基于牛蒡根的灵芝固体发酵菌质化学成分的初步分析

以牛蒡根为发酵基质,初步探究灵芝固体发酵所获菌质中多种化学成分的变化。利用可见分光光度计、高效液相色谱仪及定氮仪等测定了牛蒡根原药材和牛蒡根灵芝菌质中多糖、总三萜酸、总黄酮、核苷及蛋白质含量,并进行HPLC指纹图谱分析。牛蒡根经灵芝菌丝体发酵后,多糖含量由9.94%降低至2.76%,总三萜酸含量从无升高至0.14 mg·g^-1,总黄酮含量由3.47%降低至0.34%,4种核苷总量由861.05μg·g^-1升高到1 113.49μg·g^-1,且新合成了腺苷,蛋白质含量由13.38%升高至17.28%。HPLC指纹图谱显示牛蒡根在灵芝发酵前后化学成分差异较大。灵芝固体发酵使牛蒡根多糖和黄酮含量降低,核苷和蛋白质含量升高,并新产生三萜酸和腺苷,具有明显的生物转化作用。     

不同种的灵芝醇提物对肝癌细胞增殖的抑制作用

为探讨7种不同种的灵芝中三萜及甾醇含量及子实体醇提物对人肝癌细胞HepG2和SMMC-7721增殖的抑制作用,采用紫外-可见分光光度法测定三萜及甾醇含量,采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定不同种的灵芝子实体醇提物对肝癌细胞增殖的抑制效果。结果表明:松杉灵芝(Ganoderma tsugae)、黄边灵芝(G.luteomarginatum)、赤芝(G.lucidum)、紫芝(G.sinense)、无柄灵芝(G.resinaceum)、无柄紫灵芝(G.mastoporum)、皱盖假芝(Amauroderma rude)三萜及甾醇含量依次降低,除无柄紫灵芝和皱盖假芝外,其余5种的含量均符合《中华人民共和国药典》的要求;7种灵芝的子实体醇提物均具有抑制HepG2细胞增殖的作用,半抑制率(IC_(50))分别为102.12、143.84、92.17、121.11、92.74、163.11、40.25μg/mL;对于SMMC-7721细胞,除皱盖假芝具有较小的抑制作用外,IC_(50)为166.21μg/mL,其余6种均无明显的抑制作用。7个种中皱盖假芝对肝癌细胞增殖的抑制作用效果最好,但其三萜及甾醇含量却最低,因此推测皱盖假芝的抗肿瘤活性成分可能除三萜及甾醇外还包含其它成分。     

灵芝菌丝中三萜酸的提取研究

采用经典回流法试验了灵芝(Ganoderma lingzhi)发酵菌丝体中三萜酸的提取工艺。单因素试验表明:灵芝菌丝三萜酸最佳提取溶剂为无水乙醇、液料比为10:1(mL/g)、提取时间2 h、提取次数为2次。在单因素试验基础上,采用Box-Behnken试验设计结合响应面分析法对灵芝菌丝三萜酸的提取工艺进行优化,建立了预测三萜酸提取的多项式模型:Y=0.52+0.022A+0.027B+0.064C+0.021AB-0.013AC+0.010BC-0.056A~2-0.094B~2-0.057C~2,经响应面最优分析,菌丝三萜酸提取的最优工艺参数为液料比为11:1(v/m,mL/g)、提取时间2 h、提取次数3次。在此条件下,灵芝菌丝三萜酸提取率可达0.537mg/g干菌丝,与预测值(0.542 mg/g干菌丝)相比,相对标准偏差为0.65%。     

不同生长期灵芝子实体三萜酸和多糖含量测定

分别采用HPLC法和药典法测定不同生长期灵芝子实体中三萜酸和灵芝多糖的含量。HPLC法色谱条件:色谱柱为Alltech Alltima C_(18)柱(150 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-0.04%甲酸溶液,检测波长254 nm,流速1.0 m L/min,柱温15℃。结果:灵芝酸C_2、灵芝酸G、灵芝烯酸B、灵芝酸B、灵芝烯酸A、灵芝酸A、灵芝酸D、灵芝烯酸D和灵芝酸C_1的线性范围为5.9~42.0μg/m L,r为0.999,加样回收率为96.42%~104.14%。表现方法可行、重现性好,能定量测定灵芝中三萜酸和多糖的含量。     

灵丹菌质双向发酵工艺及药效品质研究

采用双向固体发酵工程技术,以灵芝为发酵菌株,在含有不同比例丹参边角料的培养基中进行发酵,观察了不同培养基中菌丝的生长情况,测定了发酵产物（灵丹菌质）中多糖、蛋白质、三萜、丹参酮的含量变化,并研究了其提取物对小鼠活血化瘀功效的影响。结果表明灵丹菌质的最佳发酵组合为组合4,发酵40d,多糖含量26.48μg·g-1,蛋白质含量为397.24μg·g-1,灵芝酸三萜含量为4.92%。药效学实验显示,灵丹菌质组合4具有活血化瘀的药效,优于丹参药材。     

不同脂肪酸对灵芝液体发酵的影响

研究硬脂酸、亚油酸和棕榈酸对灵芝液体发酵的影响.结果表明,3种供试脂肪酸都能促进灵芝菌丝体生物量的积累;硬脂酸有利于灵芝胞外多糖的产生,在添加浓度为1.0 g/L时,胞外多糖量达到(1 066.74±11.27)mg/L,是对照的3.37倍;亚油酸利于胞内多糖的合成,在浓度为1.5 g/L时,胞内多糖量达到(620.90±7.11)mg/L,是对照的2.56倍;另外,亚油酸还对灵芝胞内三萜和胞外三萜量表现出较强的促进作用,在浓度为2.0 g/L时,胞内及胞外三萜量分别达到(394.23±10.32)mg/L和(551.32±6.22)mg/L,分别比对照提高了1.13和1.12倍;而硬脂酸和棕榈酸的添加则降低胞内和胞外三萜的量.     

灵芝化学成分与质量控制方法的研究综述

综述灵芝活性成分和质量控制方法的研究进展。灵芝化学成分有三萜类化合物,核苷类化合物,呋喃类衍生物,甾醇类化合物,生物碱类化合物,氢醌及其他类化合物,脑苷及多肽、氨基酸类化合物,多糖、糖肽类化合物,以及有机酸、长链烷烃类化合物。其已有的质量控制方法研究包括比色方法测定灵芝总三萜酸含量,HPLC方法测定灵芝三萜酸,灵芝HPLC指纹图谱研究,高效毛细管电泳法测定核苷类化学成分的含量,灵芝中甾醇类化合物分析,灵芝孢子油中脂肪酸含量测定等。     

38株灵芝子实体抗肿瘤质量的生物评价

针对38株灵芝子实体样品,开展醇提物抑制He La、SK-OV-3肿瘤细胞增殖活性和三萜含量测定研究,对其抗肿瘤质量进行评价,筛选具有开发抗肿瘤产品潜力的优质菌株。实验结果表明,33号、34号2株灵芝对He La细胞和SK-OV-3细胞均具有较强的杀伤作用,对2株细胞增殖抑制IC50分别为16.55μg·m L-1、10.2μg·m L-1和31.9μg·m L-1、30.64μg·m L-1,可作为优质资源进行进一步开发。各菌株灵芝子实体的三萜含量在1.372 mg·g-1~6.184 mg·g-1之间,不同菌株子实体间三萜含量差异较大,细胞增殖抑制活性与三萜含量间不具有相关性,提示灵芝抗肿瘤原料质量评价宜考虑补充生物质量评价方法。     

灵芝三萜和多糖提取工艺研究

采用醇提法、水提法分别提取灵芝三萜和多糖,并与超声波辅助提取效果进行比较。结果,灵芝三萜的最佳提取条件为：采用10倍无水乙醇,在60℃提取60 min,提取2次,三萜提取率为0.76%;灵芝多糖的最佳提取条件为：用90℃热水提取90 min,料（g）液（mL）比1∶20,提取2次,多糖提取率为2.67%。超声波辅助提取,灵芝三萜和多糖的提取率可分别提高20.5%和13.2%。     

三株野生重伞灵芝的鉴定及其多糖、三萜含量分析

采用形态鉴定、ITS鉴定和ITS-RFLP分子标记方法对采集自福建的3株野生灵芝进行鉴定,并将其生物学特性及化学成分与赤芝(Ganoderma lingzhi)菌株ZK进行比较。结果表明:采集的3株野生灵芝为重伞灵芝(G.multipileum)。与赤芝菌株ZK相比,3株野生重伞灵芝菌株LQ、LJ和Y1菌丝生长速度快(P0.01),LQ、LJ、Y1最适生长温度分别为32、32、34℃,均高于赤芝ZK;供试菌株均偏好酸性生长环境;重伞灵芝LQ和Y1的产量分别为每袋(12.1±1.3)、(11.7±0.9)g,达到ZK产量(17.6±1.8)g的66%以上。Y1与LQ的子实体多糖含量分别为(12.9±0.1)、(10.7±0.3)mg/g,高于赤芝ZK的子实体多糖含量(9.2±0.2)mg/g(P0.01);LJ、Y1的三萜含量约为7.5mg/g,LQ的三萜含量为(6.5±0.3)mg/g,分别是ZK三萜含量的84.27%和73.03%。从HPLC图谱可知重伞灵芝有许多赤芝没有的峰,三萜酸的种类比较丰富。     

灵芝孢子破壁前后在模拟人体消化环境中活性成分的差异

目的：研究灵芝孢子在破壁前后,其内的灵芝三萜和灵芝多糖在人体消化系统内的差异。方法：采用模拟人体消化环境,用香草醛-高氯酸法[1]和蒽酮-硫酸法[2]检测孢子内的三萜和多糖含量。结果：孢子在破壁前后的三萜含量分别为0.29%和5.94%,多糖含量则分别为10.29 mg/g和11.44 mg/g;人工胃液处理的环境下,释放到人工胃液内的破壁孢子多糖含量大于未破壁孢子（0.98 mg/mL>0.62 mg/mL）;沉淀再经过人工肠液的处理后,人工肠液的多糖均未检出。破壁孢子沉淀的三萜含量大于未破壁孢子（6.68%>1.58%）,结论：灵芝孢子破壁后其有效成分更易于在人体消化环境内释放。     

基于偏最小二乘法的赤芝子实体三萜类化合物抗氧化谱效关系的研究

测定了64株赤芝(Ganoderma lucidum)子实体醇提物清除二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基的活性和三萜指纹图谱,采用遗传算法筛选其指纹图谱中的26个共有峰,并标定出其中15个特征峰,运用偏最小二乘回归分析方法(partial least squares regression,PLSR)对指纹图谱中26个三萜峰与醇提物清除DPPH自由基的活性进行关联分析,建立了赤芝子实体三萜类化合物的抗氧化谱效关系方程。在赤芝子实体醇提物三萜指纹图谱的26个共有峰中,峰S1、S4、S9、S10和S26的峰面积与醇提物清除DPPH自由基的活性呈显著正相关关系;峰S3、S11、S15、S18、S19、S22和S25的峰面积与醇提物清除DPPH自由基的活性呈显著负相关关系。分别测定鉴定出的15个峰对应的三萜化合物对DPPH自由基的清除活性,发现与清除DPPH自由基活性呈显著正相关的三萜化合物灵芝酸C_2(S4)、灵芝酸B(S9)、灵芝酸LM_2(S10)、灵芝醛A(S26)对DPPH自由基的清除活性明显高于其他三萜化合物,与清除DPPH自由基活性呈显著负相关的三萜化合物灵芝酮三醇(S18)、灵芝萜酮二醇(S22)无清除DPPH自由基的活性。另外,利用H_2O_2诱导的PC12细胞损伤模型进一步验证灵芝酸C_2、灵芝酸B、灵芝酸LM_2、灵芝醛A和灵芝萜酮二醇在细胞水平的抗氧化活性,发现灵芝酸C_2、灵芝酸B、灵芝酸LM_2、灵芝醛A具有明显的保护神经细胞氧化损伤的活性,而灵芝萜酮二醇对神经细胞的氧化损伤无保护作用。结果表明,本研究建立的赤芝子实体三萜类化合物抗氧化谱效关系方程具有较高的准确性,能够较全面地反应赤芝子实体醇提物中不同三萜化合物与其抗氧化活性的相关性,可快速锁定有效成分以指导活性成分的分离纯化工作。此外,该方法也为赤芝子实体的质量控制提供了更为有效和准确的方法。     

灵芝超声波循环提取物成分及活性物质

采用超声波循环提取获得一种新的灵芝提取物。分析表明,其蛋白质34.41 g.100-1.g-1、可溶性粗多糖40.0 g.100-1.g-1和矿质元素磷1.66 mg.g-1的含量分别高于普通灵芝提取物32.96%、29.45%和30.71%。提取物中均含有18种氨基酸,全氨基酸总量为17.43 g.100-1.g-1,较普通提取物12.95 g.100-1.g-1高34.57%;此外,还检出2种天然活性成分--γ-氨基丁酸和牛磺酸,含量分别为21.92 mg.100-1.g-1和45.97 mg.100-1.g-1。液相质谱分析结果:从提取物中分离检测到至少13个清晰的分子离子峰,m/z范围为266.1~678.5,与香豆素、甾醇类、三萜酸及三萜皂苷等小分子天然活性成分的分子量信息相匹配。     

一年生和两年生桑黄子实体的成分和生物活性

测定了一年生、两年生桑黄(Phellinus baumii)子实体水提物中的粗多糖、醇提物中的黄酮和三萜含量,并研究了不同生长年份子实体水提粗多糖和醇提物体外刺激淋巴细胞生长、抑制L1210肿瘤细胞生长的作用及抗氧化活性.结果表明,一年生桑黄子实体醇提物中黄酮、三萜和水提物中粗多糖的含量略高于两年生桑黄;当水提粗多糖浓度为10 μg/mL时,SH2-W对体外淋巴细胞的增殖率高于SH1-W,当浓度为50和200 μg/mL时,两组样品间无显著差异;两种桑黄醇提物对体外肿瘤细胞L1210的抑制作用随浓度增大而增强,相同剂量下,两组样品间无差异; 相同浓度下SH1-E对H2O2的清除率高于SH2-E,但两组样品DPPH·的清除率和还原力无显著差异.     

两株西藏白肉灵芝菌株特性初探

对西藏林芝地区的白肉灵芝(Ganoderma leucocontextum)菌株G-122和G-241进行鉴别分析,并对其栽培性状、有效成分含量和提取物功能等方面进行研究。基于形态学特性和ITS分析,2个菌株均鉴定为白肉灵芝。二者菌丝对峙培养产生明显拮抗线,菌丝体生物量差异显著(G-241高于G-122),子实体颜色不同(G-241和G-122分别为红褐色和黄褐色),G-241子实体单菇重高于G-122;有效成分含量差异也较大,G-122粗多糖含量高而G-241总三萜含量高;菌株G-122、G-241醇提物对乳腺癌MT-1细胞IC_(50)值分别为265.2和225.6μg/mL。实验结果表明菌株G-122和G-241为不同菌株。     

定向采收‘沪农灵芝1号’高三萜和水溶性多糖原料研究

采用超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS/MS）法和高效排阻色谱-多角度激光散射（HPSEC-MALLS）法检测灵芝（Ganoderma lucidum）‘沪农灵芝1号’不同生长期（接种后2～7个月，分别命名为P1～P6）子实体和菌基中三萜和水溶性多糖含量，并结合子实体和菌基的产量计算三萜和水溶性多糖的产量。结果表明：子实体中灵芝酸C2、G含量在P1、P2期较高，灵芝烯酸B和灵芝酸D、F、DM含量在P2期最高，灵芝酸B、A、S、T和总三萜含量在P1期最高；菌基中灵芝酸C2、A、D、DM和灵芝烯酸B含量在P1期最高，灵芝酸G含量在P 5期最高，灵芝酸B、S含量在P 6期最高，灵芝酸F含量在P 1、P 6期较高，灵芝酸T、总三萜含量在P 5、P 6期较高。子实体中灵芝酸C2、G、B、D、F、DM，灵芝烯酸B，总三萜产量在P2期最高；灵芝酸A产量在P3期最高；灵芝酸S、T产量在P1期最高。菌基中灵芝酸C2、G、B、A、D、F、DM，灵芝烯酸B产量在P1期最高；灵芝酸S、T产量在P2期最高；总三萜产量在P1、P2期较高。子实体和菌基中的水溶性多糖含量和产量均在P1期最高。研究结果将为‘沪农灵芝...     

膜下滴灌在灵芝孢子粉栽培中的应用效果研究

以常规大棚模式栽培为对照,以灵芝菌盖直径、单朵鲜芝重量、孢子粉产量、灵芝孢子粉的总多糖、总三萜、蛋白质和有机锗含量为指标,开展膜下滴灌对灵芝孢子粉栽培的效果研究,为灵芝孢子粉高产优质栽培提供依据。研究结果表明:膜下滴灌栽培的单朵鲜芝重量、孢子粉产量、总三萜含量、蛋白质含量、有机锗含量分别比常规大棚模式提高了42 g/朵、90 g/m~2,1.2%、1.71%、0.001μg/100 g,差异显著。灵芝菌盖直径和灵芝孢子粉总多糖差异不显著,说明膜下滴灌技术在灵芝孢子粉栽培良好的应用效果,前景广阔。     

液体发酵高产灵芝多糖培养基的筛选与配方优化

以灵芝多糖的得率为响应值,结合相关性分析及正交优化法,设计出灵芝液体发酵的最佳培养基配方。试验结果表明:灵芝发酵过程中,p H的变化与灵芝菌丝生长速度相关,但与灵芝多糖得率不相关。而灵芝菌丝球数、菌丝体生物量与灵芝多糖得率都有较强的正相关性,分别是0.789和0.829。以蛋白胨为基础培养基,黄豆粉、酵母泥可获得最高的灵芝多糖喷雾干燥粉,分别为2.24 g/L和1.89 g/L,玉米粉、麸皮表现一般,中药渣(黄芪、甘草、金银花)效果较差。经正交优化,最优培养基配方为:黄豆粉10 g/L,酵母泥5 g/L,葡萄糖10 g/L,添加KH2PO4 1 g/L,Mg SO4·7H2O 0.5 g/L。100 L发酵罐验证试验(26℃、发酵72 h),最终收获灵芝多糖喷雾干燥粉130 g(得率4.9%)。     

八种灵芝菌株的比较及筛选

比较了8个灵芝菌株的菌丝生长速度、菌丝体生物量及多糖含量等指标。试验结果表明,在PDA培养基上,沂山灵芝菌株菌丝生长速度最快,为9．91mm／d;经150r／min、25℃液体摇床培养10d后,安丘大灵芝菌株获得的菌丝体生物量最高,为1．22g／100mL;济宁圆芝菌丝体中的多糖含量最高,为117．59μg／mg。经过综合分析比较,初步认为沂山灵芝为优势菌株。     

适合孢子粉高产的赤灵芝栽培配方筛选

为充分利用湛江市本地甘蔗渣、桑屑枝条、土沉香渣等秸秆资源，降低赤灵芝生产对木材原料的依赖，通过研究3个配方菌丝生长速度、子实体和孢子粉产量、品质(多糖、三萜)、抗氧化活性等，筛选出适合本地的优良赤灵芝栽培配方。结果显示，添加了甘蔗渣的配方2，菌丝生长速度最快(0.75 cm·d^-1)，孢子粉产量最高(14.45 g/袋)，且多糖和三萜总含量也高于其他2个配方。添加土沉香渣的配方3，菌盖直径(7.55 cm)、子实体鲜质量(36.79 g/袋)、总产量最高，但多糖和三萜总含量不如其他2个配方。添加了桑屑的配方1，赤灵芝的总抗氧化活性稍高于其他2个配方，但无显著差异。3个配方下子实体的三萜含量高于孢子粉，而孢子粉的多糖含量高于子实体。综合分析，配方2是实现梅灵3号灵芝孢子粉高产的较优栽培配方，适合在当地推广应用。