HBsAg/截短型HCV核心蛋白融合基因植物表达载体的构建及对番茄的遗传转化

探索乙肝病毒表面抗原/截短型HCV核心蛋白融合基因在植物中表达乙肝丙肝双价抗原的可能性,以期为进一步研制植物乙肝丙肝双价口服疫苗打下基础.利用重组PCR技术将乙肝病毒(HBV)S基因连接在丙肝病毒(HCV)截短型核心蛋白序列的5'端,二者通过柔性肽(Gly4Ser)2序列相连,构建成融合基因BC,测序结果正确.将融合基因BC克隆到植物表达栽体pBin438上,获得pBin438BC,然后用冻融法将其转入根癌农杆菌EHA105中,采用叶盘法转化番茄.获得了15株抗卡那霉素的番茄植株.对抗性植株进行PCR及Southern检测,8株获得阳性信号,表明目的基因已整合到了番茄基因组中.提取阳性植株的总蛋白,经透析后,将适当浓度蛋白质点在PVDF膜上,用Dot-ELISA方法验证番茄中表达蛋白的活性.结果表明,转基因番茄中有重组蛋白的表达.     

超量表达欧李ChPSY基因促进转基因番茄类胡萝卜素合成的研究

将从欧李果实中分离的ChPSY cDNA经过序列分析、酶切之后,连接到植物表达载体PMV,构建了植物重组载体pBI-ChPSY,并通过根瘤农杆菌EHA105介导转化番茄,获得了12株抗性植株。PCR检测和Southern杂交结果显示,12株抗性植株均为阳性,说明外源基因ChPSY整合到转化植株的基因组中。RT-PCR分析表明,ChPSY基因在转化植株果实中得到表达。HPLC分析表明,转ChPSY基因番茄果实中总类胡萝卜素含量增加了1.62 ~ 3.04倍,八氢番茄红素、番茄红素、β–胡萝卜素和α–胡萝卜素含量分别增加了4.87、2.10、2.59和3.25倍。转化植株中内源类胡萝卜素合成基因的表达也受到广泛的影响。ChPSY基因超量表达有效促进了番茄果实中类胡萝卜素的合成和积累。     

ICE1基因表达载体的构建及对番茄的转化

以pCAMBIA3301质粒为基础,构建了由CaMV35S启动子调控的ICE1基因植物表达载体p3301-ICE1。重组质粒通过农杆菌介导转化番茄品种组培大黄经卡那抗性鉴定,获得5株含ICE1基因的番茄抗性植株,PCR扩增和RT-PCR检测结果表明,其中3株为阳性植株,转化率为60%。转ICE1基因的番茄植株经4℃低温胁迫72h后,与对照植株相比,MDA含量明显降低,Pro含量、POD和CAT活性明显升高。     

TYLCV外壳蛋白基因植物表达载体构建及转化番茄的研究

以"特大瑞光"番茄为受体植物,采用农杆菌介导法,将含有番茄黄化曲叶病毒外壳蛋白(TYLCV-CP)基因的植物表达载体pCAMBIA3301转入番茄子叶外植体,对获得的13株草胺膦抗性番茄植株进行PCR和Southern Blot技术检测。结果表明:有10株呈阳性检测反应,说明TYLCV-CP基因已整合到番茄基因组中,阳性率为76.9%;番茄转基因植株较非转基因植株对番茄黄化曲叶病毒的抗性明显增强。     

萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFPs在大肠杆菌中的表达及其转化番茄的研究

 通过基因工程手段将萝卜抗真菌蛋白基因Rs-AFP_{1( 2)} 插入大肠杆菌表达载体pTrxFus中并诱导表达, 其融合表达产物约22 kD, 约占总可溶蛋白的0. 45% ( 0. 5%) 。抑菌活性试验表明: 重组Rs-AFP_{1( 2)}有抑菌活性, 其中Rs􀀁AFP2 较Rs􀀁AFP1 抑菌活性强。构建了Rs-AFP₂ 基因的植物表达载体pBIAFP₂。利用农杆菌介导法将pBIAFP₂ 导入番茄中, 并诱导出完整的植株32 株。对其中28 株进行PCR 和PCR-Southern Blot 检测, 其中17 株呈阳性。对经PCR Southern Blot 检测呈阳性的植株进行Southern Blot 检测, 6 株呈阳性。     

乙肝表面抗原大蛋白(S1S2S)基因在转基因苹果中表达

构建了乙肝表面抗原大蛋白基因PRS-S1S2S的表达载体pYF9616,通过根癌农杆菌介导法首次将该基因导入苹果品种红爱佳中,得到了抗卡那霉素的GUS阳性转化植株。随机取3株GUS染色阳性的转基因苹果植株经PCR扩增及RT-PCR检测证实该基因已整合入转基因苹果的基因组,并在转录水平得到了表达,ELISA检测证明在苹果植株中正确表达了乙肝表面抗原大蛋白基因。     

抗黄萎病基因StVe转化番茄的研究

 为了验证克隆自水茄（Solanum torvum Swartz）的StVe基因功能,将StVe连入中间载体p35S-2300::gus::noster的BamHⅠ和SacⅠ位点,取代gus基因构建植物双元表达载体p35S-2300::StVe::noster;用农杆菌介导法转化樱桃番茄22号获得了72株卡那霉素抗性植株,PCR和Southern blot检测确认有5株为阳性植株;RT-PCR结果显示,StVe在转基因番茄植株间的转录水平表达存在差异;PDA平板抑菌实验显示,转StVe基因番茄叶片总可溶蛋白具有抑制番茄黄萎病菌生理小种1（Verticillium dahliae race 1）生长的作用。     

八氢番茄红素合成酶(PSY2)基因果实特异表达载体的构建

八氢番茄红素合成酶是番茄红素合成的关键酶,通过PCR法获取PSY2基因和E8启动子序列,将目的基因和E8启动子序列构建到植物表达载体pBI101.2中,构建了果实特异表达启动子的八氢番茄红素合成酶基因植物表达载体。并采用PCR、限制性内切酶酶切和序列测定分析法,对重组质粒进行鉴定。结果表明,番茄果实特异性表达PSY2蛋白的重组质粒构建成功;通过农杆菌直接转化技术将其成功转入转化农杆菌LBA4404、EHA105,为下一步PSY2蛋白在番茄果实中特异表达奠定了基础。     

黄瓜花叶病毒反义2b 基因构建及其转基因初步研究

 研究构建了CMV 反义2b 基因的植物表达载体pZM 612 , 通过农杆菌侵染的叶盘转化法导入烟草, 分子检测证实获得了转反义2b 基因的SR1 烟草转基因植株, 初步的CMV 攻毒试验表明反义2b 基因可介导对CMV 的抗性。在此基础上, 将pZM 612 转化番茄品种‘红玛213’, 获得了卡那霉素抗性苗, PCR检测表明得到了PCR 阳性转化株。     

百合LfMADS基因植物表达载体的构建及其功能分析

 为了分析百合LfMADS1和LfMADS3基因的功能，分别将其正、反义基因插入到植物组成型双元载体pBin438中，并通过根癌农杆菌LBA4404介导转化烟草。PCR和PCR-Southern杂交结果均证明外源基因已经插入到烟草基因组中。转LfMASD1反义基因植株中1朵花的雄蕊极短、花药缺失；转LfMASD1正义基因植株中发现1个花萼变瓣的突变体。在转LfMASD3反义基因植株中发现1个植株的苞叶部分瓣化，花柄变短，另外1个植株上发现1朵花缺失1枚雄蕊；而转LfMASD3正义基因植株中没有发现变异。作者认为LfMASD1是百合花器官发育的B功能基因，LfMASD3是百合花器官发育的SEP基因，这些基因在烟草中的表现说明百合的花器官特性基因的表达模式与模式植物有所不同。     

Expression of hepatitis B virus core gene in Pichia pastoris

AIM: To study the expression of hepatitis B virus core gene in Pichia pastoris and to obtain high-level expressed recombinant HBcAg with good immunoreactivity and high specificity. METHODS: HBV core gene was amplified by PCR from plasmid pHBV1 which contained HBV whole DNA sequence. The PCR product was cloned into pGEM-T vector by TA cloning strategy. After confirmed by DNA sequence analysis, the gene of interest was inserted into the yeast expression vector pPIC9. The recombinant plasmid pPIC9-cAg was constructed and transformed into GS115 by electroporation. The recombinant yeast GS115 was induced by 0.5% methanol. The expressed product was analysed by SDS-PAGE,Western blot and ELISA. RESULTS: The restriction analysis and DNA sequence analysis proved that HBV core gene had already been cloned to yeast expression plasmid pPIC9. The expressed HBcAg existed in SDS-PAGE. Good immunoreactivity and high specificity of the recombinant HBcAg have been proved by ELISA and Western blot. The titre of the recombinant HBcAg in the cell lysate was 1∶12 800. CONCLUSION: The recombinant plasmid pPIC9-cAg was successfully constructed. The recombinant HBcAg with good immunoreactivity and high specificity was successfully expressed in Pichia pastoris expression system and can be applied to further developing HBcAb immunoassay.     

根癌农杆菌介导绿色荧光蛋白基因转化印度酸桔的研究

 通过根癌农杆菌介导将绿色荧光蛋白基因转入印度酸桔的胚性愈伤组织中, 经潮霉素筛选,获得抗性愈伤组织, 并再生植株。对这些植株进行GUS 染色、PCR 分析、绿色荧光检测和Sourthern 杂交验证, 结果表明绿色荧光蛋白已经在转基因植株中表达。     

小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因植物表达载体的构建

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchiniyellowmosaicvirus,ZYMV)是危害中国葫芦科作物主要病毒之一。试验以该病毒中国分离物外壳蛋白基因的克隆载体pZCP-87(含ZYMV的CP基因)为材料,经SalⅠ和BamHⅠ双酶切,从胶上回收目的基因,与经过同两种酶酶切的植物表达载体pBIN438连接,转化感受态的大肠杆菌细胞,提取质粒,经PCR和SalⅠ/BamHⅠ双酶切验证,已将该病毒外壳蛋白基因克隆到植物表达载体上(重组质粒命名为pBZCP5),采用冻融法完成了对pBZCP5质粒的农杆菌转化。该工作是通过转基因获得抗ZYMV病毒研究的基础。     

青苹果竹芋的组培快繁技术

青苹果竹芋(Calathca rotundi fla CV.Fasciata)又称圆叶竹芋,属于竹芋科肖竹芋属多年生常绿草本.青苹果竹芋是近年来从国外引进的室内高档观叶植物品种,曾在2005年1月广州花博园举行的"中国首届盆栽花卉交易会"上,以其叶片圆润,质感好,观赏价值高,适宜于室内盆栽观赏等特点,一举获得"金花奖",令人十分注目.     

黄河蜜甜瓜CMV CP基因转化及其抗病性鉴定

利用整合有CMVCP基因及NPT-II基因的改建质粒pBim438,以农杆菌为载体,对黄河蜜甜瓜子叶进行转化,以75mg/L卡那霉素筛选转化体,获得了完整的转基因植株。Southern杂交证明转化植株整合了CMVCP基因,Western杂交证明转基因获得了表达。温室CMV攻毒试验及病毒含量测定表明,转基因甜瓜对CMV的侵染表达了较高的抗病性,能够推迟系统症状显症发生,减轻病害发生程度,转基因植株体内病毒含量低于对照。转基因植株抗病性存在差异,筛选出的2个抗性株系中,TM0-1抗性高于TM0-2。     

葡萄糖氧化酶( GO ) 基因在番茄中的遗传转化

 将来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶( glucose oxidase, GO ) 基因与病原诱导启动子Prp1-1融合,构建了植物表达载体pCPGO, 该载体具有抗除草剂PPT选择标记。经农杆菌介导转入番茄自交系, 获得了阳性转基因植株58株, Southern杂交结果表明, GO基因已整合到番茄基因组中。通过淀粉- KI显色反应和定量检测, 表明GO基因已经表达。转基因植株花器及开花正常, 种子一旦萌发, 其生长、发育各时期均正常。但结实率有所减少, 种子萌发率有所降低。用番茄叶霉病( Fulvia fulva) 病原菌1.2.3.4生理小种侵染T₁ 代转基因植株, 结果显示转基因番茄植株的抗病性有不同程度的提高, 多数发病时间推迟, 病情明显减轻。经测定与抗病性相关的几个指标, 结果转基因番茄叶片中SOD、POD、CAT的活性和蛋白质含量均增高。     

类胡萝卜素合成酶基因LycB导入番茄的研究

以4个番茄品种的子叶为受体,以LycB为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对番茄进行了遗传转化,经愈伤诱导、芽诱导、生根培养和潮霉素选择培养,获得的抗性植株经PCR和PCR-Southern分析鉴定,初步证明外源基因LycB已整合到番茄的基因组中。     

根癌农杆菌介导乙肝病毒表面抗原基因转化樱桃番茄体系优化

以樱桃番茄为试材,建立了樱桃番茄高频再生体系,并对农杆菌介导乙肝病毒表面抗原(HBsAg)基因转化樱桃番茄的条件进行了优化研究。结果表明:11d苗龄的子叶外植体在MS+6-BA 3.0mg/L+IAA 0.2mg/L的培养基上预培养2d后,用OD值为0.6的农杆菌侵染15min,可使樱桃番茄植株达到最佳的遗传转化效果。     

番茄microRNA基因沉默载体的构建方法

该试验提出了一种简单且快速构建番茄中人工miRNA表达载体的方法,以包含miR319a前体骨架的质粒pRS300为模板,以重叠PCR技术来扩增miR1917的前体。miR1917的靶基因是LeCTR1,是乙烯反应中的一种负调控因子。含有miR1917的重组前体成功地转化到表达载体pGreen0029-35s中,通过植物根癌农杆菌C58介导的叶盘法成功获得了转基因植株。此种方法可为番茄中miRNA的作用机理研究提供一定的理论基础。