RNA病毒质控物研究进展

RNA质控物是病毒分子生物学检测的关键因素,病毒颗粒和裸露的RNA片段由于有生物传染性,易降解而适合用作RNA质控物。近年来发展起来的内含靶RNA序列的盔甲RNA生物安全性高、不易降解、能全程参与病毒核酸的提取和反应,是理想的RNA病毒质控物。     

猪流感的防控及检测样品采集方法

1猪流感及其防控意义猪流感(swine influenza,SI)呈世界性分布,各地均有流行,发病率高[1]。猪流感能直接引起患病猪的死亡,并使患病猪的生长或生产不良,对养猪业的危害极大,研究表明康复猪和隐形感染猪是以后猪流感的传染源,猪流感作为一种主要的免疫抑制疾病,在猪场中普遍存在且难以根除[1,2]。猪在感染猪流感病毒(SIV)后,易导致呼吸系统疾病的并发或者混合感染,加剧流感病毒危害性,加大死亡率。猪也是流感病毒"混合器",极易产生流感病毒基因重排带来极其严重的公共卫生安全问题,因此猪流感的防控极其重要。     

猪圆环病毒1型和2型核酸定性标准样品的研制

为了研制猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)核酸定性标准样品,分别将PCV1和PCV2病毒全序列克隆至pMD18-T载体中并进行稀释分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、定值和临床试用。结果:制备的标准样品的参考值分别为:1.33×10⁴ copies/μL(PCV1)和1.11×10⁴ copies/μL(PCV2);样品均匀;-20℃可稳定保存24个月以上,4℃可稳定2个月以上。经国家标准化管理委员会组织的专家评审,达到了国家标准样品的要求,可作为核酸扩增检测的猪圆环病毒核酸标准样品。     

猪流感病毒LAMP检测方法的建立

本试验针对猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）NP基因保守区域设计并合成6条引物,建立了SIV的环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,该方法可特异性检测H1N1、H1N2、H3N2、类禽H1N1亚型SIV及甲型H1N1流感病毒,但不能检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、日本乙型脑炎病毒;该方法的最低检测量为100拷贝/μL质粒DNA。结果表明建立的LAMP方法具有较高的敏感性和特异性,可用于SIV的快速检测。     

猪流感病毒分型基因芯片的建立和初步应用

根据流感病毒血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）亚型基因序列间的差异性,分别设计H1、H3、H9、N1和N2的特异分型引物,并根据M基因设计A型流感病毒的通用引物。RT-PCR扩增猪流感病毒各亚型HA、NA和M基因的特异片段,克隆至pMD18-T构建重组质粒,制备探针。将各探针按一定的阵列点加到硝酸纤维素膜上,制成基因芯片。并对217份不同地区的样品进行检测。结果表明：该芯片可以同时检测待检样品中5种亚型A型流感病毒,并显示了较高的灵敏度和特异性,灵敏度比PCR高1个稀释度,比病毒分离高2个稀释度。该方法的建立为猪流感的检测及猪流感病毒各亚型在猪群中的流行病学调查提供了一种快速、灵敏和高通量的手段。     

伪狂犬病病毒核酸检测能力验证样品制备及其应用

能力验证样品的制备是实验室病原核酸检测能力验证的难点和核心内容,本研究以伪狂犬病病毒南阳株细胞培养物为材料,通过高温处理的方式灭活病毒,研制了伪狂犬病病毒核酸检测的能力验证样品,经均匀性和稳定性检验证实样品达到中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品的要求。利用能力验证样品,设计和实施了"BIQTC-2013-01《猪伪狂犬病病毒核酸检测》能力验证计划",共有7家实验室参试,验证满意率达100%。伪狂犬病病毒核酸检测能力验证样品的研制和在能力验证计划中的应用,为评估我国各级实验室伪狂犬病病毒核酸检测的能力提供了较有价值的借鉴和参考。     

用核酸探针检测新城疫病毒的研究

用光敏生物素标记鸡新城疫ｃＤＮＡ制备核酸探针，经斑点杂交和碱性磷酸酶显色后，探针同该ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物，ＰＣＲ产物重组子和新城疫强，弱毒株呈现阳性反应，与ＩＢＶ，ＩＬＴ，ＭＧ和正常尿囊液等均呈阴性杂交反应，田间病料的杂交试验也表明该ｃＤＮＡ探针是且特异的检测方法。     

猪流感病毒基因芯片检测技术的研究

根据猪流感病毒(SIV)的M基因序列设计了1对特异性引物M1/M2,扩增出大小为229 bp的目的片段.针对这个基因片段,再设计合成4条寡核苷酸探针,其中反向引物的5'端用荧光素Cy3标记.以荧光标记不对称PCR技术为基础,通过将单链PCR产物与芯片杂交实现对SIV的检测,建立SIV的基因芯片检测方法.利用该方法对39份猪组织样品进行检测,与RT-PCR检测方法相比,本方法具有良好的特异性和敏感性.试验结果表明,用该方法快速检测组织中SIV是可行的,对该病的快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义.     

地高辛标记的核酸探针检测EDS病毒的研究

地高辛标记的核酸探针检测ＥＤＳ病毒的研究王雪敏（邯郸农业高等专科学校牧医系河北永年０５７１５０）郑明球蔡宝祥陈溥言（南京农业大学动物医学院１材料与方法１．１地高辛标记的ＥＤＳ病毒核酸探针制备将ＥＤＳ病毒ＮＥ４株（南京农大传染病教研室提供）鸭胚尿囊液（...     

不同亚型猪流感病毒双重RT-PCR快速检测

参照已发表的文章合成4对引物,分别能特异扩增出H1、H3、N1和N2片段,应用同时鉴别3个血清亚型H1N1、H1N2和H3N2的双重RT-PCR快速鉴别诊断猪流感的方法。从临床病料中检测出阳性后进行病毒分离鉴定,符合率为100%,表明该方法具有很高的使用价值。     

猪流感病毒研究进展

猪流感是由猪流感病毒引起的一种呼吸道传染病。此病在世界各地都有发生,危害严重,经济损失巨大,并对人类的健康构成威胁。猪流感病毒属于正黏病毒科A型流感病毒属,病毒粒子呈x多形态。该病毒对热、消毒剂敏感,对干燥和低温的抵抗力强。其分子特性为多节段的RNA病毒,由8个片段组成,分别编码lO种蛋白质。猪流感病毒能够在多种动物的细胞和鸡胚增殖。病毒具有血凝活性,但不同毒株的抗原性无明显的区分。由于病毒受到抗体的压力很大,因此病毒的变异频繁,其机理涉及分子水平的抗原漂移和抗原转变。文章对病毒的理化性质、生物学特性、分子特性、病毒的蛋白和基因变异等方面的研究情况进行了综述。     

用核酸探针检测鸡传染性贫血病毒

用核酸探针检测鸡传染性贫血病毒许兰菊王丽李慧张书松（河南农业大学牧医工程学院，郑州４５０００２）鸡传染性贫血病（ＣＩＡ）是由鸡贫血病毒（ＣＡＶ）引起雏鸡再生障碍性贫血的一种免疫抑制性疾病。病鸡全身淋巴组织萎缩、皮下和肌肉出血，有较高的死亡率，该病又称...     

核酸探针检测犬瘟热病毒方法的建立和初步应用

根据犬瘟热病毒（CDV）基因序列的结构特点,在其编码核衣壳蛋白的高度保守基因区内,设计合成一对特异性引物.以RT-PCR技术从CDV基因中扩增出了一段长度为430 bp的核苷酸cDNA,并制备出地高辛标记的CDV核酸探针.特异性检测结果表明,该探针能与CDV标准株和地方分离株核酸发生特异性杂交,而与对照的NDV、MV等病毒的核酸杂交反应均为阴性.敏感性检测结果表明,该探针对CDV的检出量可达到0.1 pg.用所制备的核酸探针对某宠物诊所疑似犬瘟热病例进行临床诊断初步应用试验,表明该标记探针完全可用于CDV的临床检测.     

猪圆环病毒核酸检测技术研究进展

猪圆环病毒(Porcine Ci rcovirus,PCV)包括PCV1、PCV2和PCV3以及新鉴定的PCV4。其中PCV1无致病性,PCV2主要引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)等猪圆环病毒相关疾病,PCV3多见于皮炎肾病综合征(PDNS)和繁殖障碍症状的猪群,PCV4首次鉴定于患有呼吸道症状、肠炎和PDNS的病猪。由于猪圆环病毒通常造成PMWS、PDNS以及PRDC等猪圆环病毒相关疾病,因此,了解这些疾病的临床特征是初步诊断PCV感染的基础。实验室检测方法常作为临床上确诊PCV感染或PCV与其他猪病原体鉴别诊断的有力工具,越来越多的检测方法对临床上检测PCV提供了更多的选择。因此,本文就猪圆环病毒实验室核酸检测方法进行汇总,以期对临床上选择合适的方法检测圆环病毒提供参考。     

rNP-ELISA检测抗猪流感病毒抗体工作条件的优化

猪流感是生猪养殖的国家普遍都会遇到的猪的呼吸道病[1]。虽然HI检测已经被作为可信赖的抗流感病毒抗体的检测方法[2]。但是,应用ELISA方法检测抗体具有明显的优势,对于待检血清不需要进行任何处理,而且也不必要对应用的抗原进行更换与选择[3]。试验采用的包被抗原为重组NP蛋白     

猪流感病毒RT-PCR快速检测方法的建立

根据猪流感病毒M基因序列设计了一对扩增M基因684 bp片段的特异性引物,建立了RT-PCR快速诊断猪流感的方法,采用该方法检测出H1、H3、H5和H9 4个亚型猪流感病毒标准参考株为阳性,猪副黏病毒、圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果呈阴性.RT-PCR最少可检测到1 000EID50的病毒量核酸,可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒.     

地高辛标记核酸探针检测牛粘膜病病毒

本课题建立了地高辛标记核酸探针检测牛病毒性腹泻－粘膜病病毒（ＢＶＤＶ）的诊断方法。根据ＢＶＤＶ基因序列的结构特点,在编码非结构蛋白ｐ１２５高度保守基因区内,设计合成一对特异性引物。以ＰＣＲ技术从ＢＶＤＶ基因重组质粒中扩增出了ＢＶＤＶ特异的、保守的４００ｂｐ核苷酸片段,经纯化后,地高辛标记,制备牛病毒性腹泻病毒的特异性核酸探针。通过检测ＢＶＤＶ细胞培养物、相关病毒及核酸载体和ＢＶＤＶ细胞培养物的总Ｒ     

猪圆环病毒2型重组腺病毒核酸扩增检测标准样品的研制

为研制用于猪圆环病毒2型(PCV-2)核酸扩增检测(NAT)质量控制的标准样品,本研究将猪圆环病毒2型QD/2014株ORF2连接到缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5 CMV K-NpA上,构建了重组穿梭质粒CMV-PCV-2-ORF2。将其与骨架质粒pacAd5 9.2-100线性化后共转染HEK293T细胞,经胞内重组获得了内含PCV-2-ORF2的重组腺病毒pacAd5 CMV-ORF2。采用PCR和基因测序方法对重组病毒鉴定后进行大量培养、分装和冻干,经均匀性和稳定性检验后对其进行了定值。结果表明,制备的标准样品均匀、稳定,PCV-2-ORF2基因含量为8.17×10~9 GEq/mL,在HEK293细胞上的TCID_(50)为3.56×10~7/0.05 mL。本标准样品的研制成功为核酸检测标准物质制备开辟了一条新途径。     

猪流感的研究进展

猪流感(Swine Influenza,SI)是由正粘病毒科流感病毒属的猪流感病毒(Swine Influenza Virus,SIV)引起的一种急性、高度接触传染性的猪呼吸道疾病.SIV不仅危害猪群,而且同时具有感染人和禽的潜力.因此,猪流感具有重要的兽医和人类公共卫生学意义,而疫苗免疫是预防和控制猪流感暴发的有效措施和主动性战略,亦是切断"禽-猪-人"的种间传播链的根本手段.