烟草青枯菌FQY_4宿主特异性候选基因分析

为青枯菌与烟草的相互作用研究提供宿主特性候选基因,在烟草青枯菌FQY_4基因组测序的基础上,采用基因组及同源基因比较,分析青枯菌株系GMI1000、Po82、CFBP2957、CMR15、PSI07和FQY_4的核心基因及FQY_4宿主特异性候选基因。结果表明:FQY_4基因组中有632个宿主特异性候选基因,其中染色体、巨大质粒分别有365个和267个,包括跨膜蛋白、信号蛋白和细胞壁水解相关的基因,移动元件蛋白和许多未知功能的蛋白基因,以及宿主特异性候选三型分泌系统的42个效应蛋白因子(T3Es)。     

烟草青枯菌Tn5突变体库的构建及突变位点分析

为了从烟草青枯菌全基因组范围内发掘致病性相关基因,采用电转化法构建了一个EzTn5转座子介导的烟草青枯菌TXLLJ14-3菌株插入突变体库,该突变体库包含1.2万个突变子,经烟草上的致病性检测,共得到216个无致病力或弱致病力突变菌株。利用TAIL-PCR扩增获得其中15个无致病力烟草青枯菌的Tn5侧翼序列,并对其插入位点进行了分析,结果表明,15个突变菌株的插入位点分别位于核苷酸水解酶、糖基转移酶、转座酶和合成酶等具有不同功能的基因上,这些基因受到干扰或破坏后,可能会抑制致病相关物质的表达或分泌,或者诱导烟草对病原菌产生抗性,从而表现出无致病力特征。     

芝麻AQP家族的全基因组序列鉴定及其特征分析

【目的】从芝麻全基因组中分离鉴定水通道蛋白AQP（aquaporin）家族基因,并进行系统进化关系、连锁群定位、基因结构、跨膜结构域和亚细胞定位预测、保守性氨基酸残基以及青枯雷尔氏菌诱导表达分析,为芝麻AQP的功能研究与利用奠定基础。【方法】通过生物信息学手段,结合芝麻基因组注释信息,鉴定芝麻AQP家族成员序列信息,并用InterPro逐一进行验证。利用ClustalW2对芝麻、拟南芥和水稻的AQP以及马铃薯的XIPs进行多序列比对,用MEGA6.0构建进化树。通过MapInspect和Gene Structure Display Server 2.0进行连锁群定位和基因结构分析。采用ProtParam、WoLF PSORT和TMHMM Server v.2.0在线工具预测芝麻水通道蛋白的分子质量和等电点、亚细胞定位及跨膜结构域。通过芝麻、拟南芥和水稻AQP及马铃薯XIPs的蛋白多序列比对结果推测NPA基序、ar/R滤器及P1-P5的氨基酸残基。利用前期研究获得的转录组测序结果进行青枯雷尔氏菌诱导表达分析,并通过qRT-PCR技术对差异表达较为明显的12个芝麻AQP进行验证。【结果】系统分析鉴定了36个芝麻AQP家族基因,根据多序列比对及系统进化分析将其分为5个亚家族：13个质膜内在蛋白（PIP）、12个液胞膜内在蛋白（TIP）、8个类NOD26膜内在蛋白（NIP）、2个膜内在小分子碱性蛋白（SIP）和1个未知内在蛋白（XIP）,其中有34个基因定位在12个连锁群上。同一亚家族成员在基因结构、蛋白序列、亚细胞定位预测及保守性氨基酸残基等方面都较为相似。青枯雷尔氏菌诱导表达分析显示,NIPs、SIPs和XIPs表达无明显变化,部分PIPs和TIPs能够响应青枯菌诱导。SiPIP1;2、SiPIP1;3、SiPIP2;3和SiPIP2;4受青枯菌诱导后表达上调,SiPIP1;3和SiPIP2;3为持续上调,而SiPIP1;2和SiPIP2;4的表达先下调后上调;与之相反,表达下调较为显著的有SiPIP1;4、SiPIP2;1、SiPIP2;6、SiTIP1;1、SiTIP1;3、SiTIP2;1及SiTIP2;2。上述差异表达基因的qRT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。【结论】通过全基因组分析,在芝麻中鉴定出36个AQP家族基因,分为5个亚家族,分布于12个连锁群上,大部分基因具有1-4个内含子（除SiNIP1;2有7个内含子外）。根据ar/R滤器和P1-P5氨基酸残基组成类型,预测不同亚家族AQP可能识别的底物。青枯菌诱导表达分析表明,部分PIPs和TIPs成员的表达发生了显著变化。     

拮抗菌2-Q-9抑菌相关基因BCCodY转化烟草及其功能

将拮抗菌2-Q-9的1个抑菌相关基因BCCodY连接至遗传转化载体并转化烟草品种K326.PCR结果表明,该基因被成功转化.反转录PCR结果表明,BCCodY基因在K326中被转录成mRNA,说明该基因能在转基因植株中表达.为了鉴定BCCodY在转基因K326中的生物学功能,采用叶腋针刺法将烟草青枯病菌接种转基因植株,在接种后7 d内从转基因植株中分离出的青枯病菌菌落数低于非转基因植株;但接种9 d后,从两类植株中分离出的青枯菌菌落数趋于一致,病情指数也基本相同.说明转BCCodY基因的烟草植株在接种青枯菌初期能抑制青枯病菌,但后期的抑制效果不明显.     

2 个烟草青枯病菌菌株的致病力差异与基因组比较分析

【目的】探索比较 2 个不同青枯病菌菌株之间致病力差异和基因组差异,分析影响菌株致病力差异的关键基因,为烟草青枯病的防治提供理论参考。【方法】从烟草青枯病发病烟株上分离获得不同的青枯病菌菌株并进行鉴定,通过侵染试验比较 2 个菌株之间的致病力差异,并对 2 个菌株的基因组进行测序,比较二者之间基因组序列差异,分析影响菌株致病力差异的基因。【结果】从江西省抚州市广昌县和南丰县分离到2 株青枯病菌菌株 RsTP2 和 RsTY2,egl 测序表明菌株 RsTP2 和 RsTY2 均属于亚洲分支演化型Ⅰ中的序列变种13,其中菌株 RsTP2 对云烟 87 致病力较强,而菌株 RsTY2 致病力较弱。通过对 2 个菌株进行基因组测序,获得二者的基因组框架图,其基因组大小分别为 5.43 MB 和 5.23 MB。将获得的基因和蛋白序列与相关数据库进行比对,获得基因的功能及物种注释信息。通过分析发现,菌株 RsTY2 有 52 个蛋白和菌株 RsTP2 的 44 个蛋白比对后序列存在差异,其相似度在 50.00%~99.88%,其中存在较大差异的编码蛋白主要是凝集素类蛋白,其次是细胞溶素分泌激活蛋白和穿孔素家族蛋白。【结论】通过比较不同致病力青枯病菌株 RsTP2 和 RsTY2 的基因组序列差异,发现二者基因组中编码凝集素类蛋白、细胞溶素分泌激活蛋白和穿孔素家族蛋白等蛋白序列差异较大,这类编码蛋白主要参与细菌的黏附、膜溶解、穿透等功能,与细菌侵入宿主细胞的能力关系密切。这几类编码蛋白的差异推测是导致菌株 RsTP2 和 RsTY2 致病力差异的重要因素之一。     

青枯无致病力菌株对烟草青枯病的诱导抗性与控病作用

为了探讨青枯无致病力菌株对烟草青枯病的控病作用和是否诱导烟草抗病及其控病机理。采用TTC培养基,从茄青枯病株上分离获到青枯无致病力菌株Au004-1,用喷雾法及含菌培养基法测定其对青枯致病菌的抑制作用,并进行烟草青枯病温室盆栽控病试验;用该菌伤根灌接烟草,然后用紫外分光光度计测定叶片的过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性,电泳分析病程相关蛋白(PRP)变化。结果发现,该菌株对青枯致病菌具有抑制作用,抑菌带宽分别1.03和0.83 cm;在温室盆栽试验中它对烟草青枯病具有较好的防效,接种致病菌30 d后相对防效可达77.5%;该菌处理的烟草苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)及多酚氧化酶(PPO)活性增强,病程相关蛋白(PRP)含量增加。试验结果表明这株青枯无致病力菌株除可直接抑制青枯致病菌外,很可能诱导烟草产生青枯病抗性。     

高温高湿下CaRPT2在辣椒抗青枯病中的作用

[目的]青枯病是辣椒生产中主要的土传病害,在高温高湿下发病尤为严重。研究CaRPT2在高温高湿下辣椒应答青枯菌侵染过程中的作用,为开展辣椒抗青枯病遗传改良提供依据。[方法]以中抗青枯病辣椒自交系植株(HN42)与本氏烟草为试验材料,从辣椒叶片cDNA文库中克隆出NRL蛋白家族成员CaRPT2,对其进行同源比对和进化树分析,并通过瞬时过表达、亚细胞定位以及荧光定量PCR等技术研究CaRPT2在高温高湿下辣椒应答青枯菌侵染过程中的作用。[结果]CaRPT2的氨基酸序列与其他物种中的直系同源基因有着较高的同源性,CaRPT2蛋白定位在本氏烟草叶片的细胞质与细胞膜中,CaRPT2转录水平受高温高湿条件下青枯菌侵染的诱导表达,且在辣椒叶片中瞬时过表达CaRPT2,可显著诱导高温高湿下特异性抗病基因CaMgst3的转录激活。[结论]CaRPT2在高温高湿下辣椒应答青枯菌侵染过程中起正调节作用,可为进一步阐明RPT2基因在植物抗病中的功能提供参考。     

广东省烟草青枯菌的菌系和遗传多样性

从广东省韶关和梅州2个烟草产区采集了来自8个县市的共38个烟草青枯菌菌株,对病菌的生物型、致病型和遗传多样性进行了测定,结果表明广东烟草青枯菌全部为生物型Ⅲ。通过在红花大金元,K326,岩烟97和系3等4个烟草鉴别品种上的致病性反应,将广东烟草青枯菌分为强致病力、中等致病力和弱致病力3种致病型,其中以中等致病力菌株为主,占78.9%;强致病力菌株占13.2%;弱致病力菌株占7.9%。从116个RAPD通用引物中筛选出10条引物,用于对38个烟草青枯菌株DNA的RAPD分析,扩增条带表现出明显的多态性,条带主要聚集在0.3～4.0 kb之间。聚类分析这38个菌株可分为2个组群,即组群A和组群B。组群A中又可以分为7个亚组(A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7);组群B也含有4个亚组(B1、B2、B3、B4)。研究结果还表明,广东烟草青枯菌菌株RAPD组群的划分与菌株的寄主来源有一定的相关性,但与地理区域、生物型和致病型没有明显的相关性;生物型不能反映烟草青枯菌菌系的差异。     

广东省烟草青枯茵的菌系和遗传多样性

从广东省韶关和梅州2个烟草产区采集了来自8个县市的共38个烟草青枯菌菌株，对病菌的生物型、致病型和遗传多样性进行了测定，结果表明广东烟草青枯菌全部为生物型Ⅲ。通过在红花大金元，K326，岩烟97和系3等4个烟草鉴别品种上的致病性反应，将广东烟草青枯菌分为强致病力、中等致病力和弱致病力3种致病型，其中以中等致病力菌株为主，占78．9％；强致病力菌株占13．2％；弱致病力菌株占7．9％。从116个RAPD通用引物中筛选出10条引物，用于对38个烟草青枯菌株DNA的RAPD分析，扩增条带表现出明显的多态性，条带主要聚集在0．3～4．0kb之间。聚类分析这38个菌株可分为2个组群，即组群A和组群B。组群A中又可以分为7个亚组（A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7）；组群B也含有4个亚组（B1、B2、B3、B4）。研究结果还表明，广东烟草青枯菌菌株RAPD组群的划分与菌株的寄主来源有一定的相关性，但与地理区域、生物型和致病型没有明显的相关性；生物型不能反映烟草青枯菌菌系的差异。 04—0463—06     

水稻抗白叶枯病相关基因的亚细胞定位

利用亚细胞定位技术对水稻抗白叶枯病相关基因的表达产物进行了分析,为基因功能分析提供了重要信息。通过前期基因芯片筛选、半定量/定量PCR的验证及基因功能注释,从高抗白叶枯病水稻品种Y73中筛选了18个潜在的与抗白叶枯病相关的基因,并在烟草叶片细胞中进行亚细胞定位分析。通过观察融合有绿色荧光标记(sGFP)的表达产物,初步了解这些基因在烟草细胞中的表达位置。经过激光共聚焦显微镜观察后发现: 其中4个基因的 sGFP 融合蛋白定位于细胞核上,可能发挥了转录因子的功能;4个基因的 sGFP 融合蛋白定位于细胞质膜上,推测可能与细胞质膜的稳定或控制蛋白转运相关;4个基因的 sGFP 融合蛋白同时定位于细胞核和细胞质膜上;另有6个基因的 sGFP 融合表达后没有观察到明显的定位信号。     

青枯雷尔氏菌致病机制及其相关基因的研究进展

阐述青枯雷尔氏菌致病基因以及它们之间的相互调节。由于青枯雷尔氏菌的复杂性,进而发展了许多青枯雷尔氏菌分子鉴定技术,并且对青枯雷尔氏菌的鉴定逐渐走向快速、便捷和灵敏高的趋势。青枯雷尔氏菌基因组约5.8Mb,具有高(G+C)含量和约5 120个可能的编码基因;它是由3.7Mb的染色体和2.1Mb的大质粒所组成,主要的致病因子有Ⅲ型hrp分泌系统产物、胞外多糖、细胞壁降解酶(包括果胶质酶以及纤维素酶等),其涉及的基因主要包括hrp基因簇、avr基因、毒性基因;青枯雷尔氏菌通过Ⅲ型分泌系统(T3SS)、II型分泌系统(T2SS)等分泌系统将多种毒性因子输送到胞外使寄主植物致病。同时,T3SS和T2SS之间也是相互影响的。上述致病因子的协调作用是由一个复杂的网络调节系统控制的,并以PhcA调节基因的启动和转录为核心,自动而精密地调节有关致病基因的表达及关闭,从而控制细菌的生长状态。     

番茄品种抗性与青枯菌和土壤微生物的关系

对青枯菌（Ralstonia solanacearum）在番茄（Lyoopersicon esculentum Mill）抗、感品种根际土壤和根系组织中的数量变化，以及青枯菌与番茄相互作用后，抗、感品种根际微生物数量的变化进行了研究．结果表明，根际土壤中青枯菌数量与番茄品种抗性之间的关系不显著（P〉0．05），而根组织内青枯菌数量与番茄品种抗性密切相关；土壤接种青枯菌后第4d，抗病品种根际土壤真菌、细菌和放线菌数量均高于感病品种，并达到最高峰，第4d后微生物数量下降，并低于感病品种，而不接种青枯菌的对照组，抗病品种根际微生物的数量几乎都高于感病品种．     

植物青枯菌遗传多样性及致病基因组学研究进展

植物细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al.）引起的一种世界性重大病害。作为复合种,青枯菌在与寄主长期协同进化过程中,表现出广泛的生态和寄主适应性。Fengan和Prior提出青枯菌演化型分类框架,用以描述青枯菌种以下的遗传多样性。青枯菌种内表型特征差异的本质是其基因组较其它植物病原细菌更为复杂和更具可塑性。笔者对近期青枯菌遗传多样性和致病基因组学方面的研究进展进行了归纳和讨论。     

侧孢芽孢杆菌2-Q-9外泌抑菌物质性质

侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)菌株2-Q-9分泌的抑菌物质能强烈抑制青枯病菌的3个生理小种的正常生长.为了进一步在生产上利用该抑菌物质,就该抑菌物质的性质进行了初步研究.结果表明,该抑菌物质经高温处理后性质稳定;在碱性条件下比酸性条件下稳定;对胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感,对胃蛋白酶部分敏感;该抑菌物质可能为蛋白或多肽类物质.     

Molecular and Physical Mapping of Powdery Mildew Resistance Genes and QTLs in Wheat: A Review

Wheat powdery mildew(Pm) is a major disease of wheat worldwide. During the past years, numerous studies have been published on molecular mapping of Pm resistance gene(s) in wheat. We summarized the relevant findings of 89 major resistance gene mapping studies and 25 quantitative trait loci(QTL) mapping studies. Major Pm resistance genes and QTLs were found on all wheat chromosomes, but the Pm resistance genes/QTLs were not randomly distributed on each chromosome of wheat. The summarized data showed that the A or B genome has more major Pm resistance genes than the D genome and chromosomes 1A, 2A, 2B, 5B, 5D, 6B, 7A and 7B harbor more major Pm resistance genes than the other chromosomes. For adult plant resistance(APR) genes/QTLs, B genome of wheat harbors more APR genes than A and D genomes, and chromosomes 2A, 4A, 5A, 1B, 2B, 3B, 5B, 6B, 7B, 2D, 5D and 7D harbor more Pm resistance QTLs than the other chromosomes,suggesting that A genome except 1A, 3A and 6A, B genome except 4B, D genome except 1D, 3D, 4D, and 6D play an important role in wheat combating against powdery mildew. Furthermore, Pm resistance genes are derived from wheat and its relatives, which suggested that the resistance sources are diverse and Pm resistance genes are diverse and useful in combating against the powdery mildew isolates. In this review, four APR genes, Pm38/Lr34/Yr18/Sr57, Pm46/Lr67/Yr46/Sr55, Pm?/Lr27/Yr30/Sr2 and Pm39/Lr46/Yr29, are not only resistant to powdery mildew but also effective for rust diseases in the field, indicating that such genes are stable and useful in wheat breeding programmes. The summarized data also provide chromosome locations or linked markers for Pm resistance genes/QTLs. Markers linked to these genes can also be utilized to pyramid diverse Pm resistance genes/QTLs more efficiently by marker-assisted selection.     

一株分离自鸡肉样品的多重耐药大肠埃希菌的全基因组测序及耐药性研究

以分离自宁波市市售鸡肉中的一株大肠埃希菌ECCNB12-2为研究对象,使用微量肉汤稀释法进行最小抑菌浓度(MIC)测定,结果显示,该菌株对氨苄西林、庆大霉素、大观霉素、四环素、氟苯尼考、磺胺异恶唑、复方新诺明、头孢噻夫、恩诺沙星、氧氟沙星等10种抗生素耐药。采用第三代高通量测序技术对该菌株进行全基因组测序,随后对基因组完成图进行获得性耐药基因、毒力因子、质粒水平转移元件预测。菌株ECCNB12-2染色体基因组大小为5 539 489 bp,GC含量为50.37%,同时携带有4个质粒,大小分别为147 451 bp(pTB-nb1)、139 752 bp(pTB-nb2)、82 252 bp(pTB-nb3)、253 793 bp(pTB-nb4)。获得性耐药基因预测结果显示,染色体基因组、质粒pTB-nb1及质粒pTB-nb4上共携带有40个获得性耐药基因,同时菌株基因组检测出12个毒力因子。质粒水平转移元件预测结果显示,pTB-nb4质粒包含完整的水平转移系统,理论上具有高度的自主接合转移潜力。以上研究表明,分离自市售鸡肉样品的ECCNB12-2菌株是一株高风险的多重耐药菌株,反映了市售鸡肉中细菌耐药状况的严重性,相关研究结果为食源性细菌耐药安全风险评估提供了参考。     

一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体的分离及生物学特性分析

【目的】分离并纯化出一株裂解性青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)噬菌体,并测定其各项生物学特性,为开发新的抗烟草青枯病制剂提供依据。【方法】取烟草青枯病重病田中健康烟株的根际土壤制成土壤悬浮液,并通过在青枯雷尔氏菌菌液中加入过滤后的土壤悬浮液富集噬菌体,用双层平板法验证噬菌体的存在后挑取单个最大噬菌斑进行反复纯化,直到得到单一清晰的噬菌斑。纯化后的单个噬菌斑加入对数早期的青枯雷尔氏菌菌液中进行增殖培养,将增殖液按常规方法进行噬菌体颗粒浓缩后,取20 μL浓缩液用磷钨酸染色并通过电子显微镜观察噬菌体的形态特征;同时将浓缩液进行SDS-PAGE电泳,观察蛋白条带大小和数量;用λ噬菌体DNA提取试剂盒提取噬菌体增殖液中的噬菌体核酸进行琼脂糖凝胶电泳,确定其基因组片段大小;最后用常规方法测定噬菌体的滴度、最佳感染复数、一步生长曲线,并通过比较加入噬菌体液前后青枯雷尔氏菌菌液的OD₆₀₀值变化测定其对温度、pH、紫外线、氯仿的敏感性。【结果】分离并纯化出了一株裂解性青枯雷尔氏菌噬菌体,命名为∈RS-1, 噬菌斑为圆形,清晰透明,边缘光滑,直径1-2 mm,经电镜观察其形态为蝌蚪状,头部为二十面体的立体对称,直径约为94 nm,并有一带伸缩尾鞘的长尾大约为27 nm×100 nm,按照国际病毒分类委员会分类标准,其属于有尾噬菌体目（Caudovirales）,肌尾噬菌体科(Myoviridae)的裂解性噬菌体,核酸性质为dsDNA;噬菌体浓缩液经SDS-PAGE分析至少可以观察到25条蛋白条带,相对分子质量在10-100 kD,说明其蛋白外壳至少含有25个结构蛋白;将提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳显示其条带大于48 kb,符合肌尾噬菌体科基因组大小范围（31-317 kb）;生物学特性的测定显示该噬菌体对青枯雷尔氏菌的最佳感染复数为0.01;其吸附和感染青枯雷尔氏菌时的潜伏期约为30 min,爆发期约为80 min,裂解量约为156;该噬菌体的裂解活性在28℃时最高,在28-50℃均较强,但在温度超过60℃后活性基本丧失;其对酸碱的耐受力较强,在pH 3-8的范围内均有较强的裂解活性,当pH值超过9后活性开始降低;其对紫外线有一定的耐受能力,经紫外线照射0-9 min后裂解活性依然较强,12 min后活性开始下降,21 min后活性基本丧失;其对氯仿不敏感,5%浓度的氯仿对其活性基本没有影响。【结论】分离到了裂解性的青枯雷尔氏菌噬菌体,属于有尾噬菌体目,肌尾噬菌体科,经过测定其各项生物学特性可知其潜伏期较短,裂解能力较强,具有很好的杀菌效果,且其裂解活性持续时间长,并能在不同温度、不同酸碱性的环境内有较强的适应能力,具有开发为抗青枯雷尔氏菌菌剂的潜力。     

抗烟草青枯病菌的枯草芽孢杆菌SH7的筛选与鉴定

由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的烟草青枯病是我国烟区的主要病害之一,严重影响烟草的产量和品质。从云南和贵州烟草青枯病重病区采集600份健康烟草根基土壤,并从中筛选出1株对R. solanacearum具有较强拮抗活性的细菌菌株SH7,该菌株在室内平板抑菌试验中,对R. solanacearum抑菌带宽可达132 mm。预先用SH7无菌发酵液保护烟株根部,对R. solanacearum防效达到66.0％。SH7发酵液经70％(NH4)2SO4饱和度沉淀并透析后得到的蛋白粗提液经平板抑菌活性检测,对R. solanacearum具有很强的抑菌活性,抑菌带宽为157 mm。初步确定SH7菌株产生的主要抑菌活性物质为蛋白多肽类物质。经菌体形态学、生理生化测定和16s rDNA序列测定,结果表明:SH7菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。