响应低磷胁迫的小麦MDP激酶基因TaMPK1a-1的克隆和表达分析

 【目的】蛋白磷酸化在介导非生物逆境信号的转导中具有重要作用。以笔者在低磷胁迫下鉴定的小麦促分裂原活化蛋白激酶（MAP激酶）基因TaMPK1a-1为基础,开展该基因应答低磷逆境分子特征的研究。【方法】利用cDNA-AFLP技术,鉴定特异上调表达的MAP激酶基因TaMPK1a-1。采用生物信息学技术研究基因结构和编码蛋白特征,采用半定量RT-PCR技术研究TaMPK1a-1应答低磷胁迫逆境的分子特征。【结果】TaMPK1a-1 cDNA长度为2 170 bp,开放阅读框为1 737 bp,编码578个氨基酸残基。TaMPK1a-1含有2个参与双重磷酸化作用的TEY和TDY基序。在正常供磷条件下,磷高效品种石新828和磷低效品种冀7369根叶中均检测不到TaMPK1a-1的转录本;低磷处理下,TaMPK1a-1的表达在上述品种的根叶中均受到明显诱导。与冀7369相比,低磷条件下石新828根叶中TaMPK1a-1的转录本明显增多。【结论】TaMPK1a-1级联转导途径不仅影响着小麦对低磷信号的响应,而且对于增强小麦适应低磷胁迫的能力中也可能具有重要作用。     

小麦磷转运蛋白基因TaPT2的转录调控特征研究

在富集低磷逆境的根系cDNA差减文库中,获得了与小麦磷转运蛋白基因TaPT2具有相同序列的表达序列标签(EST).TaPT2的表达呈根系特异性,对外界低磷逆境呈明显应答,表明该基因在小麦抵御外界低磷逆境中可能发挥重要作用.采用基因组行走技术,克隆了长度为1 300 bp的TaPT2启动子,该启动子含有保守TATA盒、C...     

小麦磷转运蛋白基因TaPT4的克隆和表达分析

在富集低磷响应基因的小麦根系cDNA差减杂交文库中,测序后获得1个与大麦磷转运蛋白基因HvPT4高度同源的表达序列标签TaPT4-EST。经BLAST分析获得该EST对应的全长cDNA,将其命名为TaPT4。TaPT4的cDNA全长为1 927bp,编码537个氨基酸残基,编码蛋白含有12个跨膜保守域。系统进化分析表明,TaPT4除与HvPT4具有较高的相似性外,还与呈高亲和特征的黑麦磷转运蛋白基因PT和小麦磷转运蛋白基因PT1高度同源。TaPT4在叶中的表达为组成型,在根中的表达受到低磷诱导;此外,无论在低磷处理还是正常供磷条件下,TaPT4在根中的表达均表现明显的昼夜节律特征,表现为随照光时间延长而表达增高,进入暗期后表达减弱。上述结果表明TaPT4可能是归属于高亲和特征的小麦磷转运蛋白,在增强小麦在低磷逆境下的磷素吸收中发挥着重要作用。     

陆地棉低磷胁迫应答基因GhGDPD1的克隆与表达分析

【目的】基于前期陆地棉‘新陆早19’Gossypium hirsutum‘Xinluzao 19’根部低磷胁迫基因表达谱芯片差异表达序列数据分析,挖掘相关基因,并对其克隆与表达分析。【方法】克隆陆地棉‘新陆早19’GhGDPD1基因并进行基因组DNA与cDNA测序分析,借助生物信息学方法分析GhGDPD1的基因结构和进化关系;采用半定量RT-PCR技术与实时荧光定量PCR (RT-qPCR)的方法检测该基因于根、茎、叶、花等4个组织的基因表达量的变化以及低磷胁迫下的表达模式。【结果】成功克隆GhGDPD1基因,开放阅读框序列长度为1 149 bp,共编码382个氨基酸,属于GDPD家族,其中存在一个保守结构域,名为GDPD＿GDE5＿like＿1＿plant。半定量RT-PCR和RT-qPCR试验结果均显示：GhGDPD1基因主要表达于根,中量表达于花和茎,微量表达于叶。该基因在受到低磷胁迫的刺激后,立即会对低磷胁迫做出应答,胁迫4 h相对表达量达到最高值。【结论】首次成功克隆到陆地棉‘新陆早19’GhGDPD1基因,获得了GhGDPD1基因的组织表达以及低磷胁迫下的表达模式,为深入解...     

小麦胁迫相关基因TaLEA2的克隆、生物信息学及表达特性分析

【目的】克隆小麦Triticum aestivum晚期胚胎发育丰富蛋白基因并对其进行基因结构、蛋白特性及表达模式分析,为其耐盐性研究奠定理论基础.【方法】搜索小麦EST数据库,通过同源克隆分离并获得小麦晚期胚胎发育丰富蛋白基因,用生物信息学软件分析该基因结构及蛋白特性,荧光定量试验分析该基因的表达模式.【结果和结论】获得1条1 100 bp的核苷酸序列,该序列包含了1个981 bp的开放阅读框,编码1个由326个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白含有2个LEA2结构域,属于第2组LEA蛋白,该蛋白命名为TaLEA2.生物信息学分析显示TaLEA2蛋白具有LEA2家族的典型特征,富含赖氨酸(Lys),不含半光氨酸(Cys),无明显的高级结构,平均亲水系数(GRAVY)为-0.405,稳定系数为25.28,这种氨基酸组成及结构均有利于蛋白的热稳定性及亲水性.实时荧光定量PCR分析表明,TaLEA2基因为组成型表达,同时该基因存在组织表达差异,且表达受不同发育时期影响;该基因调控表达受高盐、低温、病原菌及干旱等胁迫的影响,尤其在干旱胁迫中上调表达明显,但该基因不受外源ABA刺激的影响.推测TaLEA2基因参与了小麦正常条件下的生长发育,同时也广泛地参与了小麦抵御逆境胁迫的响应,尤其在小麦的抗旱胁迫过程中发挥重要作用.     

小麦逆境胁迫相关基因Ta14S的克隆及表达分析

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因,通过对目的基因的表达分析进一步解析植物的抗逆机制,为小麦抗逆育种提供候选基因和理论依据。【方法】基于cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列,运用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并利用实时荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达模式。【结果】通过RACE扩增获得小麦cDNA全长序列（GenBank登录号：JN650603）,命名为Ta14S。该基因序列全长为1 056 bp,其中,5′端非编码区11 bp,3′端非编码区253 bp,开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。序列比对发现其蛋白质序列包含1个蛋白激酶C的底物结构域、1个类膜蛋白结合域、1个转录因子结合域和1个核输出信号结合域,具有植物14-3-3蛋白的结构特征;运用实时荧光定量PCR进行Ta14S表达分析,该基因在小麦苗期根中表达量最高,在PEG和低温胁迫的任何时间点均稳定上调表达,在ABA和高温胁迫的6 h内其相对表达量均显著高于对照,推测Ta14S可能参与小麦ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦Ta14S的全长cDNA序列,其编码蛋白包含与蛋白质互作的典型功能域;通过对Ta14S在干旱、高温、低温、ABA胁迫过程中的表达特性分析表明,Ta14S在小麦逆境胁迫中发挥着重要的调控功能。     

桃Q型C2H2锌指蛋白基因家族的鉴定及其在低温胁迫下的表达分析

【目的】从桃基因组鉴定Q型C2H2锌指蛋白基因家族成员,并进行生物信息学与低温表达分析,为桃抗逆性研究提供理论依据。【方法】采用生物信息学方法分析桃46个Q型C2H2锌指蛋白家族成员的理化性质、系统进化和基因结构等,并利用实时荧光定量分析其低温胁迫下的表达特征。【结果】桃Q型C2H2锌指蛋白家族成员氨基酸数量介于155～607,且主要位于细胞核中。染色体定位揭示该家族成员不均匀地分布在8条染色体上。系统进化分析将桃和拟南芥的Q型C2H2基因聚为16个亚组。基因结构分析表明：同一亚族成员结构相似,外显子数量基本相同。顺式作用元件分析表明：大多数Q型C2H2锌指蛋白家族成员启动子序列上游2 000 bp区域包含大量激素及非生物胁迫响应元件。qRT-PCR分析表明：低温胁迫下,桃Q型C2H2锌指蛋白家族成员中有16个成员为上调表达,且以PpC2H2-18基因最为显著。【结论】该家族成员均含有较高的保守基序和结构域,且可参与植物生长发育以及生物和非生物胁迫等,为桃的抗寒育种提供了参考。     

病原诱导的小麦转录因子TaERF1b基因的分离和表达

 【目的】研究一个病原诱导的小麦ERF转录因子基因在对纹枯病菌、赤霉病菌防御反应中的作用。【方法】应用生物信息学、RT-PCR、RACE方法,从赤霉病菌诱导的小麦中,分离ERF转录因子基因的全长cDNA序列;利用半定量RT-PCR方法,分析该基因对小麦纹枯病菌、赤霉病菌及MeJA、ET和SA处理的应答表达情况。【结果】从赤霉病菌诱导的抗赤霉病小麦品种苏麦3号cDNA中,分离出1个编码ERF转录因子基因的全长cDNA序列。该基因暂被命名为TaERF1b,编码由280个氨基酸组成的蛋白质TaERF1b。TaERF1b具有保守的ERF/AP2结构域,但TaERF1b蛋白全长氨基酸序列与已克隆的ERF蛋白同源性较低（＜36.5%）。TaERF1b基因表达分析的结果表明,纹枯病菌、赤霉病菌侵染可快速诱导抗病小麦中TaERF1b基因的上调表达,该基因转录表达水平在防卫相关激素乙烯、茉莉酸处理早期显著增强,而且TaERF1b对外源乙烯、茉莉酸处理的响应时期早于对纹枯病菌、赤霉病菌的响应时期。【结论】分离出一个受病原诱导的小麦ERF新基因TaERF1b,其编码蛋白TaERF1b为植物ERF转录因子家族的一个新成员,可能通过茉莉酸、乙烯信号途径介导小麦对纹枯病菌、赤霉病菌的防御反应。     

小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基基因TaBβ-1的克隆及其在非生物胁迫下的表达特性

【目的】克隆小麦蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基(PR55)基因TaBβ-1,分析其在非生物胁迫下的表达特性,为小麦抗逆育种提供候选基因。【方法】以小麦品种旱选10号为材料,通过电子克隆和RT-PCR获得TaBβ-1的全长cDNA序列,采用生物信息学软件分析TaBβ-1及其编码蛋白TaBβ-1的序列特征,预测其功能,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术分析该基因在小麦孕穗期不同组织中、不同生育时期新叶中的表达情况,以及在PEG、NaCl、低温及外源激素ABA等非生物胁迫下的表达模式,检测不同水分条件下成株期转基因拟南芥的叶片细胞膜稳定性。【结果】获得TaBβ-1的全长cDNA序列1931bp,其开放阅读框(ORF)为1539bp。该基因编码512个氨基酸,预测TaBβ-1蛋白分子量为57.1kD,等电点为5.87,含有PP2A调节亚基的1个CDC55保守结构域、1个alpha/beta结构域、2个PR55保守结构域和6个WD重复子。TaBβ-1在小麦孕穗期的根、穗、叶中均有表达,表达量依次为根穗叶;在不同生育时期的新叶中,苗期叶片的表达量最高。TaBβ-1的表达明显受PEG、NaCl、低温以及外源ABA的诱导。【结论】小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基家族基因TaBβ-1在小麦苗期叶片中的表达量明显高于根、穗以及其它时期的叶片;TaBβ-1参与对高渗、高盐、低温等多种胁迫以及ABA处理的应答反应,但表达模式不同;在水分胁迫条件下,转基因拟南芥比野生型具有较高的细胞膜稳定性。     

小麦热胁迫响应基因TaMYB165的克隆与功能分析

【目的】MYB转录因子在植物生长发育和抗逆过程中起着重要作用,克隆小麦MYB基因并对其功能进行研究,对植物MYB转录因子的调控机制具有重要意义。【方法】利用Affymetrix小麦芯片系统,分析2个小麦品种中国春(热敏感)和TAM107(耐热)在不同热胁迫处理下的转录谱,从热胁迫上调表达的EST序列中克隆得到小麦耐热相关TaMYB165基因,并对该基因的表达特性及功能进行研究;利用实时定量RT-PCR技术分析小麦不同发育时期、不同组织器官热胁迫处理下TaMYB165基因的动态表达模式,构建超表达载体并转化拟南芥,对获得的转基因拟南芥株系进行耐热性鉴定。【结果】克隆获得1个小麦MYB转录因子家族基因TaMYB165,该基因ORF长度为847 bp,编码282个氨基酸。同源序列分析表明,TaMYB165与高粱SORBIDRAFT 03g040120亲缘关系最近(73.2%),与水稻MYB蛋白和拟南芥AtMYB165的相似性分别为70.37%和33.0%。qRT-PCR结果显示,TaMYB165在小麦苗期和灌浆期都受热胁迫诱导表达,只是响应的早晚有所不同。在拟南芥中过量表达TaMYB165,转基因株系热胁迫后成活率提高,细胞膜热稳定性增强。【结论】TaMYB165是小麦热胁迫响应的重要转录因子,可作为小麦耐热育种的重要候选基因。     

不同紫花苜蓿品种对低磷环境的形态与生理响应分析

【目的】筛选耐低磷苜蓿品种及与耐低磷密切相关的性状指标,进一步为紫花苜蓿耐低磷机制研究和生产应用提供理论依据。【方法】在溶液培养条件下,对20个紫花苜蓿品种的24 d龄的幼苗分别进行常磷(500μmol·L~(-1) KH2PO4)和低磷(5μmol·L~(-1) KH_2PO_4)处理,30 d后检测各品种的茎叶干重(SLW)、株高(PH)、根干重(RW)、根冠比(RS)、总根长(TRL)、根表面积(RSA)、全磷含量(TP)、磷利用率(PUE)、酸性磷酸酶活性(ACPA),并计算各指标的耐低磷系数。进一步对各指标的耐低磷系数进行相关性分析,并运用主成分分析、隶属函数分析、回归分析及聚类分析方法,综合评价不同品种耐低磷性及筛选与耐低磷密切相关的指标,同时建立耐低磷评价模型。【结果】低磷胁迫下,各品种紫花苜蓿的地上部分生长受到抑制,地下根系增大,全磷含量显著下降(P0.01)。通过主成分分析可将9个单项指标转化为4个新的相互独立的综合指标。进一步利用隶属函数对4个新的综合指标进行耐低磷综合评价,结合聚类分析结果,可将20个紫花苜蓿品种可分为三类,其中耐低磷较强的品种包括敖汉、新牧1号、耐盐之星、皇冠;中度耐低磷品种包括骑士T、驯鹿、牧歌37CR、龙牧801等9个品种;耐低磷较弱的品种包括巨能Ⅱ、中苜2号、康赛等7个品种。进一步利用逐步回归分析方法建立了紫花苜蓿耐低磷性评价数学模型D=-0.7997+0.3856SLW+0.2025PH+0.3789RW+0.1051TRL+0.4188TP+0.1347ACPA,方程的决定系数R~2=0.9982.【结论】通过分析紫花苜蓿不同品种的耐低磷能力,得出耐低磷较强的品种为敖汉、新牧1号、耐盐之星、皇冠,与耐低磷性最相关的指标有茎叶干重、株高、根干重、总根长、全磷含量和酸性磷酸酶活性,可用于紫花苜蓿耐低磷性的评价筛选。     

高产冬小麦对锌的吸收、积累与分配

目的明确高产(9000kg·hm-2)冬小麦的锌素吸收、积累与分配特点,为确定锌肥施用技术提供依据。方法2004—2006两年中各采用4个品种,于各生育时期在田间取植株样品,分器官测定锌的含量。结果小麦各生育时期各器官的含锌量为9.5—112.5mg·hm-2(干重),含锌量最高的器官随生长中心的转移而更替。生育前期叶片中锌的积累量最高,拔节前叶片中锌的分配率占全株总积累量的50%以上;生育后期籽粒中锌的积累量最高。小麦一生锌的总积累量为384.9—475.9g·hm-2,生产100kg籽粒吸收锌4.3—5.2g。籽粒由再分配获得的锌占籽粒总锌量的58.2%—60.3%,各器官对锌的净吸收积累量、转移量及对籽粒锌的贡献均为叶片穗叶鞘茎秆。结论各器官生育前中期含锌量和积累量较高,后期籽粒锌的积累主要取决于各器官锌的再分配。根据锌的这些吸收积累特点,锌肥主要应作为播种前拌种或基肥施用,以促进小麦生育前期的生长和锌的吸收。     

磷转运蛋白基因TaPHT2;1在染色体上定位 及对小麦磷素吸收和利用效率的影响

【目的】以中国春遗传背景的整套B染色体双端体为材料,鉴定磷转运蛋白基因TaPHT2;1的染色体定位特征。解析不同供磷水平下,上述材料和不同磷利用效率小麦品种该基因的表达特征及其与植株干物质生产能力和磷效率特征的联系。【方法】采用溶液培养法水培中国春（CS）及该品种遗传背景的整套B染色体组双端体和不同磷效率小麦品种材料。以B染色体组供试端体为材料进行TaPHT2;1 PCR扩增,鉴定TaPHT2;1在染色体上的定位。采用半定量RT-PCR及qRT-PCR技术分析B染色体组供试端体和小麦品种TaPHT2;1的表达水平。采用常规分析技术,测定供试材料单株干重和磷吸收参数。【结果】①PCR检测发现,在CS及所有供试B染色体组双端体材料中,除缺失1B长臂的1BS外,其它所有材料均能特异扩增出目标基因TaPHT2;1,表明TaPHT2;1定位在1B长臂。②丰、缺磷条件下,TaPHT2;1在CS及除1BS外双端体根、叶中的表达均表现为叶片优势表达特征,且在叶片中表达受到低磷胁迫的诱导。TaPHT2;1在根系中的表达不受低磷逆境调控。表明TaPHT2;1在介导丰磷下磷素吸收、转运及增强低磷下植株体内磷素再度调运中可能发挥重要功能。③丰磷条件下,与CS相比,1BS的单株干重和全磷含量显著降低;缺磷条件下,1BS的单株干重与CS相比也显著下降,但全磷含量增加。表明位于1B染色体长臂后的磷转运蛋白基因TaPHT2;1,对丰、缺磷条件下的植株磷素吸收、转运具有较大影响,进一步对不同供磷水平下的植株干重产生重要调控效应。④丰磷条件下,与CS相比,1BS的单株磷累积量显著增加,磷利用效率没有改变;缺磷条件下,与CS相比,1BS的单株磷累积量没有变化,磷利用效率显著降低。不同磷利用效率品种相比,丰磷条件下,随着品种磷利用效率提高,叶片中TaPHT2;1的表达水平、单株干重、全磷含量和单株磷累积量也随着增加;缺磷条件下,随着小麦品种磷利用效率提高,叶片中TaPHT2;1的表达水平、单株干重和磷利用效率也随之增高,但全磷含量呈下降趋势,单株磷累积量品种间差异较小。因此,TaPHT2;1的表达水平与小麦品种丰、缺磷条件下的磷素吸收、利用和干物质积累能力具有紧密联系。【结论】小麦磷转运蛋白基因TaPHT2;1位于1B染色体长臂。该基因通过其特定对外界供磷水平产生应答,在较大程度上调控植株的磷素吸收和利用能力,对不同供磷水平下的植株干重产生重要影响。TaPHT2;1在调控植株丰磷下磷素吸收和低磷下磷素利用中发挥重要作用,可作为鉴定小麦品种磷效率的评价指标。     

苹果山梨醇脱氢酶基因家族的克隆及表达分析

【目的】进一步探明苹果中山梨醇脱氢酶（sorbitol dehydrogenase,SDH;EC 1.1.1.14）基因家族的分子特性。【方法】从‘嘎拉’苹果中克隆 SDH基因家族全长 cDNA 序列和gDNA 序列,检测它们在叶片和果实不同生长时期的表达模式。【结果】获得了12个苹果SDH基因家族cDNA序列,依次命名为MdSDH7-MdSDH18。除MdSDH18基因的全长gDNA序列由6个外显子和5个内含子组成,其余基因的全长gDNA序列由2个外显子和1个内含子组成。根据氨基酸序列相似性可以将这些SDH基因分为A和B两类。所有SDH基因在果实不同生长期均有表达,且中后期表达高于初期,但果实初期的SDH活性高于中后期。A类SDH基因在叶片不同生长时期的表达水平为幼叶＞衰老叶＞成熟叶,SDH活性也呈现出同样的趋势,但B类SDH基因在叶片不同生长时期的表达水平为衰老叶＞成熟叶＞幼叶。【结论】进一步证明了SDH基因在苹果中是以基因家族的形式存在的,且不同的基因家族成员在叶片和果实中有不同的表达特性。     

低磷条件下VD_3对大鼠小肠NaPi-Ⅱb mRNA表达及磷吸收的调控

【目的】本试验旨在研究低磷条件下VD3对磷吸收的调节作用。【方法】选择40只断奶后大白鼠(雄),随机分为0.2%(低磷组)和0.6%(正常磷组)两磷(总磷)水平组,每组5个重复,每重复4只大白鼠,试验期7d。试验前6d,每组每只大白鼠肌注VD3代谢抗干忧药物EHDP(二磷酸盐);宰前的12h,每组2只老鼠以600ng/kg.wt剂量注射VD3,为试验组;另2只不注射,为对照组。第7天早晨屠宰、取样。测定血清和骨组织中钙磷及小肠NaPi-Ⅱb载体蛋白mRNA表达量和磷的吸收等指标。【结果】(1)低磷水平对照组骨钙、骨磷分别比正常磷水平低3.33倍(P0.01)和3.03倍(P0.01)。两磷水平试验组VD3含量比对照组高3.08倍和2.32倍,差异极显著;(2)0.2%磷水平小肠各段和肾脏Na+/PiⅡb mRNA表达量试验组皆极显著高于对照组;(3)两磷水平试验组4个部位磷的吸收皆显著或极显著高于对照组,0.2%磷水平试验组较对照组磷吸收4个部位分别提高:51.76%、62.68%、57.79%、47.37%。0.6%磷水平组分别提高18.19%、39.22%、54.72%、39.83%。【结论】(1)低磷情况下,VD3是调节磷吸收的一个重要因素,补充VD3可提高NaPi-Ⅱb转运蛋白mRNA的表达和磷的吸收;(2)VD3对磷吸收的提高作用随着磷水平的增加而减弱。     

盐芥STZ转录因子基因的克隆及序列分析

【目的】克隆盐芥STZ转录因子基因,对其进行序列分析,为进一步研究ThSTZ转录因子在逆境应答中的作用奠定基础。【方法】利用GenBank数据库中盐芥STZ转录因子的EST序列设计特异引物,通过3′RACE技术克隆ThSTZ基因的全长序列,应用生物信息学手段对该基因编码蛋白的结构与功能、亚细胞定位等进行预测,并对其编码氨基酸序列的同源性和系统进化进行分析。【结果】盐芥STZ转录因子基因全长717 bp,编码238个氨基酸。其编码蛋白含有2个C2H2型锌指结构域,位于细胞核内,属于C2H2家族转录因子;多重序列比对和系统进化分析表明,盐芥STZ转录因子与拟南芥属植物同源蛋白的相似性最高。【结论】获得了ThSTZ转录因子基因的全长序列,为进一步探讨ThSTZ转录因子在逆境应答中的功能奠定了基础。     

磷胁迫下羊草的响应及磷响应相关基因表达分析

【目的】磷是植物生长发育所必需的大量营养元素,研究无机磷酸盐（inorganic phosphate,Pi）胁迫下羊草的响应,筛选不同浓度Pi胁迫下的内参基因,并分析Pi响应相关基因的表达,为羊草Pi胁迫响应的分子机制研究提供基础数据。【方法】以羊草幼苗为材料,进行不同浓度Pi处理培养,对羊草的株高和根长进行检测,利用钒钼黄比色法检测羊草植株中Pi的含量。根据羊草转录组数据选取7个候选内参基因,从NCBI核酸序列数据库选取1个候选内参基因,对羊草不同处理材料进行总RNA提取和cDNA合成,利用qRT-PCR对候选内参基因的表达进行检测,并通过geNorm、NormFinder和Bestkeeper软件对其稳定性进行评估。根据筛选获得的较稳定内参基因,对Pi响应基因的qRT-PCR检测数据进行相对定量分析。【结果】表型观测结果显示,无论是低Pi还是高Pi胁迫都使得羊草的生长减缓;株高对低Pi或缺Pi胁迫较为敏感,根长对高Pi胁迫较为敏感;并随着处理浓度的增加羊草中Pi的含量也增加。qRT-PCR溶解曲线分析显示8个候选内参基因均具有单一的溶解峰,基因表达谱分析表明8个候选内参基因的CT值范围是17.16—26.61,其中,LcGAPDH的表达丰度最高为17.16—20.22,Lc18SrRNA的表达丰度最低为23.28—26.61,CT值变异系数最小的为LcARPT（2.09%）,最大的为LcTUA（6.8%）。综合geNorm、NormFinder和Bestkeeper稳定性排名,通过计算几何平均数,获得8个候选内参基因综合稳定性排名,其中排名靠前的3个基因分别为Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α,排名最后的2个基因为LcTUA和LcTUB。分别以Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α作为内参基因,qRT-PCR相对定量表达分析结果显示,与对照相比,LcPHO1-2的表达受低Pi或者缺Pi诱导;LcPAP2的表达受高Pi诱导;而LcPAP27的表达同时受低Pi和高Pi下调。【结论】低Pi和高Pi胁迫均使羊草生长受阻,羊草地上组织与地下组织对Pi胁迫响应的模式不同。筛选出3个表达较为稳定的内参基因Lc18SrRNA、LcCAP和LcEF1α。LcPHO1-2和LcPAP2分别参与了羊草对低Pi和高Pi的应答响应,LcPAP27同时参与了羊草对低Pi和高Pi的响应进程。