淀粉芽胞杆菌的渗透压和pH环境适应力比烟草青枯病菌强;解淀粉芽胞杆菌具有脱羧酶和脱胺酶的活性。研究表明,2种细菌的代谢表型间存在较大差异,解淀粉芽胞杆菌的碳源、氮源、渗透压及pH代谢表型较烟草青枯病菌的丰富,烟草青枯病菌的磷源、硫源和生物合成途径代谢表型较解淀粉芽胞杆菌的丰富。     

植物疫苗鄂鲁冷特对番茄青枯病的田间防治效果

为了明确植物疫苗鄂鲁冷特对番茄育苗及其田间青枯病防治效果的影响,在番茄育苗基质中添加植物疫苗,测定处理后种苗株高、根系长度及出苗率;在田间种植共设疫苗袋装、沟施、浇灌及生防菌剂、化学农药和清水对照6个处理,对根系土壤的养分含量、植株的生物学性状及青枯病发病率进行研究。结果表明,植物疫苗处理分别能使番茄植株株高、根系长度和出苗率提高13.71%、68.20%和56.66%;疫苗袋装和沟施处理的番茄根系土壤有机质、全氮、全磷、全钾和交换性钙含量均显著高于其它处理;疫苗袋装、沟施和浇灌均能显著提高番茄植株的株高、花数和产量,其中疫苗袋装处理效果最好,番茄产量最高为99.55 t/hm~2,对不同生育期的平均防治效果最高为93.47%。表明植物疫苗鄂鲁冷特的应用能育出壮苗,降低青枯发病率,提高产量。     

不同渗透压及pH环境对烟草青枯病菌致病力的影响

为探究不同渗透压和pH环境对烟草青枯病菌Ralstonia solanacearum致病力的影响,用Biolog PM 9～10代谢板中96种渗透压和96种pH环境培养烟草青枯病菌,并采用穿刺法接种于烟草离体叶片,测定不同环境下烟草青枯病菌对烟草的致病情况。结果表明,烟草青枯病菌可致病的渗透压范围包括1%～2%氯化钠、2%～3%硫酸钠、5%～20%乙二醇、1%甲酸钠、2%尿素、1%乳酸钠、20～100 mmol/L磷酸钠、10～100 mmol/L硫酸铵、10～100 mmol/L硝酸钠及10～20 mmol/L亚硝酸钠。可致病pH范围为5.0～8.0;当pH 4.5时,烟草青枯病菌在分别与L-正缬氨酸和5-羟色氨酸共培养时均可致病,与其余33种氨基酸共培养时则均不能致病;当pH 9.5时,烟草青枯病菌在与所有35种供试氨基酸共培养时均不能致病;烟草青枯病菌在葡萄糖苷、辛酸盐、半乳糖苷等10种化合物培养下均可致病。表明渗透压和pH环境会严重影响烟草青枯病菌的生长和致病力。     

Silicon-induced basal resistance in tomato against Ralstonia solanacearum is related to modification of pectic cell wall polysaccharide structure

Bacterial wilt incidence was reduced by 38.1% and 100% in silicon-treated plants of the moderately resistant tomato genotype King Kong 2 and the resistant genotype Hawaii 7998 grown in peat substrate. At 5 days post inoculation the bacterial population was significantly reduced in stems and roots of genotype Hawaii 7998, and in stems of King Kong 2 in silicon-treated plants compared to non-treated plants, indicating a silicon-induced resistance, since silicon accumulated in roots, but not in stems, while a tolerance effect was observed in the susceptible genotype L390. Characterization of possible molecular mechanisms involved in silicon-mediated resistance by immuno-histochemical analysis of stem cell walls indicated silicon-induced changes in the pectic polysaccharide structure. After infection homogalacturonan with non-blockwise degradation of methyl-esters was increased in vessel walls in non-silicon-treated plants, but not in silicon-treated plants, possibly indicating the action of pathogen pectinmethylesterase. Also the staining of vessel walls for arabinogalactan-protein in infected, non-silicon-treated plants was not observed in silicon-treated plants. In inoculated, silicon-treated plants, staining for arabinan side chains of rhamnogalacturonan I (RG I) was increased in some vessel walls, and fluorescence of antibodies for galactan side chains of RG I overall increased in the xylem parenchyma compared to non-silicon-amended plants. These observations suggest an induced basal resistance on cell wall level after silicon treatment, while the yellow or brown autofluorescence occurring in inoculated, non-silicon-treated plants disappeared.     

我国长江流域和南方地区花生青枯菌遗传多样性分析

为明确不同青枯菌的遗传多样性和其在花生植株上的致病力差异,采用国际上新的青枯菌演化型分类模式,对从我国长江流域和南方地区9个花生种植区分离的95株花生青枯菌Ralstonia solanacearum菌株进行遗传多样性分析,基于内源葡聚糖酶基因egl对青枯菌进行系统发育研究,并对供试青枯菌的致病力进行测定。结果表明,所有95株菌株均属于青枯菌演化型I型,即亚洲分支类型。在序列变种分类上,所检测的9个花生种植区中有8个种植区的花生青枯菌菌株属于序列变种14,仅有1个种植区(广西壮族自治区贺州市)的花生青枯菌菌株属于序列变种48,表明我国长江流域和南方地区花生青枯菌群体遗传多样性水平较低。青枯菌致病力测定结果表明,来自赣州市的菌株GZ-1、贺州市的菌株HZ-2和宜昌市的菌株YC接种到花生植株14 d后,花生的病情指数分别为43.8、75.0和87.5,而来自其它6个花生种植区的菌株接种花生后,其病情指数均为100.0,表明菌株GZ-1和HZ-2的致病力较弱,而其它7个花生种植区代表性菌株的致病力均较强。     

三重PCR检测茄子青枯病菌、黄萎病菌和白绢病菌

为快速、准确对田间茄子发病植株和土壤中3种土传病害的病原菌青枯病菌Ralstonia solanacearum、黄萎病菌Verticillium dahliae和白绢病菌Sclerotium rolfsii进行检测,筛选这3种病菌的特异性引物,建立这3种病菌的三重PCR检测体系,对其退火温度、引物浓度、10×PCR Buffer(Mg2+plus)、dNTP和Taq DNA聚合酶进行优化,对优化后体系的特异性和灵敏度进行检测,并利用优化体系对田间采集的病害样品和土壤样品进行检测。结果表明,在优化后的50μL三重PCR检测体系中,RS-1-F/RS-3-R、dllz1/dllz2和SRITSF/SRITSR引物的最佳浓度分别为0.16、0.16和0.28μmol/L,10×PCR Buffer(Mg2+plus)、dNTP和Taq DNA聚合酶体积分别为6、5和1μL,检测体系的最佳退火温度为54℃。按照优化后的反应条件能分别扩增出青枯病菌、黄萎病菌和白绢病菌3种病菌的特异条带,分别为716、350和500 bp,其他对照病菌无条带。该体系对病菌DNA检测灵敏度达到0.1 ng/μL。该...