PT-PCR方法在实验小鼠肝炎病毒检测中的应用

实验应用RT-PCR方法对来自不同单位、6个品系、不同等级的84只小鼠进行了MHV检测.结果显示:MHV阳性小鼠35只,阳性率为41.67%;其中普通级小鼠29只,阳性18只,阳性率为62.07%;SPF级小鼠55只,MHV阳性小鼠17只,阳性率为30.91%.     

PT-PCR方法在实验小鼠肝炎病毒检测中的应用

实验应用RT-PCR方法对来自不同单位、6个品系、不同等级的84只小鼠进行了MHV检测。结果显示：MHV阳性小鼠35只,阳性率为41．67％;其中普通级小鼠29只,阳性18只,阳性率为62．07％;SPF级小鼠55只,MHV阳性小鼠17只,阳性率为30．91％。     

人类MCP和CD59双基因导入小鼠的整合及传代研究

将人类MCP(膜辅因子蛋白)和CD59(终末阶段同源限制因子)两种基因采用混合注射的方法,导入521枚昆明小鼠的受精卵原核中,得到原代转CD59基因小鼠14只,CD59的整合率为18.4%;转MCP基因小鼠12只,MCP的整合率为15.7%;转CD59 MCP双基因小鼠7只,双基因整合率为9.2%;转基因效率5%。通过5只存活的G0代转双基因小鼠和非转基因小鼠的繁殖,得到F1代转MCP小鼠14只,转CD59小鼠16只,转双基因小鼠10只;F1代双基因占33.3%。     

不同睾丸注射方法对转基因效率的影响

将pEGFP-C1质粒与脂质体混合后注入小鼠睾丸内,30d后观察睾丸形态和组织变化;检测精子和配种后仔鼠转基因阳性率,探讨小鼠睾丸网、曲精细管和睾丸间质3种注射方法对转基因小鼠生产效率的影响。结果显示:3种不同注射方法对小鼠睾丸造成损伤由大到小依次为睾丸网注射、曲精细管注射和睾丸间质注射。荧光检测小鼠精子,睾丸网和曲精细管注射法阳性率分别为(35.13±1.72)%和(15.13±1.45)%,睾丸间质注射法没有观察到阳性精子。PCR检测仔鼠,三者的转基因效率分别为33.3%、12.5%和0。     

应用PCR方法调查实验大小鼠螺杆菌感染情况

通过聚合酶链反应(PCR)对上海地区实验大鼠、小鼠的螺杆菌携带情况进行调查,并用5种啮齿动物螺杆菌特异性16SrRNA基因引物对螺杆菌属阳性样品进一步鉴定,为我国实验动物微生物等级及监测标准的制定提供参考依据。结果表明:实验大鼠阳性率为70.3%(71/101),其中清洁级、SPF级分别为69.6%(48/69)和71.9%(23/32);实验小鼠阳性率为35.8%(126/352),其中清洁级、SPF级阳性率分别为51.5%(52/101)和29.5%(74/251)。5种啮齿动物螺杆菌特异性16SrRNA基因引物进一步分析,结果显示在携带螺杆菌的107只小鼠及68只大鼠中,主要携带的是H.rodentium、H.hepaticus和H.bilis 3种。上海地区实验大、小鼠皆存在不同程度的螺杆菌感染,PCR法可用于实验大小鼠螺杆菌感染状况的初步调查和流行病学监测。     

不同品系小鼠精子冷冻及冻融精子体外受精的研究

采用小鼠精子冷冻、冻融精子体外受精的方法,进行小鼠保种、引种、生物净化及品系标准化的可行性研究,并初步探究小鼠精子冷冻的影响因素。实验选用同一年龄5种不同品系小鼠分别进行精子冷冻、复苏,并比较各品系冷冻效果及冻融精子的体外受精(IVF)率。结果显示,冷冻后各品系小鼠精子复苏存活率约在15%～50%之间;冻融小鼠精子体外受精结果随遗传背景的不同差异显著,受精率分别为:KM小鼠68.4%、ICR小鼠30.3%、DBA/2J小鼠47.2%、C57BL/6J小鼠6.8%、BALB/cA小鼠25%。冻融精子IVF得到的胚胎可以耐受体外培养。     

实验小鼠感染小鼠肝炎病毒后的抗体变化

采用MHV-A59标准毒株通过3种途径(腹腔、滴鼻、灌胃)对6个品系的实验小鼠(BALB/c、C57、nu/nu、NIH-Ⅲ、IL-4T、IL-10T)进行了病毒感染。通过检测小鼠感染后1个月内不同时段的抗体变化,发现小鼠在感染MHV后,血清转阳一般发生在感染后5-7 d,3周左右特异性IgG水平达到高峰;而特异性IgM水平出现上升时间比IgG早,3 d左右开始升高,7 d到达高峰,3周后开始下降。不同品系小鼠由于遗传背景不同,对MHV的易感性和耐受性存在明显差异。不同感染途径之间也存在着一定的差异,腹腔感染MHV的小鼠抗体转阳时间和IgG、IgM高峰水平出现的时间都较滴鼻和灌胃途径早,而滴鼻感染MHV后小鼠抗体转阳时间出现较晚,但其维持时间较长,认为MHV感染后产生免疫力的持久性在很大程度上取决于免疫途径的选择。     

RT-PCR检测实验小鼠自然和实验感染鼠诺如病毒

为了解小鼠自然感染鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的情况,采集80只实验小鼠的粪便样本,应用RT-PCR方法扩增粪便样本的MNV ORF2特异性基因(187 bp,MNVnt 5473-5659)片段.对PCR检测为阳性的粪便样本经10倍体积的PBS稀释后灌胃到4只ICR小鼠体内,1周后,将3只ICR小鼠与灌胃的小鼠同居饲养,观察小鼠是否出现异常症状,定期采集粪便做RT-PCR检测,研究小鼠实验感染MNV的情况.1个月后,处死小鼠,采集粪便、盲肠、十二指肠、脾、肝、大脑、肾、肺、心脏、胸腺、子宫、卵巢和唾液腺等器官做RT-PCR检测,研究MNV的主要感染部位.结果表明,自然感染的阳性率为13.75％(11/80);实验感染的小鼠外表健康、活泼、没有腹泻现象,阳性率为100％;主要的感染部位为小鼠的消化系统.本研究是首次在上海地区实验小鼠粪便中检测到MNV.     

鸡马立克氏病调查

主要用琼脂扩散试验,对位于呼和浩特近郊和远郊五个鸡场的鸡群作了调查,除了一个新建的仅有百日龄左右来航小鸡的鸡场,抽查血清无阳性反应外,其它四场均有不同感染程度的鸡马立克氏病存在。本院教学牧场,抽查13月龄来航、边鸡及洛岛红等品种鸡共345只,血清反应阳性鸡177只,平均阳性率为51.3%,若单计来航鸡的阳性率则高达72.5%;东营子鸡场,抽查成年鸡及青年鸡173只,血清阳性率为15.6%,幼鸡26只,仅检出1只为阳性;仆拉门更鸡场采血143份,全部阴性;内蒙古畜牧科学院鸡场,抽查约五百日龄母鸡238只,检出阳性鸡65只,血清阳性率为27.3%;讨速号鸡场抽查六月龄及五岁龄各种不同品种鸡169只,检出阳性鸡43只,血清阳性率为25.4%。凉城边鸡场送检青年边鸡三只,其中二只经用琼扩方法检查,为马立克氏病患鸡。通过以上调查,首次证明呼和浩特地区及凉城有鸡马立克氏病的流行。     

人α干扰素转基因小鼠模型的建立

[目的]建立人α干扰素（interferon-α,IFN-α）转基因小鼠,为研究IFN-α在抗病毒中的作用提供模型动物。[方法]将人IFN-α基因插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过原核显微注射法建立IFN-α转基因小鼠。[结果]通过特异性引物PCR法和South-ern杂交法检测出4只阳性转基因小鼠。分离4个转基因鼠系F1代PCR阳性小鼠血液中的淋巴细胞进行RT-PCR检测,其中3个鼠系为阳性。收集阳性小鼠血清,用ELISA方法和微量板染色测定法检测出3个转基因鼠系均有IFN-α表达。[结论]成功建立了CMV启动子启动的表达人IFN-α基因转基因小鼠,为研究干扰素抗病毒机制及对其他动物进行抗病毒感染基因工程育种研究奠定了基础。     

斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性及其流感病毒受体类型的研究

【目的】验证斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒的易感性,测定斑鸠呼吸道上皮细胞表面流感病毒受体的类型和分布。【方法】以5×104EID50/只的剂量经滴鼻、点眼途径感染A/Chicken/Beijing/2/2009（H9N2）亚型禽流感病毒,共感染8只斑鸠和8只SPF鸡,对试验斑鸠和SPF鸡进行临床症状、大体病变、组织学病变的观察及病毒抗原的定位、病毒分离和感染抗体的测定。【结果】攻毒后5d,斑鸠和SPF鸡未见异常临床表现和大体病变,病理组织学检查发现斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞均有不同程度的脱落;在斑鸠的喉头、气管上段、中段和下段上皮细胞的胞浆内检测到了大量阳性流感病毒蛋白颗粒;斑鸠咽拭子病毒分离阳性率为75%（6/8）,SPF鸡咽拭子病毒分离阳性率为100%（8/8）。攻毒后14d,斑鸠H9N2亚型禽流感病毒HI抗体阳性率为80%（4/5）,SPF鸡HI抗体阳性率为100%（5/5）。对H9N2亚型禽流感病毒受体检测结果表明,斑鸠的喉头、气管上段、中段、下段上皮细胞表面存在SAα2, 3Gal和SAα2, 6Gal两种连接键型的受体。【结论】斑鸠对H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Beijing/2/2009（H9N2）易感,且斑鸠的喉头和气管上、中、下段上皮细胞表面同时存在能够与禽流感病毒结合的SAα2, 3Gal受体和与人流感病毒结合的SAα2, 6Gal受体。     

口蹄疫病毒直接实时荧光RT-qPCR检测方法的建立

根据口蹄疫病毒VP1基因保守序列,设计出1对口蹄疫病毒引物FMD-F、FMD-R及特异性探针FMD-Pb序列,建立了一种简便、快速、高效的口蹄疫病的直接实时荧光RT-qPCR(dRT-qPCR)检测方法。结果表明,在特异性方面,对口蹄疫病毒7个血清型的检出率100%;在灵敏度方面,其与常规提取RNA方法对比,阳性检出率差别很小;在对133份未知样本检测方面,dRT-qPCR方法检出阳性88份,常规方法检出阳性84份。dRT-qPCR方法的检测结果更可靠,适于对大量样本进行检测。     

Balb/c、KM、NIH三种小鼠血常规、主要脏器质量、主要脏器系数的测定与比较

为了测定SPF级Balb/c、KM、NIH小鼠血常规、主要脏器质量、主要脏器系数并进行比较,采用Coulter-JT全自动血常规检测仪检测小鼠血常规;精确称量小鼠主要脏器质量,计算其脏器系数。结果表明,SPF级KM小鼠与Balb/c小鼠相比,血常规指标中有14项指标有显著性差异(P<0.01或P<0.05,下同),主要脏器质量指标中有8项指标有显著性差异,主要脏器系数指标中有5项指标有显著性差异;SPF级NIH小鼠与Balb/c小鼠相比,血常规中有15项指标有显著性差异,主要脏器质量指标中有10项指标有显著性差异,主要脏器系数指标中有9项指标有显著性差异。说明不同品系小鼠某些血常规值、主要脏器质量、主要脏器系数方面有较大不同。     

鸭出血性卵巢炎病毒血症研究

【目的】阐明鸭出血性卵巢炎病毒（DHOV-HB株）感染鸭后的病毒血症,为深入了解鸭出血性卵巢炎的发病机理、诊断和疫苗研究提供依据。【方法】24只250日龄北京鸭芯片标记后分别经口感染100倍稀释的DHOV-HB株（3×10⁴ELD₅₀）,并设空白对照组15只,同等条件下分别在隔离器内饲养,逐日观察10日,各组每日经翅静脉采集10只鸭血液（尽可能采集同一只鸭血液）,用于病毒分离和抗体测定。将攻毒后1-10 d的血清样本经卵黄囊途径接种6日龄SPF鸡胚,每份血清以0.1 mL/胚的剂量接种5枚SPF鸡胚,鸡胚接种后置于37℃条件下继续孵化,每日定时照胚2次,及时收获并统计24-168 h之内死亡的鸡胚,死亡鸡胚胚体经剪碎,研磨,离心后采用RT-PCR的方法检测病毒核酸,有1枚及1枚以上死亡鸡胚,且DHOV病毒核酸检测阳性,即将该鸭判为病毒分离阳性。同时采用中和试验测定攻毒后4-10 d的血清抗体,每个血清稀释度接种5枚SPF鸡胚。鸡胚接种途径及特异性死亡的判定方法同上。判定标准如下：血清原液保护80%（4/5）以上的鸡胚判为抗体阳性,保护20%-60%（1/5-3/5）的鸡胚判为抗体可疑,不保护鸡胚（0/5）判为抗体阴性。【结果】试验鸭感染DHOV后的病毒血症和免疫反应密切相关。感染后1-3 d,病毒血症出现并达到高峰,病毒分离均100%（10/10）阳性;4-6 d病毒分离率开始下降,分别为90%（9/10）、70%(7/10)和30%（3/10）阳性;7-10日血清中不再存在病毒,均为阴性(0/10)。中和试验结果表明攻毒后4 d,血清中病毒分离率下降的同时血清中即可能存在较低滴度的抗体,鸡胚死亡时间延后,此时抗体100%（10/10）阴性;攻毒后6 d的血清抗体80%（8/10）阴性,20%（2/10）可疑;攻毒后7 d 70%（7/10）阳性,10%（1/10）阴性,20%（2/10）可疑;攻毒后9 d 90%（9/10）阳性,10%（1/10）可疑;攻毒后10 d 100%（10/10）阳性。空白对照组血清病毒分离（1-10 d）和抗体检测（4-10 d）均为阴性。【结论】（1）DHOV口服感染成年鸭后,1-3 d日血清病毒分离率最高,感染后4 d 病毒分离率开始下降,感染后7 d血清病毒分离阴性。感染后7 d抗体70%（7/10）阳性,感染后10 d 100%（10/10）阳性;（2）病毒血症的持续时间与特异性免疫应答密切相关。     

转Bar基因稻谷对小鼠肝功能若干参数的影响

通过对SPF级昆明小鼠喂食含量分别为20%、40%、60%转抗除草剂(Bar)基因稻谷,繁殖F1、F2代,并持续观察F1、F2代小鼠的日常行为、肝脏器官指数及血液生化指标,研究了转抗除草剂Bar基因稻谷对小鼠肝功能若干参数的影响。结果表明:用转Bar基因稻谷喂养并未对小鼠日常行为产生明显影响。F1、F2代供试小鼠各剂量的转基因组与常规对照组小鼠肝脏器官指数无明显差异(P>0.05)。F1代小鼠中A组和C组的白/球比、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶等指标无显著性差异(P>0.05),B组的白/球比、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、乳酸脱氢酶等指标无显著性差异(P>0.05),但碱性磷酸酶指标出现显著性差异(P<0.05);F2代小鼠中A、B、C组白/球比、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶5项指标均无显著性差异(P>0.05)。F1、F2代A、B、C组的葡萄糖、甘油三酯和总胆固醇3项指标均无显著性差异(P>0.05)。在试验处理及时间内,与对照常规稻谷相比,用转基因稻谷喂养小鼠对其肝脏功能基本无影响。     

树皮藻岩藻聚糖硫酸酯的纯化及其化学结构研究

为研究树皮藻Ecklonia maxima岩藻聚糖硫酸酯的单糖组成及其化学结构,以产自南非的树皮藻为原料测定其基本成分,采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析柱对树皮藻岩藻聚糖硫酸酯粗品进行分离纯化,通过柱前衍生高效液相色谱法、红外光谱法和核磁共振波谱法测定单糖组成和化学结构。结果表明:树皮藻干基中基本营养成分分别为灰分18.59%、蛋白质9.16%、脂肪0.74%;对树皮藻岩藻聚糖硫酸酯粗品进行纯化得到4个组分,分别命名为SPF1、SPF2、SPF3、SPF4,收集冻干各组分,检测各组分得率分别为18.19%、24.02%、5.61%、4.23%,硫酸根含量分别为12.07%、5.44%、15.58%、19.30%;4个组分主要由岩藻糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖和葡萄糖醛酸组成,还含有少量的葡萄糖和木糖,其中SPF3、SPF4主要由岩藻糖和半乳糖组成,岩藻糖含量分别为70.92%和86.20%,4个组分的红外光谱显示出典型的多糖吸收峰,SPF1、SPF2在13C核磁共振谱177×10-6附近均出现糖醛酸C6信号峰,SPF3、SPF4在18×10-6附近均出现信号峰,为α-L-吡喃岩藻糖C6信号峰。     

“全胚双氟碳法”制备禽脑脊髓炎琼扩抗原的研究

用禽脑脊髓炎病毒（AEV）Van Rockel毒株接种6日龄SPF鸡胚，感染11 d后，分别收集鸡胚、绒毛尿囊膜及尿囊液、鸡胚剔除羽毛、眼球、爪和喙后与绒毛尿囊膜一起，制成匀浆，反复冻融3次，通过2次氟碳（三氯三氟乙烷）从全胚匀浆中萃取制备AE琼扩抗原（AGP－Ag)用进口标准AE AGP试剂进行标化，结果发现：制备的AD AGP－Ag与标准阳性血清之间的清晰、致密的沉淀线，并与标准AE AGP－Ag的沉淀线完全吻合，表明两者的沉淀反应一致，从而了AE AGP－Ag制备新方法－“全胚双氟碳法”其制备AE AGP－Ag有如下特点：①产量高，平均每3个SPF鸡可获得1mL AE AGP－Ag; ②特异，与类症阳性血清无交叉反应；③敏感，AGP试验中毋需重复加样，普通琼脂即可出线；④稳定性好，保存期长；⑤与标准AE AGP－Ag阳性检出符合率均达100％。本研究表明用“全胚双氟碳法”制备的AEAGP－Ag达到了进口标准，AEAGP－Ag质量，可用于SPF鸡AE抗体的监测，且生产成本低，也可用于商品鸡AEV感染的检测。     

模型动物生物净化方法的探讨

对妊娠的SPF级大、小鼠在临产前进行剖宫产手术,用隔离器内大、小鼠代乳并饲养,从而达到生物净化;统计分析手术成功率、仔鼠存活率以及离乳率等,并将净化后的动物繁殖,对其后代进行寄生虫、细菌和病毒检测。结果显示:(1)本实验室建立的剖宫产术平均手术成功率为83.0%±20.0%,仔鼠平均存活率为74.4%±22.8%,平均离乳率为97.7%±3.6%;(2)生物净化的后代寄生虫、细菌和病毒指标均符合SPF级动物国家标准;(3)原感染螺杆菌的小鼠经生物净化后,子代无螺杆菌感染现象。因此,用该剖宫产术净化SPF级动物可以达到生物净化的目的。     

A2a基因敲除小鼠的繁育及基因型鉴定

将引进的A2a基因敲除杂合子小鼠饲养于SPF环境中,依照遗传学规则进行繁育,提取每种基因型小鼠尾部组织基因组DNA,采用PCR法鉴定小鼠的基因型。结果表明,A2a基因敲除杂合子小鼠子代中将出现野生型、杂合子和纯合子3种基因型。