Erwinia chrysanthemi分离株CSCL006 hrpN基因的克隆与高效表达

通过构建Erwiniachrysanthemi分离株CSCL006的DNA文库,克隆出hrpNCSCL006基因,测序结果显示该基因编码区长1020bp;推导的harpinCSCL006与ErwiniachrysanthemiEC16和3937编码的harpin蛋白同源性高,但与其它软腐菌的harpin蛋白同源性较低;在大肠杆菌中(Escherichiacoli)高效表达了hrpNCSCL006基因,重组harpinCSCL006蛋白分子量为34kD。以抗harpinEcc的抗体为探针,Westernblot证实该蛋白确为harpin;纯化的harpinCSCL006,能引起烟叶的过敏反应。     

巴西固氮螺菌Yu62glnZ基因及其相邻基因的克隆和序列分析

通过原位杂交从巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense)Yu62的基因组文库中获得glnZ基因的阳性克隆，对该阳性克隆进行亚克隆和序列分析，结果表明glnZ基因位于3.7kb的SaLI片段上，glnZ基因编码区长336bp，编码的产物是Pz蛋白，由112个氨基酸组成，分子量为1.12kD。用Blastax软件对Pz蛋白的氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源比较，结果表明Pz蛋白与其它几种固氮菌及大肠杆菌的GlnK蛋白的同源性（identities）达66％以上；与PⅡ蛋白的同源性达64％以上。glnZ基因上游是部分ubiH-like基因，与E.coli ubjH基因（编码辅酶Q，ubiquinone)N－端有31％的同源性（identity）和50％相似性（similarity)；glnZ基因下游是aat-like基因，与E.coli和Bacillus subtilis aat基因（编码天冬氨酸氨基转移酶，aspartate aminotransferase)有同源性和相似性都为26％和42％；aat-like基因下游是部分ftsK-like基因，与E.coli ftsK基因（编码肽聚糖，peptidoglycan)N-端有42％同源性和56％相似性，这几个基因在GenBank中的登录呈是AF279917。     

绵羊APOA4基因的生物信息学分析

为进一步探索绵羊APOA4基因及其编码蛋白的生物学功能，给APOA4基因与绵羊健康和生长发育的关系提供依据，以绵羊载脂蛋白A-IV(Apolipoprotein A-IV，APOA4)基因为研究对象，采用生物信息学数据库及分析软件进行生物信息学分析，预测绵羊APOA4基因基本结构、理化特性和生物学特征。结果显示，绵羊APOA4基因ORF编码380个氨基酸残基，编码蛋白为不稳定亲水蛋白，存在信号肽，不存在跨膜结构，为分泌性蛋白，主要在细胞外发挥生物学作用，二级结构和三级结构均以α-螺旋为主。绵羊APOA4基因编码蛋白与山羊和牛的同源性最高。     

梨火疫菌(Erwinia amylovora)环腺苷酸受体蛋白基因(crp)的功能分析

梨火疫菌(Erwinia amylovora)可引起梨、苹果等蔷薇科(Rosaceae)植物的火疫病.在菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)中,由crp基因编码的环腺苷酸受体蛋白(cyclic adenosine monphosphate(cAMP)receptor protein,CRP)对果胶酶基因的表达调控和菌株致病性起着重要的作用.本研究首次鉴定并克隆出梨火疫菌中的crp同源基因,命名为Eacrp,并通过同源重组的方法,构建了梨火疫菌的crp基因突变体Ea△crp以及互补子,进行了致病性、过敏性反应、胞外多糖、鞭毛运动等一系列相关表型的鉴定.结果表明,crp基因影响着梨火疫菌的致病性、胞外多糖、游动性、生长情况等多种生物学特性,然而,Ea△crp仍能引起烟草过敏性反应,并且在过氧化氢敏感度以及沉降性、生物膜和AI-2信号分子的生成方面与野生型菌株相比差异明显.本研究结果说明,梨火疫菌crp基因对病菌的胞外多糖分泌、生长、游动性以及致病性方面具有关键作用.     

RT-PCR克隆籼稻叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA及序列的in silico分析

根据日本晴cab4基因序列（GenBank：AK104499.1）设计引物,用RT-PCR的方法从籼稻9311中克隆了叶绿素a/b结合蛋白基因的全长cDNA,命名为cab-9311（cab gene from 9311）。insilico分析表明：cab-9311与cab4基因同源性为99%,编码的蛋白含有244个氨基酸,与cab4基因编码的蛋白同源性为98%。蛋白分子质量为26.9kD,理论等电点为6.52。第54位～第216位氨基酸是一个典型的叶绿素a/b结合蛋白功能域（chlorophyll a/bbinding domain）。跨膜分析和蛋白质三级预测显示,该蛋白在C端有一个典型的跨膜区。亚细胞定位分析表明该蛋白定位于叶绿体,是一个叶绿体内囊体膜上的锚定蛋白。     

猪5-HT4b受体基因cDNA克隆和序列分析

利用RT—PCR技术克隆了猪5-HT4bR基因的核苷酸序列，并利用生物信息学手段进行了验证。核苷酸序列测定与分析表明，该基因片段全长1209bp且包含一个完整的开放阅读框，编码402个氨基酸。该序列已在GenBank登录（Accession No．AY566638）。序列分析结果表明，该基因与已报道的人、鼠等5种动物5-HT4bR基因具有较高的核酸序列和氨基酸序列同源性，分别为92．56％和93．63％。该基因编码的蛋白具有7次跨膜结构，属于G蛋白偶联受体超家族。     

洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19嗜铁素合成相关基因cepR的克隆及生物信息分析

本研究采用PCR方法克隆了洋葱伯克霍尔德氏菌CAS19嗜铁素合成相关基因cepR,并对cepR基因编码蛋白的结构和功能进行生物信息学分析和预测。同源性分析表明,CAS19的cepR核苷酸序列与Burkholderiacepacia LMG1222cepR基因的同源性为99％;cepR基因全长768bp,包含一个完整的231bp的开放阅读框架,编码239个氨基酸;该基因编码蛋白分子量为26．59kD,理论的等电点为5．55,含有一个LuxR型HTH结构域,在氨基酸残基的不同区域分布有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪氨酸激酶磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点和N-糖基化位点,还有一个明显的跨膜结构。本研究结果将为洋葱伯克霍尔德氏菌嗜铁素合成相关研究提供调控基因信息和参考依据,并为其进一步开发和利用奠定基础。     

马铃薯花青素转录激活基因stmyc的克隆与表达分析

根据GenBank 核酸数据库中报道的紫苏myc mRNA基因保守序列设计引物，用RT-PCR方法从紫色马铃薯紫皮RNA中获得花青素转录激活类基因stmyc的5’端保守区域， 通过3’-RACE获得长为600bp左右的序列。测序结果表明：基因全长1106bp，含有完整的阅读框，编码326个氨基酸，命名为stmyc，其编码的蛋白与紫苏myc基因编码蛋白的同源性02为46.98%，并具有典型的bHLH结构域。RT-PCR表达分析结果显示stmyc基因在紫色马铃薯皮、肉、茎、叶、根中都有表达，其中在紫茎中的表达量最高，紫皮中表达量最低；且该基因在白色马铃薯的皮、叶和肉中都有表达，推测该基因在马铃薯中为组成型表达。     

花生种子芽期耐低温相关基因克隆

利用GeneFishing技术获得耐低温花生品种花育44号种子在常温与低温诱导下的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)ACP20和ACP2。BLAST比对后发现ACP20基因与花生油质蛋白基因同源性达99%,ACP2基因与花生nifU-like(铁硫簇蛋白)蛋白mRNA同源性达99%,说明油质蛋白和nifU-like蛋白可能与花生对低温逆境胁迫的抗性有关。通过RACE技术从该品系获得相关基因的完整编码区,对其进行生物学功能预测,为探讨花生耐低温分子机制乃至培育耐低温花生新品种奠定了基础。     

水稻受稻瘟病菌诱导的转座类似蛋白新基因RIM2的分离与鉴定

以近等基因系H7R和H7S为材料，运用差别显示（DD－PCR）技术获得RMal9片段。用此片段为探针筛选cDNA文库，获得3944bp全长基因RIM2。Northern杂交华结果显示该基因在水稻抗感品系中均受稻瘟病菌的强列诱导。RIM2 ORF编码653个氨基酸，其序列与多种植物转座类似蛋白有32％－55％的同源性，其5′端约800bp与Xa21基因家庭Al，C的非编码区有82％的序列同源性。Southern杂交表明RIM2多拷贝存在与水稻基因组中。RIM2为一新的受病菌诱导的早期反应基因。     

猪圆环病毒Ⅱ型SC株ORF3基因克隆及其编码蛋白的生物信息学分析

本研究根据GenBank登录的猪圆环病毒基因组序列(DQ180392.1)来设计引物,用PCR法扩增出PCV-2四川株(PCV-2SC)ORF3基因,并克隆到PMD19-T载体进行测序,同时利用在线生物信息学软件及数据库对ORF3基因及其编码蛋白进行生物信息学分析。研究结果表明,成功构建了命名为P-S-PCV-2SCORF3的重组质粒;测序结果得知PCV-2SCORF3基因全长315bp,共编码104个氨基酸;BLAST比对发现该基因与GenBank中国内外参考毒株核苷酸同源性在98%~100%之间。利用在线生物信息学软件对PCV-2SCORF3编码蛋白结构特征进行分析,发现该蛋白含有12个潜在的磷酸化位点,ORF3成熟蛋白有4个主要的抗原位点;亚细胞定位分析结果表明,编码蛋白主要存在于线粒体中和细胞核中并各占43.5%和34.8%,这证实了PCV-2SCORF3编码蛋白属于胞质蛋白,抗原区位集中于胞膜,有向胞核移动的趋势,功能强大,可能与细胞凋亡有关。疏水性分析发现,该编码蛋白具有一定的疏水性,与该蛋白的表面抗原决定族和膜蛋白中穿越膜的肽片段及该蛋白的高级结构的形成有关,预示其高疏水性区又与膜蛋白的跨膜区有...     

结球甘蓝BoFBX117基因的克隆与表达分析

F-box基因在植物组织器官发育及非生物胁迫响应中起着重要的作用。为进一步探讨其作用机制,从结球甘蓝品种BoJF-16-1中利用反转录PCR(RT-PCR)技术克隆得到一个F-box基因BoFBX117,其cDNA全长为936 bp,编码311个氨基酸,蛋白分子量为30.14 kDa,等电点为9.71。该基因编码BoFBP7蛋白,序列同源性分析表明,BoFBP7与芜菁、萝卜、拟南芥的FBP7蛋白亲缘关系较近,同源性分别为99.36%、98.39%、92.26%;实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析表明,BoFBX117基因在结球甘蓝莲座叶中最高,其次是根,幼叶中表达量最低,表现出组织特异性;在低温胁迫处理下,该基因表达量总体呈现上升趋势,说明该基因的表达受低温胁迫诱导。推测BoFBX117基因可能在结球甘蓝叶片发育及低温胁迫中发挥重要的生物学功能。本研究为深入解析F-box基因调控植物生长发育及非生物逆境胁迫的分子机制提供了依据。     

鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达研究

根据Genbank上发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了由2个外显子和1个内含子组成的鹅脂联素基因。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3 Da、5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏、肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾、肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢、间脑中低度表达。本试验结果为进一步研究脂联素的功能及作用机制奠定了基础。     

中国水仙凝集素基因NTA的克隆、序列分析及蛋白结构预测

凝集素是一种糖专一性结合蛋白,它可以识别不同的糖类。植物凝集素是植物防御系统重要的组成部分。本研究采用RT-PCR的方法,从中国水仙花蕾中克隆了凝集素基因NTA,运用生物信息学方法对其核苷酸序列、编码的氨基酸序列进行分析以及对其蛋白结构进行预测。结果表明,得到的NTA基因全长698bp,包含一个完整的开放阅读框516bp。该基因编码一个含有172个氨基酸的凝集素前体蛋白,该前体蛋白的等电点和分子量分别为5.84和18615.19Da。序列比对结果表明该基因编码的蛋白与其他单子叶植物如杂种水仙、雪花莲、君子兰、石蒜花和孤挺花的凝集素蛋白的同源性较高,分别为84%、80%、77%、78%以及82%。蛋白结构预测表明,中国水仙凝集素蛋白与洋水仙凝集素蛋白在结构上非常相似。对该基因编码的蛋白进行分析及蛋白结构模拟可知,该蛋白含有三个特殊的功能结构域和alpha-D-甘露糖结合表面(QXDXNXVXY)。     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种中Fsr1基因的克隆及生物信息学分析

以尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种为材料,克隆其Fsr1基因的DNA及cDNA全长,并对其进行生物信息学分析。根据镰刀菌中相关基因设计简并引物,结合PCR与RT-PCR技术扩增目的片段,进行氨基酸序列推导后分析。得到结果 FoFsr1基因开放阅读框为2 474 bp,共编码824个氨基酸;FoFsr1基因编码蛋白可能是存在于细胞核中的跨膜亲水蛋白,含有54个蛋白磷酸化位点,不含有信号肽;该蛋白主要含有1个Striatin结构域及7个WD40结构域,二级结构主要由β折叠和无规则卷曲组成,其中不含有亮氨酸拉链结构;同源性分析发现其与丛赤壳菌属中的Fsr1蛋白亲缘关系最近。通过结构分析发现,推测该蛋白可能在细胞周期及细胞凋亡过程中起信号转导与转录调控的作用,从而对病原菌的致病力产生影响。     

紫杆柽柳谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及功能鉴定

根据GenBank已公布的植物谷胱甘肽硫转移酶基因EST序列，设计引物利用3’和5’RACE方法，获得紫杆柽柳GST基因(TaGST)全长cDNA序列，全长为1175 bp，开放读码区672 bp, 编码224个氨基酸。其所编码的蛋白与大豆的GST10同源性最高为48%。利用pET-28a（+）构建了紫杆柽柳GST基因的原核表达载体，转入BL21大肠杆菌进行了原核表达。诱导表达蛋白的SDS-PAGE检测表明, 所表达的蛋白分子量约为26 kD，与预测的分子量大小一致。初步的酶学活性的检测表明所克隆的基因编码的肽段具有催化GST蛋白通用底物CDNB和GSH反应的活性。     

花生果种皮发育相关特异基因的克隆和表达分析

本实验从花生果皮种仁抑制消减文库中筛选出了一个255bp的EST序列并进行了研究。构建了花生果种皮全长cDNA库并从中筛选出该基因的全长,命名为AhPSG8。此基因全长1118bp,开放阅读框第33～833个碱基,编码266个氨基酸残基组成的多肽。由生物信息学分析表明该基因编码多个活性位点蛋白,可能与细胞内DNA的转录有关;结构分析揭示出AhPSG8具有一个跨膜区,N端是一个由20个氨基酸组成的信号肽;该基因与已发表的基因序列没有明显的同源性,为一新基因;RT—PCR研究该基因在花生中的表达,结果显示该基因在果种皮中特异表达,10～40d果皮中丰富表达,推测为与花生果种皮发育相关基因。     

少动鞘氨醇单胞菌ZX4儿茶酚2,3-双加氧酶基因的克隆与序列分析

利用PCR扩增分离得到了少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobotis)ZX4菌株的儿茶酚2，3-双加氧酶基因(c230-ZX4)。核苷酸序列测定与分析表明，该基因片段全长924bp且具有一个完整的阅读框，编码306个氨基酸残基。序列分析结果表明，该基因与已报道的来自菌株Sph.yanoitcuyae B1和Sphingomonas sp．KMG425的xylE基因(编码产物均为C23O)具有较高的核酸序列同源性，分别为94．37％和94．05％；与研究较多的Pseudomonas putida的TOL型质粒pWWO上的xylE基因同源性仅为57．79％。与其同源性较高的xylE基因编码的多肽氨基酸序列比较发现，c23O-ZX4编码产物的第86、92、113、125、126、182、185、186、216及218位的氨基酸残基均有所不同。     

长穗偃麦草HKT1;4基因片段的克隆及序列分析

根据已报道的其他植物高亲和钾离子转运蛋白（HKT1;4）基因的保守序列设计一对简并性引物,以长穗偃麦草幼根总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆出长穗偃麦草HKT1;4,基因命名为EeHKT1;4。结果表明：该基因片段长度为614 bp,编码204个氨基酸,所得序列与其他植物氨基酸序列同源性均在80%以上,特别是和一粒小麦TmHKT1;4氨基酸同源性高达92%。这为长穗偃麦草HKT1;4全长基因的克隆及其耐盐分子机制的研究奠定基础。     

烟夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与表达

应用RT-PCR技术，从烟夜蛾(Helicoverpa assulta)幼虫脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素延伸蛋白基因的cDNA片段，扩增得到的片段全长390bp，编码一个长为129个氨基酸残基的蛋白质，预测分子量14.8kDa。同源性分析表明，此cDNA序列为ubiquitin-53aa extension protein(ubi-53，UBE)基因，在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白(ribosomal L40 protein)。使用Clustal W软件，对cDNA编码的氨基酸序列进行了同源性分析，分析表明：烟夜蛾的泛素延伸蛋白氨基酸序列与其他真核生物泛素延伸蛋白氨基酸序列高度同源（90%－98%），与棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素的同源性为69%。将烟夜蛾的UBE基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上，转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG进行诱导表达，电泳检测到一条约40kDa大小的外源蛋白，用鼠抗GST抗体进行Western blot检测表明原核表达蛋白是目的蛋白。