苹果梨果皮花色素苷合成相关基因PyANS的克隆与表达分析

以延边地区苹果梨为试材,采用同源克隆及实时荧光定量PCR的试验方法,研究PyANS基因在苹果梨解袋前后果实着色过程中的表达特性及与花青苷积累的关系。结果表明:PyANS的全长cDNA为1 075bp,其开放阅读框(ORF)编码358个氨基酸,分子量约为40kDa,理论等电点pI为5.38。同源性分析表明与同属的砂梨相似性高达99%,实时荧光定量PCR分析表明PyANS基因受到光诱导表达量迅速上升,去袋1d后表达量迅速增加,第10天时达到最大值,随后迅速下降,最终稳定在同一表达水平,与果实着色和花色苷含量测定的结果相对应,表明PyANS基因对果实花色素苷积累有一定的促进作用。     

‘苹果梨’果实着色过程中PyCHI和PyF3H的克隆与表达分析

【目的】克隆‘苹果梨’(Pyrus bretschneideri Rehd.‘Pingguoli’)Py CHI和Py F3H的全长c DNA序列,检测其在果实着色过程中的表达特性及其与花青苷积累的关系。【方法】以‘苹果梨’套袋后去袋处理的果实和未套袋的果实(CK)为试材,采用同源克隆技术克隆Py CHI和Py F3H的全长c DNA序列并进行生物信息预测分析;利用实时荧光定量PCR技术检测Py CHI和Py F3H在去袋处理与未套袋处理的不同着色时期的果实中的表达特性。【结果】Py CHI和Py F3H的全长c DNA分别为702 bp和1095 bp,分别编码233和364个氨基酸。同源性分析显示,其与沙梨、西洋梨等蔷薇科梨属植物相应基因的同源性均超过95%,相应氨基酸序列相似性均达到85%。实时荧光定量PCR分析显示,套袋果实去袋见光后Py CHI和Py F3H表达量均迅速上升,随后Py CHI表达量虽然略有下降,但在整个果实着色过程中Py CHI和Py F3H的表达量一直维持在较高水平,均显著高于对照,且与果实花青苷含量的变化规律基本一致。【结论】获得‘苹果梨’PyCHI和Py F3H的全长c DNA序列,其表达水平与果实花青苷积累关系密切,表明其在调控‘苹果梨’果实着色过程中起重要作用。     

葡萄VJyGST全长cDNA克隆及其在果实着色过程中的表达

以京优葡萄果皮为试材,利用RT-PCR、SMARTTMRACE技术克隆了1个全长为851bp的GST基因,Genebank的登录号为GU370062,命名为VJyGST。该基因包括开放阅读框(ORF)642bp,编码213个氨基酸,推导其分子量为24.25ku,等电点为5.52。氨基酸同源性分析表明,VJyGST与山葡萄GST(FJ645770)、甜橘GST(DQ198153)、荔枝GST(EF613493)相似性分别达到了99%、77%、67%。实时荧光定量PCR分析显示,在果实着色过程中,GST基因在果肉中表达较低且相对稳定;在果皮中表达较高,表达量随花色苷的合成递增,90%着色时到达最高,表明GST的表达与花色苷生物合成密切相关。     

甜樱桃磷酸蔗糖合酶基因Pav SPS的功能分析

从甜樱桃基因组中鉴定了4个磷酸蔗糖合酶(sucrosephosphatesynthase,SPS)基因(PavSPSA1、PavSPSA2、PavSPSB和PavSPSC)。实时荧光定量PCR分析表明,PavSPSA1在甜果实发育和成熟过程中表达量最高,其次是PavSPSC,PavSPSA2和PavSPSB表达量较低;PavSPSA1和PavSPSA2在果实成熟软化过程中均上调表达,与甜樱桃果实的成熟软化过程吻合。通过利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术沉默PavSPSA1,甜樱桃果实蔗糖含量降低,果实着色和果实成熟软化延迟;沉默PavSPSA2、PavSPSB和PavSPSC,甜樱桃果实蔗糖含量、果实着色和果实成熟软化与对照无差异,推测PavSPSA1或许是调控果实蔗糖合成与积累的关键基因,影响果实着色和成熟软化。     

葡萄果实始熟前后ABA积累关键酶基因VvNCED1和VvBG1转录水平的研究

以始熟期花后7 ~ 11周的‘玫瑰香’葡萄果肉为试材,利用荧光定量PCR分析了VvNCED1和VvBG1基因在5个时期的表达量。结果表明,VvNCED1基因在花后7 ~ 8周表达量很高,随后快速降低至最低值;随着果实着色,表达量略有升高。VvBG1基因在果实始熟前表达量较低,随着果实始熟启动和果实着色,表达量基本呈持续升高的趋势。结合果实ABA含量在始熟期前后一直升高的结果分析,认为果实始熟前ABA积累归因于VvNCED1基因的高水平表达,始熟后ABA积累主要归因于VvBG１基因的高水平表达。     

草莓果实ABA积累关键酶基因FaNCED1和FaBG1转录水平的分析

为探讨草莓果实发育过程中ABA积累的酶学调控机制,文章以花后1～4周的‘杜克拉’草莓7个时期果肉为试材,利用实时荧光定量PCR分析ABA积累关键酶基因FaNCED1和FaBG1转录水平。结果表明,在整个草莓果实发育过程中,果肉中FaNCED1基因表达水平明显地分为两个持续上升阶段,即从小绿期至白熟期和始红期至全红期,但二者之间还存在一个短暂下降期,即白熟期至始红期;果肉中FaBG1基因表达水平呈逐渐降低的趋势。结合果肉中ABA含量分析发现,FaNCED1基因转录水平呈现与ABA水平相似的变化趋势。本研究主要得出以下结论:(1)退绿和着色是草莓果实发育成熟过程中两个突出事件;(2)果肉中ABA水平两次持续快速积累分别与草莓果实退绿和着色相偶联;(3)果肉中ABA含量主要由FaNCED1基因决定,而与FaBG1基因关系不大。以上结果为从分子水平调控草莓果实中ABA含量,进而调控果实的发育奠定研究基础。     

(木奈)肉桂酸-4-羟化酶基因及其启动子克隆与表达分析

以不同发育时期的果实为试材,采用两步法逆转录与抑制PCR技术相结合的方法构建均一化全长cDNA文库,筛选出一条编码肉桂酸-4-羟化酶的全长cDNA(命名为PsC4 H);采用APA-Walking技术,分离获得该基因的启动子序列;采用实时荧光定量PCR技术,检测该基因在果实不同发育时期的表达动态。结果表明:PsC4 H基因全长为1 772bp,ORF(Open Reading Frame)为1 515bp,编码504个氨基酸,相对分子量为145 719.6,等电点为4.94,经序列同源性分析发现,PsC4 H氨基酸序列与李属果树高度同源;经PlantCare软件预测,PsC4 H基因的启动子除具有TATA/CAAT-box外,还含有G-box、HSE等特异作用元件;实时荧光定量结果显示,PsC4 H在果实整个生长发育过程中呈下调-上调的表达趋势,其中在成熟果中表达量最高。     

草莓9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶基因FaNCED的克隆及表达分析

 采用RT-PCR和RACE技术从草莓果实中克隆ABA合成途径中关键基因FaNCED,该cDNA全长2 228 bp,具有完整的开放阅读框（ORF）,共1 827个碱基,编码609个氨基酸。序列分析表明,FaNCED编码的氨基酸序列与其他植物的NCED蛋白有很高的同源性。系统进化树分析显示,草莓NCED与同为蔷薇科的湖北海棠聚为一类,与橙、柠檬、温州蜜柚、葡萄等非跃变型果实NCED蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现,FaNCED基因在草莓根、茎、叶、花萼和果实中都有表达;在果实成熟过程中FaNCED的表达出现两次高峰,分别在大白果期和红果期,且在红果期表达量最高,并与ABA积累相吻合;FaNCED在果实采后1 d表达略有下降,之后急剧上升,ABA含量变化与FaNCED基因的表达基本一致。FaNCED可能参与调控ABA的合成并在草莓成熟中起一定作用。     

软枣猕猴桃果肉花色苷关键光响应调节因子AaMYB1的筛选

【目的】从前期‘天源红’不同发育时期果肉转录组测序结果中筛选了与全红型软枣猕猴桃果肉着色相关的14个转录因子基因,鉴定在套袋过程中的表达特征,并筛选关键光响应转录因子。【方法】以全红型软枣猕猴桃品种‘天源红’盛花后8个时期的果肉样品为试材,在盛花后30 d对果实进行套袋处理,以不套袋果实作对照;使用日本柯尼卡美能达可携式色差计CR-400进行色差指标测定,采用超高效液相色谱串联质谱法检测花色苷组分及总含量,利用实时荧光定量PCR技术检测14个转录因子基因的表达量并对其进行相对定量;通过表型、基因表达量与花色苷含量的相关性分析,综合筛选关键光响应转录因子。【结果】随着果实生长发育,果肉颜色均由绿变红,在盛花后120 d红色最深,未套袋果肉红色明显深于套袋果肉,色泽比和色度角的测定结果与表型鉴定结果一致。果肉主要呈色物质是矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖苷,二者与总花色苷含量呈极显著相关;盛花后120 d,矢车菊素-3-O-半乳糖苷和总花色苷含量在套袋与不套袋果肉中差异显著。实时荧光定量PCR结果显示,MYB1在盛花后120 d未套袋果肉中的表达水平显著高于套袋果肉,并且与未套袋果肉矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖苷含量呈显著正相关,与套袋处理果肉不相关。【结论】筛选到软枣猕猴桃花色苷形成响应光照的关键转录因子AaMYB1;套袋处理可能通过抑制AaMYB1的表达从而抑制花色苷(主要是矢车菊素-3-O-半乳糖苷)的合成与积累,从而阻碍果实正常着色。     

黑莓RuMYB10基因的克隆和表达

【目的】从黑莓中克隆RuMYB10的编码区全长序列,并分析其在黑莓果实发育过程中的表达情况与果实花青素苷积累的关系。【方法】以黑莓基因组DNA为模板,通过同源克隆和SON-PCR技术获得了RuMYB10基因全长编码序列(Accession No.:JQ359611);并以黑莓果实mRNA为模板进行验证。采用实时定量PCR技术检测该基因在果实不同发育阶段的表达水平。【结果】结果表明,该基因编码区全长共1 837 bp,编码216个氨基酸,推导蛋白分子质量为24 863 Da。具有MYB转录因子家族特有的R2R3保守序列。含有两个内含子,第2个内含子长度为750 bp,占全长40.8%;在R3重复单元中存在与bHLH因子互作的‘[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R’序列;而促进花青素苷合成的MYB转录因子3个特征氨基酸残基中的丙氨酸(A)被丝氨酸(S)取代。RuMYB10基因在黑莓果实发育后期,即果实变红到最后变黑的过程中大量表达,与花青素苷的积累相一致。【结论】从黑莓中克隆到包含完整ORF的转录因子基因RuMYB10,具有MYB因子家族结构特征和bHLH因子结合域,且在果实花青素苷积累高峰期表达量最高。