枯草芽孢杆菌HAS中TasA基因的克隆与分析

为弄清枯草芽孢杆菌HAS对甘蔗黑穗病菌的抑制作用机理,选取可对多种植物病原真菌有抑制作用的抗菌蛋白TasA基因进行克隆与分析。结果表明:在HAS菌株中含有TasA基因,克隆编码抗菌蛋白TasA的基因全长,序列分析其有786个碱基组成,该序列与GenBank上登录的TasA(AJ871386.1)序列同源性达99%,推测蛋白分子量大小大约28KD,其中第104、164、169、250、399、623、627位等7个碱基发生碱基转换或颠换,而且这些变异分别发生在密码子的第2、2、3、1、3、2、3位碱基上,引起多肽链氨基酸的错义突变。经氨基酸序列比对,同Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168编码的TasA蛋白(NP_390342.1)在第150位和第209位上的氨基酸发生变化,由苏氨酸、天冬酰胺分别代替丙氨酸和谷氨酸。     

甘蔗应答黑穗病菌侵染相关酶活性和内源激素含量的变化

[目的]研究不同甘蔗品种与黑穗病菌长期互作过程中相关酶活性及内源激素含量的变化,为甘蔗应答黑穗病菌侵染的抗性机制提供理论依据.[方法]选用抗黑穗病品种桂糖29号和感黑穗病品种崖城71-374,用浸渍法接种黑穗病菌,对照组用无菌水模拟接菌.在接菌后30、60、90和180 d取甘蔗+1位叶为样品,分析几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和过氧化氢酶(CAT)活性及生长素(IAA)、细胞分裂素(CTK)和乙烯(ETH)含量的变化.[结果]在整个侵染期间,两个甘蔗品种叶片的几丁质酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性及IAA、CTK含量呈逐步降低或波动下降趋势,均在接种后180 d达最低值,而CAT活性整体上呈上升趋势,在接种后180 d达最高值;其中抗性品种桂糖29号的β-1,3-葡聚糖酶活性和ETH含量在整个浸染过程均高于感病品种崖城71-374.[结论]甘蔗在不同时期应答黑穗病菌胁迫的生理生化反应不同,感病品种与抗病品种的防御机制可能存在差异.     

甘蔗黑穗病拮抗细菌的促生长特性及其防治效果研究

【目的】筛选具有拮抗甘蔗黑穗病菌（Sporisorium scitamineum）及促进植物生长特性的细菌，为甘蔗黑穗病的生物防治提供菌株资源和参考依据。【方法】采集出现黑穗病甘蔗株的根际土壤，采用平板对峙培养法分离纯化获得拮抗菌株，通过16S rRNA序列分析明确拮抗菌株的分类地位并分析其促生长特性；采用桶栽试验，研究筛选获得的优良拮抗菌株对甘蔗黑穗病的防治效果。【结果】分离纯化获得68株细菌菌株，其中7株（G1、G10、G12、G14、G20、G21和G23）对甘蔗黑穗病菌具有抑制效果。7株菌株具有产纤维素酶、产几丁质酶、分泌吲哚乙酸（IAA）、产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶（ACC脱氨酶）、嗜铁能力、溶解有机磷、产蛋白酶及产氢氰酸（HCN）等不同程度的促进植物生长特性，特别是3株伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）菌株G1、G10和G23的综合效果更好。用拮抗能力较强的菌株G1、G10、G12和G23防治甘蔗黑穗病的桶栽试验结果表明，4株拮抗菌株处理均可有效抑制黑穗病的发生，提高甘蔗的出苗率和生物量，其中以菌株G23处理的综合效果最好。【结论】分离获得7株对甘蔗黑穗病菌拮抗效果较好的菌株，均具有不同程度的促进植物生长特性，其中以菌株G23的综合效果最好，具有良好的应用前景。     

产酶溶杆菌OH11菌株几丁质酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从产酶溶杆菌OH11菌株中克隆到编码几丁质酶的chiA基因.同源性比较发现,其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的ChiA有97%以上的序列一致性.基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a( )上构建重组质粒pChiA,并转化宿主菌BL21(AI)产生BLChiA表达菌株.经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后发现,BLChiA菌株产生相对分子质量约为75×103的蛋白质.生物活性试验表明,该蛋白能水解几丁质,在几丁质培养基上产生一透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用.因此该蛋白具有一定的生物防治作用.     

几丁质降解酶产生菌的分离及其产酶条件的初步研究

从土壤中分离出两株几丁质降解能力较强的细菌,经初步鉴定,分别归于假单胞菌属和短杆菌属,命名为Pseudomonas sp. ww 和Brevibacterium sp. yy.对这两菌株进行的液体摇瓶发酵试验表明,在肉汤培养基中,yy菌株16 h进入稳定期,ww菌株20 h进入稳定期,而在几丁质培养基中两菌株要培养36 h才进入稳定期;在几丁质培养基中对酶活力的测定结果表明:yy菌株培养35 h酶活达最高,为8.3 U/mL,ww菌株培养30 h时酶活最高,达13.3 U/mL.用半量肉汤培养基摇瓶培养10 h后加入0.2%胶体几丁质的补料分批培养方式,可使酶活高峰时间提前5 h,且酶活力也有所增加.yy菌株在30 h酶活达最高,为8.4 U/mL,ww菌株在25 h酶活达最高,为15.6 U/mL,若加入的是2%的胶体几丁质,则对菌体,特别是对yy菌株的生长有抑制作用.实验还发现两菌株的几丁质培养物对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用,对大肠杆菌也有一定的抑制作用,而对黑曲霉和黑根霉几乎没有抑制作用.     

甘蔗黑穗病菌的快速检测

利用分子生物学方法对甘蔗黑穗病菌进行了检测,建立了该病原菌的快速检测方法.从田间采集样本,在马丁氏培养基上分离获得甘蔗黑穗病菌的单菌落,经培养获得大量菌体,提取菌体基因组DNA并进行PCR检测,证明获得了甘蔗黑穗病的病原菌.该方法能简便、快速、准确、有效的检测甘蔗黑穗病菌,结果稳定、可靠.建立快速有效的检测甘蔗黑穗病的方法,将为甘蔗抗黑穗病育种工作提供方便.     

餐厨垃圾中胶原蛋白和几丁质原位降解菌株的筛选与鉴定

从餐厨垃圾、畜肉市场和屠宰场等处采样,采用平板透明圈法和猪皮消化试验初筛胶原蛋白降解菌,采用平板透明圈法和虾壳消化试验初筛几丁质降解菌,通过测定发酵液胶原蛋白酶和几丁质酶活性复筛菌株,对目标菌进行形态学、生理生化和16S r DNA序列鉴定,并用该菌室外原位降解富含胶原蛋白和几丁质的餐厨垃圾。分离到11株高效降解胶原蛋白的菌株,其中的B3和C3具有较高的几丁质酶活,并能有效消化虾壳;B3的胶原蛋白酶活性和C3差异不显著(P0.05),而几丁质酶活性显著比C3高(P0.05)。B3被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),该菌室外原位降解富含胶原蛋白和几丁质的餐厨垃圾2 d,降解效果达到24.78%,比对照高15.74百分点。     

抑制真菌病害几丁质酶产生菌的筛选、鉴定

从土壤中分离到132株细菌和链霉菌,用平板透明圈法筛选到32株产几丁质酶菌株,其中一株链霉菌经测定对稻瘟菌、水稻纹枯病菌、辣椒炭疽病菌、小麦赤霉病菌等多种病原真菌具明显抑制作用,该菌经形态学及生理生化特性鉴定,初步定为球孢链霉菌(Streptomyces globisporus),是一种新的几丁质酶产生菌。     

甘蔗黑穗病菌培养基的筛选及基因组DNA分离技术

为了获得甘蔗黑穗病菌多态性分析所需的DNA,在对来自福建等6个省(区)的13个甘蔗黑穗病菌菌株单孢分离、培养基筛选的基础上,总结出了一种快速、简便提取甘蔗黑穗病菌DNA的方法,并通过凝胶电泳和RAPD(random amplified polymorphic DNA)对提取的DNA的质量进行了验证。结果表明,所提取的DNA纯度高,条带完整,适合于分子生物学操作。     

番茄菌根根际土壤产几丁质酶细菌的分离及其几丁质酶活性研究

对盆栽试验根际土壤微生物数量计数结果表明,接种丛枝菌根(AM)真菌苏格兰球囊霉菌(Glomus caledonium)的番茄菌根根际土壤的细菌、真菌、放线菌和产几丁质酶细菌总数显著高于非菌根根际土壤.从番茄菌根根际土壤中分离得到1株产几丁质酶细菌,该菌能够抑制黄瓜尖镰孢的生长.经16S rDNA和生理生化鉴定,该菌为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株.该菌在pH 6～8范围几丁质酶活性没有显著差异,产酶的最适温度为35 ℃,最适装液量为1/5(250 mL三角瓶).在几丁质液体培养基中摇床培养125 h后酶活性与蛋白质含量达到平衡.表明:该菌株具有稳定的产几丁质酶能力,因此具有潜在的生物防治功能.     

转基因甘蔗抗黑穗病鉴定研究

用分离得到的甘蔗黑穗病病菌单孢子菌丝体对5个甘蔗转基因株系进行体外抑菌作用鉴定,结果显示,5个转基因株系对甘蔗黑穗病均有不同程度的抗性表现;通过人工接种方法对转基因植株（T1）进行了甘蔗黑穗病病菌的田间接种实验,利用病害流行指标LP、SDD、IPmax、Ymax、AUDPC对其后代（他）进行抗病性鉴定,结果表明,SCG1和SCG2两个株系表现为抗病（R）,而SCG3、SCG4和SCG5三个株系表现为中抗（Ⅰ）;并结合RT-PCR技术鉴定目的基因在转基因甘蔗无性系后代（T2）中的表达,结果显示两个目的基因在转基因甘蔗无性系12中均有表达,此结果与其抗病表现一致。     

番茄灰霉病菌拮抗细菌B21的鉴定

对分离于叶片表面能较强抑制番茄灰霉病菌生长的拮抗细菌B21菌株进行了鉴定。通过形态特征、生理生化特征观察,利用PCR技术对菌株B2116SrDNA序列作全序列分析,序列结果在GeneBank中进行Blast同源序列检索,再用DNAStar软件与Bacillus属的其它种进行同源性分析,结果显示B21与已报道的B.subtilis16SrDNA序列(登陆号AY172513)有99.93%的相似性,且两者在系统发育树中处于同一个分支。确定B21为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的一个菌株。     

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。     

具有稻瘟病菌拮抗活性的枯草芽孢杆菌的分离与鉴定

采用梯度稀释分离法,从黄河稻区水稻根际土壤中分离出耐高温芽孢菌722株。通过真菌生长抑制试验,获得具有稻瘟病菌拮抗活性的菌株27株。通过形态学观察和生理生化指标鉴定,获得具有稻瘟病菌拮抗活性的枯草芽孢杆菌疑似菌株7株。挑取其中抑菌活性最强的1株进行16SrDNA鉴定,将其16SrDNA基因序列与GenBank中基因序列进行同源性比较,发现与枯草芽孢杆菌16SrDNA有99%同源性,判定此菌为枯草芽孢杆菌,命名为BS501a。     

生防菌株HJX1的鉴定和抑菌谱的测定

依据传统形态学、16S rRNA基因序列及脂肪酸图谱鉴定,将一株对香蕉镰刀枯萎病菌有很好抑制效果的菌株HJX1鉴定为枯草芽孢杆菌。采用细菌的通用引物P0和P6扩增16S rRNA基因片段,得到1521bp的DNA片段,其序列与枯草芽孢杆菌的序列的同源性高达99%;细胞组分脂肪酸的含量同枯草芽孢杆菌最近,其相似度为0.724。与病原真菌对峙培养的结果表明,该菌株能对供试的10个植物病原真菌均有很好的抑制作用。     

烟草赤星病拮抗生防菌BS06-1的筛选

[目的]筛选对烟草赤星病具有明显拮抗作用的细菌。[方法]应用平板对峙培养法对从烟草根际分离到的细菌进行烟草赤星病拮抗性鉴定,对其中对烟草赤星病菌拮抗性较高的一株细菌利用细菌16S rRNA通用鉴定引物进行PCR扩增、测序和田间抗病性试验。[结果]共从烟草根际分离120份细菌,有6份对烟草赤星病病原菌具有一定拮抗作用,其中1份细菌拮抗作用明显,定名为BS06-1。将该细菌的16S rRNA测序结果登录NCBI网站进行Blastn序列比对,结果表明该菌株与枯草芽孢杆菌BSD-2同源性达到96%,与枯草芽孢杆菌BCRC 14718同源性达到95%,证明该菌属于枯草芽孢杆菌。田间试验证明该菌株BS06-1对烟草赤星病具有显著的抑菌效果。[结论]BS06-1细菌对烟草赤星病具有明显拮抗作用。     

一株产漆酶细菌的分离、鉴定及对造纸黑液处理的初步研究

利用铜离子作为筛选剂,从凉水国家级自然保护区的土样中分离纯化出一株具有高漆酶活性的细菌.通过形态学观察、生理生化特性测定及16S rDNA序列分析,鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为B.subtilis WD23.根据GenBank上公布的Baccillus subtilis cotA ...     

产几丁质酶酵母菌的筛选与鉴定

从番茄果实表面筛选到1株产几丁质酶酵母菌株CY-6,该菌株产生的几丁质酶对番茄镰刀菌果腐病菌(Fusarium oxysporum)有较强的抗菌活性并具有较广的抗菌谱。形态及生理生化特征测定结果表明:菌株CY-6与伊萨酵母属(Issatchenkia)中的陆生伊萨酵母(I.terricola)种的特征基本一致;测定了该菌株的26S rDNAD1/D2区域序列并根据26S rDNA构建了系统发育树;在系统发育树中,菌株CY-6与陆生伊萨酵母形成一个类群,序列同源性高达99.6%。因此,将菌株CY-6鉴定为陆生伊萨酵母。