冷休克和冷冻对猪精子微细结构和精清内酶的影响

用9头梅山、8头二花脸和4头苏白公猪的精液进行了冷休克和冷冻试验.共分原精(对照)、稀释、稀释后平衡和冷冻四种情况,10个处理组别。结果表明,冷休克使猪精于活力明显下降,并随着低温处理的延长和冷冻过程而加剧.冷休克后光镜下顶体形态主要表现为质膜膨大,顶脊突出或形成皱褶。稀释后平衡有保护顶体减轻冷休克损伤的迹象.冻后精子主要表现为顶体严重肿胀,起泡乃至破裂.原精的顶体完整率与活力呈正相关(r=0.60,p<0.01),低温处理后这两个性状的相关不显著。猪精子冷冻前后的电镜观察研究揭示,解冻后精子的主要损伤部位在顶体.冻后精子质膜严重膨大、破裂,顶体外膜肿胀,形成小泡,顶体內容散失.试验中未见到由质膜和顶体外膜共同形成的所谓“杂合泡”。冷休克和冷冻后精清内 GOT 和 LDH 活性增加,冻后精清內 LDH 为原精的1.5倍,GOT 为原精的13.6倍。低温处理对精清内 GPT 活性的影响不大。用琼脂糖凝胶电泳分离猪精清,得到5条 LDH 同功酶区带.原精冷休克后 LDH—4上升(p<0.05),解冻后精清內 LDH—4上升(p<0.01),原精经稀释平衡后,M—LDH明显升高。     

不同冷源对民猪精液冷冻保存效果的影响

用干冰和液氮作为冻源对民猪精液冷冻效果进行研究,包括对精子活率及顶体完整率的影响.结果表明,以干冰为冻源进行民猪精液冷冻,解冻后精子活率为43.5％,顶体完整率为52.2％;以液氮为冻源进行民猪精液冷冻,解冻后精子活率为41.8％,顶体完整率为51.5％,二者差异不显著.     

添加剂在猪精液冷冻保存中的应用

猪精液的冷冻保存显著影响猪精子的运动学参数,损伤精子质膜、顶体和DNA完整性,降低解冻后精子活率和受精能力.近年来,在以甘油和蛋黄作为冷冻保护剂的基础上,为了有效降低冷冻-解冻对精子的损伤,提高解冻精液的受精能力,研究人员将OEP、抗氧化剂(甲基黄嘌呤、丁羟基甲苯、谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、褪黑素和维生素E等)、2-羟丙基β环糊精以及透明质酸等物质作为添加剂应用于猪精液的冷冻保存,结果表明这些物质在保护精子质膜和顶体完整性,提高解冻后精子活力、活率和受精能力等方面均有显著作用.     

影响杜泊绵羊精液冷冻效果的因素分析

试验分剐采用四种不同冷冻稀释液配方（A、B、C和D）,不同稀释与平衡方法（一步稀释法和两步稀释法）。不同冷冻步骤（直接冷冻法和液氮熏蒸法）．不同解冻方法（漫解冻法和干解冻法）以及不同甘油浓度（4％、5％和6％）进行杜泊绵羊细管冻精的制备,结果发现：分剐以稀释液B、两步稀释法平衡、液氮熏蒸法冷冻、湿解冻法及5％甘油浓度的效果为最佳,冻精解冻后人工授精的妊娠率达到62％。     

HSP90蛋白表达量与牛精子抗冻性的关系

【目的】探索热应激蛋白90（HSP90）表达量与牛精液冷冻-解冻后品质的关系。【方法】采用假阴道法采集身体健康、年龄2～4岁的9头荷斯坦奶牛精液（编号1～9）,测定新鲜精液指标（活力、形态、活率和密度）,评定其品质,合格的精液样品经过冷冻解冻后检测其精子活率、质膜完整率和顶体完整率,并根据冻后品质将其分为HFTs(High freezing resistance teams)和LFTs（Low freezing resistance teams) 2组,对精子HSP90蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳和Western blot检测,分析其表达量与精子抗冻性的关系。【结果】不同牛个体精液冻后品质相差较大。SDS-PAGE电泳结果显示,HFTs组的分子质量约为90 ku的蛋白表达量显著高于LFTs组（P＜0.05）,经Western blot分析,该蛋白为HSP90。HSP90蛋白表达量与冷冻-解冻后的牛精子品质呈明显正相关,其与精子活率、顶体完整率、质膜完整率的相关系数分别为0.364,0.447和0.402。【结论】HSP90蛋白表达量可以作为判断牛精子抗冻性的指标之一。     

超低温保存对猪精子酶蛋白的影响

为研究猪精子超低温保存前后差异酶蛋白表达,以期在蛋白质水平探索猪精子冷冻损伤机制,本研究采用双向电泳分离精子蛋白,硝酸银染色凝胶,ImageMaster2D platinum 5.0软件分析差异蛋白质斑点并经MALDI Tof/Tof质谱鉴定。结果表明:冷冻前后精子存在53个差异蛋白点,在NCBInr蛋白数据库中搜索到有意义的差异酶蛋白6种:类组氨酸磷酸酶14(like-PHP14)、烯醇酶(ENO)、二氢硫辛酸脱氢酶(PDC3)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、鸟苷酸环化酶受体和RNA聚合酶II相关蛋白1,前4种冷冻-解冻后下调,后2种在冷冻-解冻精子中未检测到。说明冷冻前后猪精子存在差异酶蛋白质,为进一步研究猪精子蛋白质组学及揭示精子冷冻损伤机制提供了依据。     

中药提取物川芎嗪及葛根素在猪精液冷冻中的应用效果初报

为了进一步提高猪精液的冻后品质,为中药提取物在猪精液冷冻中的应用提供参考数据,采用手握法采集成年种公猪精液,预处理后用添加不同剂量盐酸川穹嗪(0、0.08、0.10、0.12 mmol/L)和葛根素(0、0.001、0.01、0.10 mmol/L)的稀释液稀释,经平衡、冷冻、解冻后采用考马斯亮蓝对精子进行染色,然后在显微镜下检查精子畸形率和顶体完整率。结果表明,不同浓度的盐酸川穹嗪均能显著降低冻后精子的畸形率,显著提高冻后精子的顶体完整率,其中0.12 mmol/L盐酸川穹嗪效果最好。一定量葛根素不能显著降低冻后精子的畸形率,也不能显著提高冻后精子的顶体完整率。     

除去精浆、添加维生素E及水浴平衡对莎能奶山羊精液冷冻效果的影响

主要探讨精液离心、添加VE及平衡方法对山羊细管冻精冷冻-解冻后活力、顶体完整率等的影响,为提高山羊精液冷冻保存效果提供依据.试验1:将鲜精稀释后分为3组,第1组为稀释精液1 000 r/min离心6 min,去掉一半的上清液;第2组用相同的方法反复离心3次,完全去掉精浆;第3组不离心,做为对照.试验2:在稀释液中添加15 g/L VE,以不添加组作为对照.试验3:采用纱布包裹和水浴平衡两种方法.试验结果表明,离心去掉部分精浆组和离心去精浆组精子冷冻-解冻后的活力比不离心组高,差异显著(P＜0.05).精子顶体完整率和畸形率有所下降,但与对照组相比较差异不显著(P＞0.05).离心去掉部分精浆组和离心完全去精浆组相比,精子冷冻一解冻后的活力、顶体完整率和畸形率差异不显著(P＞0.05).冷冻稀释液中添加VE组的顶体完整率显著提高(P＜0.05),畸形率变化与对照组无差异(P＞0.05),精子活力提高效果也不明显(P＞0.05).精液冷冻前平衡方法以水浴法为好,与纱布包裹平衡组相比,水浴平衡组的活力和顶体完整率高(P＜0.05),精子畸形率较低(P＜0.05).可见,精液离心后去掉适量精浆可显著提高冷冻后精子的活力;添加VE可显著提高精液冷冻后精子的顶体完整率;与纱布包裹平衡法相比,水浴平衡法可显著提高精液冷冻后精子的品质.     

圆筒形贮存管对猪精液冷冻保存效果的影响

试验研究了用圆筒形贮存管冷冻猪精液时不同漂浮时间和解冻时不同解冻温度、时间对冷冻保存效果的影响。猪精液冷冻时,圆筒形贮存管在放入液氮罐前,先置液氮面上3 cm处,分别漂浮熏蒸5、10、15、20 min后投入液氮中保存。精液解冻时,分别在37℃＋1.5 min、52℃＋1.0 min、70℃＋0.5 min解冻处理。结果表明,漂浮15 min处理可显著提高猪精液冷冻后的精子活率、质膜完整率和顶体完整率。52℃＋1.0 min处理组的猪精液冷冻后精子活率、质膜完整率和顶体完整率显著高于其它2个处理组。试验结果还证实,用圆筒形贮存管冷冻猪精液是可行的,所获得的冷冻后最高精子活率与用0.25 mL麦管获得精子活率无显著差异。     

猪精液冷冻与常温保存技术的研究

为研究冷冻保存和常温((17±0.5)℃)保存后猪精子活率、活力和顶体完整率,比较了猪精液冷冻稀释液中2种甘油含量细管法的快速冷冻效果,以及不同解冻温度对冷冻精液的影响,采用细胞计数法、FDA-PI双重染色法与Giemsa染色方法检测精子的活率、活力和顶体完整率。结果显示:3%(体积分数,下同)甘油冷冻解冻后精液的活率、活力(38.54%、52.24%)显著(P<0.05)高于2%甘油组(15.63%、28.22%),但3%甘油组顶体完整率(11.55%)显著(P<0.05)低于2%甘油组(21.71%)。38℃水浴解冻后的精子在39℃培养箱中4 h内活率高于0.3,而50℃水浴解冻后1 h后的活率低于0.3。精液稀释液Anderohep和BTS在常温((17±0.5)℃)保存新鲜猪精子的活率与顶体完整率上效果相似,保存3 d内精子活率达0.6以上,保存6 d内精子活率为0.3以上。结果表明,使用3%甘油冷冻保存及2种常温保存稀释液均可以较好地保存精子。     

不同获能方法对冻融塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化的影响

为探讨不同获能方法对塔里木马鹿精子体外获能及其蛋白酪氨酸磷酸化水平的影响,冻融塔里木马鹿精子随机分为4组,用钙离子载体、肝素、咖啡因和 Percool 离心4种方法进行精子获能的诱导,利用金霉素（CTC）染色法评价精子获能状态,采用 SDS-PAGE 分离精子膜蛋白,进行 Western blotting 免疫印迹分析,检测酪氨酸磷酸化蛋白的表达水平.结果显示,冻融精子经4种精子获能方法处理后,肝素诱发的精子获能率显著高于钙离子载体组和 Percool 组（P ＜0．05）.钙离子载体组、肝素组和咖啡因组精子蛋白酪氨酸磷酸化水平高于 Percool 组和对照组.另外,冻融精子随着上游处理及肝素诱导获能的进行,检测到分子量分别为14,25~30,40,47,55 ku 的酪氨酸磷酸化蛋白,这些蛋白的酪氨酸磷酸化水平在获能60~120 min 期间相对较高,而且此时精子获能率及超激活运动精子比例也显著提高（P ＜0．05）.结果提示,肝素可以较好的诱导马鹿精子获能,马鹿精子获能与蛋白酪氨酸磷酸化相关.     

他克林对猪精子冻后质量、抗氧化能力及糖代谢的影响

旨在研究他克林对猪精液冻后质量、抗氧化能力及糖代谢的影响机制。手握法采集12头18～24月龄健康杜洛克种公猪精液,在其冷冻保存稀释液中加0.10mmol/L他克林并冷冻保存,检测冻后精子活率、质膜完整率、顶体完整率和畸形率、线粒体膜电位、DNA完整性,同时利用试剂盒检测总抗氧能力、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、总胆固醇含量、丙酮酸含量及己糖激酶活性。结果表明,与鲜精相比,冻融后精子活率和质膜完整率、顶体完整率、线粒体膜电位、DNA完整性、抗氧化能力及糖代谢指标均极显著下降,畸形率极显著升高。与空白组相比,他克林显著提高冻后精子顶体完整率、DNA完整率、超氧化物歧化酶、丙酮酸含量;极显著提高精子活率、质膜完整率、线粒体膜电位、总抗氧能力、丙二醛含量、总胆固醇含量及己糖激酶活性,极显著降低畸形率。总之,猪精液冷冻前添加浓度为0.10 mmol/L的他克林可能通过提高抗氧化能力和糖代谢水平改善冻融后猪精子的质量。     

猪精液预处理稀释液与冷冻基础液的配伍效应

采用6种预处理稀释液对猪精液进行预处理,然后用3种冷冻基础液冷冻保存,研究精液预处理稀释液和冷冻基础液对精子冷冻保存效果的影响,以及其间的配伍效应。结果表明,不同的预处理稀释液对解冻后精子活力的影响差异显著(P<0.05),而3种冷冻基础液对冻后精子活力的影响差异不显著(P>0.05)。不同的预处理稀释液与冷冻基础液之间存在明显的配伍效应,并且用含甘油的稀释液对平衡不同时间的精液冷冻时,其配伍效应又有所不同。猪精液中去除精清可显著提高精子冻后活力和顶体完整率(P<0.05),有利于提高精液品质。     

褪黑素与盐酸多巴胺在猪精液冷冻保存中的应用效果

为给改良猪精液冷冻稀释液配方提供参考数据,分析了不同浓度褪黑素和盐酸多巴胺对猪精子冷冻后畸形率和顶体完整率的影响。结果表明,10mmol/L褪黑素及3种浓度的盐酸多巴胺(0.1mmol/L,1mmol/L,10mmol/L)均能有效改善冻后猪精子的畸形率和顶体完整率,两种试剂均可在猪精液冷冻中进一步推广应用。     

甘肃棘豆对山羊精子形态和超微结构的影响

对６只１０月龄西农莎能奶山羊公羊按每日１０ｇ／（ｋｇ·ｄ）的剂量单笼饲喂甘肃棘豆粉，１８ｄ后陆续出现中毒症状，精子呈现不同程度的损害：密度下降（最低达１２亿／ｍＬ），畸形率高达２９％；电镜负染色法观察其超微结构，发现精子顶体膨胀、半脱或全脱，尾梢松散；中毒精子顶体完整率（２７．５％）明显低于正常精子（７１．７５％）；用电镜超薄切片法观察精子的超微结构表明，细胞核、顶体及尾部中段线粒体空泡变性，细胞膜、顶体外膜及中段线粒体鞘扩张或断裂。     

单细胞电泳技术检测低温保存猪精子的DNA损伤

应用单细胞凝胶电泳技术(SCGE),对冷冻解冻后猪精子DNA的损伤情况进行研究.结果表明,冷冻解冻会对猪精子DNA造成损伤,其彗星率与鲜精相比差异显著(P＜0.05);各组冻精之间,甘油添加量为2%～3%(v/v)时,冷冻对猪精子DNA造成的损伤最低,彗星率均低于其余各组(P＜0.05).     

双糖对冻融后猪精子质量的影响

在传统的Tris—柠檬酸—葡萄糖(TCG)稀释液基础上,分别添加0.1 mol/L乳糖、蔗糖、海藻糖,并采用细管法对精液进行冷冻,研究不同双糖对冻融后猪精液质量的影响。结果表明:0.1 mol/L的海藻糖和蔗糖相对于对照组和0.1 mol/L的乳糖TCG稀释液能够显著改善冻融后猪精子质量,其冻融后精子的活率、顶体完整率、低渗膨胀率、平均路径速度、运动线速度、平均侧摆幅度和平均鞭打频率均明显提高(P0.05),分别达到42.14%和40.56%,51.48%和49.84%,46.20%和43.01%,32.8μm/s和33.2μm/s,60.80%和59.00%,1.70μm和1.62μm,7.68 Hz和7.62 Hz。TCG稀释液中添加0.1 mol/L海藻糖和蔗糖的猪冷冻精液体外受精的受精能力明显高于0.1 mol/L乳糖组和对照组,其卵裂率分别为41%和38%。     

L-半胱氨酸对冻融后猪精子质量参数和膜脂质过氧化反应的影响

试验检测冷冻稀释液中添加L-半胱氨酸对冻精解冻后精子质量参数、膜脂质过氧化程度的影响。结果显示:(1)在冷冻稀释液中添加0.1 mg.mL-1L-半胱氨酸能显著地提高冻融后精子的活率、顶体完整率及体外受精率(P<0.05),但对运动学参数没有影响(P>0.05)。(2)在冷冻稀释液中添加L-半胱氨酸(0.1、0.2和0.3mg.mL-1L-半胱氨酸)能显著降低膜脂质过氧化水平(P<0.05)。该结果表明冷冻稀释液中添加L-半胱氨酸能改善猪精子的冷冻效率。     

不同抗氧化剂对金华猪精液冷冻保存效果的影响

为了观察冷冻稀释液中添加不同浓度的抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)、绿茶多酚(GTPs)、维生素E(VE)和超氧化物歧化酶(SOD)对金华猪精液冷冻保存效果的影响,分别在冷冻稀释液中添加0.125、0.25、0.5 mmol.L-1的GSH,10、15、20 mmol.L-1的GTPs,1、2、4 mg.mL-1的VE和1 000、2 000、4 000 I U的SOD,采集活率较高的金华猪精液,用上述含抗氧化剂的冷冻稀释液稀释后进行冷冻保存,分别检测4个处理组精子4℃平衡后的活率和解冻后精子活率、质膜完整性、顶体完整率。结果表明,在金华猪精液的冷冻稀释液中分别添加15 mmol.L-1GTPs、2 mg.mL-1VE、4 000 I U SOD可显著提高猪精子4℃平衡后的活率、解冻后精子活率和质膜完整率(P0.05)。