枯草芽孢杆菌HAS中TasA基因的克隆与分析

为弄清枯草芽孢杆菌HAS对甘蔗黑穗病菌的抑制作用机理,选取可对多种植物病原真菌有抑制作用的抗菌蛋白TasA基因进行克隆与分析。结果表明:在HAS菌株中含有TasA基因,克隆编码抗菌蛋白TasA的基因全长,序列分析其有786个碱基组成,该序列与GenBank上登录的TasA(AJ871386.1)序列同源性达99%,推测蛋白分子量大小大约28KD,其中第104、164、169、250、399、623、627位等7个碱基发生碱基转换或颠换,而且这些变异分别发生在密码子的第2、2、3、1、3、2、3位碱基上,引起多肽链氨基酸的错义突变。经氨基酸序列比对,同Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168编码的TasA蛋白(NP_390342.1)在第150位和第209位上的氨基酸发生变化,由苏氨酸、天冬酰胺分别代替丙氨酸和谷氨酸。     

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。     

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及诱导表达

从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)T04A001中提取基因组DNA,通过PCR的方法克隆了几丁质酶chiAC基因(GenBank登录号为EF427670).置换chiAC基因的启动子为T7启动子时,chiAC基因能在IPTG诱导下在大肠杆菌中大量表达,并产生大小约70 kDa的表达产物.     

苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种几丁质内切酶基因的生物信息学分析

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp kurstaki）基因组DNA为模板,利用1对特异性引物通过Touchdown PCR方法扩增了长为2576bp的几丁质酶kchi基因序列（GenBank登录号：AY189740）。生物信息学分析发现：该序列包含1个完整的开放阅读框,编码688个氨基酸,推测是分子量约为75820。等电点pI=5．89的几丁质酶前体。序列和结构比较分析结果表明：Kchi属于几丁质内切酶,包括几丁质酶催化区、粘蛋白Ⅲ型同源区和几丁质结合区3个结构域,在N端还有1个分泌信号肽。除与胁巴基斯坦亚种几丁质酶同源性较低（相似性为61．3％）外,与Bt其他亚种的同源性都较高（≥92．0％）。     

枯草芽孢杆菌apr基因的克隆和表达

通过PCR技术克隆枯草芽孢杆菌蛋白酶apr基因,并分别对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果表明,apr基因序列全长1509bp,编码503个氨基酸,同源性100%;克隆到表达质粒pET-22b(+)后,将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,蛋白分子质量为55ku。测定酶活为19500U·mL-1。该基因克隆和表达的成功对于制备大豆抗氧化肽具有实际应用价值,对进一步深入研究其生物学和酶学机制具有重要意义。     

产几丁质酶芽孢杆菌的筛选鉴定和酶活力测定

从103份采自中国各地的土样中分离得到了312株芽孢杆菌，用平板透圈法筛选到3株产几丁质酶菌株G1、G2和G3。经鉴定，G1为短芽孢杆菌（Bacillus brevis）；G2为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）；G3为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。它们的几丁质平板上的透明圈直径以G1＞G3＞G2 ，在以Schales‘法测定壳聚糖酶活力时，其摇瓶发酵上清液的酶尖力以G3＞G1＞G2为序。本文首次报道短芽孢杆菌产生几丁质酶和壳聚糖酶。     

枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶学性质

对枯草芽孢杆菌凝乳酶的酶学性质进行了研究,结果表明:枯草芽孢杆菌凝乳酶作用的最适反应温度为55℃、最适pH值为5.0,在pH值为6.0时最稳定,在65℃保温60 min酶活基本丧失,Mn2+、Li+、Fe2+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+对该凝乳酶有促进作用,Mg2+、Ca2+促进作用较为明显,而Cu2+对该酶有明显的抑制作用;酶修饰剂中β-巯基乙醇对凝乳酶活力的影响较小,EDTA可抑制该凝乳酶的活力;蛋白酶抑制剂σ-phenantroline可以明显抑制酶活性,证实该酶为金属蛋白酶类。在与商品酶对比中发现枯草芽孢杆菌凝乳酶与商品酶的酶学性质相近。     

枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因的克隆及表达

采用鸟枪法克隆到了枯草芽孢杆菌α－淀粉酶基因,试验证实,已报道的α－淀粉酶的基因大小为２ｋｂ左右,因此回收３￣７ｋｂ的目的片段较适宜,对质粒去磷可防止自连,并能显著提高外源片段的连接效率,采用扩大酶连的方法有助于酶连产物的进一步提高,高效感受态比普通感受态构建基因文库效率要高２个数量级。高效,快捷的鉴定α－淀粉酶的筛选培养基是克隆α－淀粉酶基因必不可少的条件。     

产几丁质酶芽孢杆菌对病原真菌的抑菌作用

三株产几丁质酶芽孢杆菌[短芽孢杆菌（G1）、地衣芽孢杆菌（G2）和枯草芽孢杆菌（G3）]对植物病原真菌生长有抑制作用。它们在琼脂平板上对油菜菌核病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜灰霉病菌和小麦赤霉病菌均有抑菌圈产生。G2菌和G3菌，在灭菌土抑菌试验和不灭菌土抑菌试验中对油菜菌核病菌和水稻纹枯病菌显出强烈的抑菌活性。G3菌尤为突出。G3菌有开发成为生防制剂防治多种土传植物病害的潜力。     

高活性谷氨酰胺酶豆豉芽孢杆菌的筛选及glsA基因的克隆

为筛选获得高活性谷氨酰胺酶豆豉芽孢杆菌菌株,提高谷氨酸的含量,试验通过康维皿弥散法对525株芽孢杆菌进行酶活检测,获得一株产谷氨酰胺酶活力为68.407 mg NH3/(g曲·h·37℃)的B.subtilis GA317菌株,其酶活力较B.subtilis BJ3-2高5.59倍.对2个菌株谷氨酰胺酶编码基因glsA...     

Expression of a Lysine-rich Gene in Bacillus subtilis 168

Lysine-rich protein gene (lys) was cloned from winged bean (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC), and cloned into prokaryotic expression vector pHT43, the recombinant plasmid pHT43/lys were constructed and then transferred into Bacillus subtilis168, upon IPTG induction, the recombinant protein was expressed, and the content of lysine was detected by HPLC. The result showed that lysine content increased by 9.85%. It was suggested that introducing lys gene into Bacillus subtilis 168 was an effective way to improve its nutrition quality.     

枯草芽孢杆菌B111中性蛋白酶基因BS2在毕赤酵母中的表达

 【目的】为开发抗病基因和生物农药新资源,纯化鉴定枯草芽孢杆菌B111分泌的抗棉花黄萎病菌蛋白质,克隆其编码基因,并分析在毕赤酵母中的表达特性。【方法】通过超滤浓缩、90%硫酸铵沉淀、葡聚糖凝胶QAE-A50强阴离子交换柱洗脱及冻干等步骤,分离纯化抗菌蛋白。采用联机反相毛细管柱液相色谱电喷雾串联质谱,鉴定抗菌蛋白种类。克隆包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因序列,构建表达载体pPIC9K-PT,转化毕赤酵母GS115。转化子经PCR鉴定,甲醇诱导表达产物经中性蛋白酶活性和抗菌活性检测验证功能。【结果】纯化鉴定了一个来源于枯草芽孢杆菌B111的抗菌中性蛋白酶BS2。克隆了包含前导区序列在内的抗菌蛋白基因BS2,并在毕赤酵母中获得有效表达。重组BS2蛋白分子量约69 kD,表达水平29.77 mg?L-1,水解酪素酶活力27 800 U?g-1,并显示抗黄萎病菌活性。【结论】纯化鉴定了一个具有抗菌活性的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶BS2,克隆其编码基因BS2,并成功实现在酵母中的有效表达。     

枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的生物功能分析

采用AKTA-epxlore层析系统,利用DEAE sepharose fast flow、Phenyl sepharose 6 F.F.和羟基磷石灰石柱层析后,分离纯化获得枯草芽孢杆菌Bs-916抗菌蛋白质Bacisubin.该蛋白质对水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisease)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、白菜黑斑病菌(Alternaria oleracea)、甘蓝黑斑病菌(A. Brassicae)、灰霉病菌(Botrytis cinerea)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum capsici (syd.) Butl.)和水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme Sheld)均有抑菌活性,尤其对Alternaria属的病原菌具有较高的毒力.枯草芽孢杆菌Bs-916胞外抗菌蛋白质的抑菌机制是造成病原菌菌丝营养吸收困难,致使菌丝顶端膨大,分支增加,胞壁加厚、断裂,从而抑制了病原菌的生长.研究发现抗菌蛋白具有凝集素活性和核糖核酸酶活性,无蛋白酶活性和蛋白酶抑制活性.     

生防枯草芽孢杆菌CAB-1抑菌蛋白产生条件及其稳定性研究

枯草芽孢杆菌CAB-1是一株对番茄灰霉病有显著防效的生防菌株,抑菌蛋白是其产生的主要抑菌物质之一。研究表明,菌株CAB-1产生抑菌蛋白的最佳培养条件为：接种量2%,培养温度30℃,转速180 r/min,装液量100 mL/250 mL,培养时间48 h。考马斯亮蓝法测得最佳培养条件下菌株CAB-1产生的粗蛋白浓度为0.16 mg/mL。该粗蛋白对胰蛋白酶及蛋白酶K不敏感,胃蛋白酶处理使其活性降低14%;抑菌蛋白在100℃以下处理30 min活性变化差异不显著,而121℃处理30 min其抑菌活性为对照的72%。抑菌蛋白对酸碱的耐受范围广,在pH值3~12的范围内抑菌活性均能保持在75%以上,pH值2时抑菌活性降低为对照的59%。经甲醇、氯仿、乙醚、乙酸乙酯及丙酮处理后该粗蛋白的抑菌活性变化不大。     

枯草芽孢杆菌GMP还原酶基因（guaC）突变株的构建

以受体菌的guaC基因为同源重组的指导序列,构建了整合表达载体pGT9GH,通过双交叉同源重组的方法将线性化的pGT9GH整合到受体菌的染色体上,构建了guaC基因的缺失突变株B.subtilis GJ07,并在guaC基因的5′端和3′端之间引入了一个拷贝核黄素操纵子,通过PCR方法验证了同源重组的正确性,最后测定了同源重组突变后的菌株GJ07的核黄素产量。结果表明：同源重组突变后的菌株GJ07的核黄素产量明显高于初始菌株GJ06,发酵60 h提高了24.5%。     

绿色荧光蛋白基因对枯草芽胞杆菌的标记

以质粒pAD123为模板扩增出绿色荧光蛋白基因（gfp）序列，扩增产物连接到经酶切的枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）整合载体pAXc，构建重组质粒pAXc-gfp. pAXc-gfp线性化后转入野生型枯草芽胞杆菌B411，gfp编码序列通过同源泉重组整合列到B.subtilis B411染色体上，获得在无抗性选择压力下稳定表达绿色荧光蛋白的重组子B412.     

枯草芽孢杆菌B21抗菌蛋白的分离纯化及特性研究

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B21对番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea Pers.)有较强的抑制作用,其产生的抗菌物质主要是抗菌蛋白.为明确该抗菌蛋白的理化性质,利用饱和硫酸铵沉淀法得到拮抗粗提蛋白,所获粗提蛋白不耐高温,对胰蛋白酶和蛋白酶K部分敏感,对链霉蛋白酶不敏感而对氯仿敏感,作...     

Bacillus subtilis HAB-1在不同培养基上的形态观察及抑菌活性测定

HAB-1是一株来自植物根际具有较强抑菌作用的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,将其接种到7种培养基平板上,培养72 h后观察HAB-1的菌落形态及不同培养基质对HAB-1抑菌活性的影响。结果表明,在7种培养基平板上,HAB-1的菌落形态存在明显差别,菌落直径为7.95~23.51 mm不等;通过平板对峙培养法发现,来自不同培养基培养的HAB-1对橡胶树炭疽病菌等12株植物病原真菌的抑菌活性存在较大差异,对同一种病原菌的抑菌率差别最大为31.33%袁,最小为2.66%。通过对7种培养基组分分析发现,C源和金属离子对HAB-1抑菌活性的影响较为明显,而N源则影响不大。从本试验结果可知,不同培养基组分对HAB-1的影响较大袁,除了影响生长速度外,对其抑菌活性物质的产生也起到重要作用。本研究为后续对该菌的发酵及抑菌物质的研究奠定了基础。