昆明小鼠原始生殖细胞无血清培养基的筛选

【目的】筛选体外培养昆明小鼠原始生殖细胞(PGCs)的最佳无血清培养基,为昆明小鼠胚胎生殖细胞(EGCs)建系奠定基础。【方法】以妊娠8.5~12.5 d昆明小鼠PGCs为材料,采用无血清培养基,在培养基中添加不同组分,组成A、B、C、D、E、F、G 7种培养基,对昆明小鼠PGCs进行体外培养,分离培养胚胎原始生殖细胞,以筛选出其最佳培养基。【结果】D、E、F组均能得到较多的小鼠PGCs阳性集落。MEF-CM和GR-CM组的效果与细胞因子组相比差异不显著,但降低了培养基的成本。【结论】在无血清培养基中添加0.1 mmol/L RA或使用条件培养基MEF-CM和GR-CM,均有利于小鼠PGCs增殖。经过EGCs鉴定,本试验得到的细胞是PGCs,并且在各组培养基中均能够形成EGCs集落。     

GDNF和LIF对小鼠精原干细胞体外增殖的影响

【目的】探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和白血病抑制因子（LIF）对小鼠精原干细胞（SSCs）体外增殖的影响,为后续SSCs的诱导分化、转基因动物生产、基因治疗等研究奠定基础。【方法】收集6～8日龄小鼠睾丸,采用机械法和2步酶消化法获得细胞悬液。通过多次差异贴壁法分离纯化SSCs和支持细胞,采用碱性磷酸酶（AP）染色和RTPCR检测Ngn3和Oct4基因2种方法对SSCs进行鉴定。采用单独添加GDNF（添加量为0,10,20,40 ng/mL）或LIF（添加量为0,500,1 000,1 500 U/mL）的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs,于培养第3,5,7天取样,同时用添加GDNF和LIF（各因子单独添加量两两组合）的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs,于培养第3,4,5天取样,采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测GDNF、LIF对SSCs体外增殖的单因子效应和配伍效应。【结果】与对照组相比,不论培养时间如何,单独添加20和40 ng/mL的GDNF可以显著促进SSCs增殖(P＜0.05),而单独添加不同量LIF对SSCs增殖的影响不显著(P＞0.05);同时添加20 ng/mL GDNF和1 000 U/mL LIF可以显著促进SSCs的增殖,在该条件下当精原干细胞接种密度为(6×10⁴)～(10×10⁴) mL^-1,共培养5 d时,其OD₄₉₀值为0.696。【结论】DMEM/F12培养基中单独添加20 ng/mL GDNF或同时添加20 ng/mL GDNF 和 1 000 U/mL LIF可以显著促进小鼠SSCs的体外增殖。     

EGF促进绵羊附睾上皮细胞体外增殖的研究

【目的】探讨表皮生长因子(EGF)对体外培养的绵羊附睾上皮细胞(EECs)增殖的影响。【方法】分离培养EECs,利用免疫荧光检测角蛋白18(CK18)对分离的细胞进行鉴定,用CCK-8法测定EGF的最佳作用质量浓度,用RT-PCR检测EECs中附睾分子标记——谷胱甘肽过氧化物酶-5(GPX5)和雄激素受体(AR)基因的表达情况,用流式细胞仪法检测EGF对EECs细胞周期和凋亡的影响。将P_4代EECs分别用表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂Gefitinib、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路抑制剂LY294002和DMSO(对照组)处理后,再用EGF培养,用流式细胞仪法检测细胞周期和凋亡情况。将P_4代EECs分别用EGF(-)、EGF、EGF+Gefitinib和EGF+LY294002处理后,用Western blot检测细胞中EGFR、AKT和叉头盒蛋白O1(FOXO1)磷酸化水平。【结果】分离培养的EECs可表达CK18,细胞纯度较好;EGF对EECs增殖促进效应呈浓度依赖性,用含50 ng/mL EGF培养基培养的EECs具有最高的增殖潜能,且不同传代EECs细胞均可正常表达GPX5和AR;EGF处理S期EECs细胞比例极显著升高(P0.01),凋亡指数显著降低(P0.05)。与对照组相比,Gefitinib组S期EECs细胞比例极显著降低(P0.01),LY294002组S期细胞比例显著降低(P0.05);Gefitinib组EECs细胞的凋亡指数极显著升高(P0.01),而LY294002组EECs细胞的凋亡指数无显著变化。EGF组中EECs细胞的EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平较高;与EGF组相比,EGF+Gefitinib组中EECs细胞的EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平明显降低,而EGF+LY294002组中EECs细胞的AKT和FOXO1磷酸化水平明显降低。【结论】EGF可增强绵羊EECs体外生长活力,其作用机制可能是EGF通过介导EGFR和PI3K/AKT信号通路上调了FOXO1的磷酸化水平。     

精原干细胞更新分化的影响因素*

 精原干细胞可以体外培养、冷冻保存、遗传操作及移植，因而在医学、生物学及动物科学方面均有广泛应用前景。根据现有资料阐述一些因素，包括c-Kit受体及其配体SCF、白血病抑制因子（LIF）、维生素A（V_A）、表皮生长因子（EGF）、胶质细胞源神经营养因子（GDNF）、激素和温度，对精原干细胞更新分化的影响。     

温度对小鼠睾丸生精机能的影响

研究了不同水浴温度对小鼠睾丸组织及生精机能的影响。结果表明：30℃水浴对公鼠睾丸组织无明显影响（P＞0．05）；35℃水浴组，公鼠睾丸组织的曲细精管出现明显退化变性现象（P＜0．05）；40℃水浴组公鼠睾丸组织退行性变化极显著（P＜0．01）。生精细胞对温度的敏感程度依次为：精子细胞＞合线期初级精母细胞＞A型精原细胞；生精上皮对温度也较为敏感，支持细胞及间质细胞对温度敏感性较差。     

红壳色中华绒螯蟹仔蟹养殖方式研究

为探讨养殖方式对红壳色不同家系中华绒螯蟹Eriocheir sinensis仔蟹生长的影响,采用室内群体养殖、室内单体养殖和室外稻田养殖3种方式,比较了红壳色(A)、红壳家系中正常壳色(B)、"光合1号"(C),以及拟建立的早熟(D)、近亲早熟(E)育种家系仔蟹的生长特征。结果表明:室内群体养殖方式下,红壳色A组仔蟹的存活率为35.8%,仅与D组有显著性差异(P0.05);A组仔蟹头胸甲宽的变异系数(CV)为27%,个体大小差异较小,与其余组间有显著性差异(P0.05);A组仔蟹体质量特定生长率(SGR)为7.0%/d,各组间无显著性差异(P0.05)。室内单体养殖方式下,红壳色A组仔蟹的存活率为86.7%,显著高于B、E组(P0.05);A组仔蟹头胸甲宽的CV为52%,个体大小差异较大,与C、D组有极显著性差异(P0.01);A组仔蟹体质量SGR为5.7%/d,A组与B、C、E组仔蟹生长差异明显(P0.05)。室外稻田围隔养殖方式下,红壳色A组仔蟹的存活率为3.2%,极显著低于B、C、D组(P0.01);A组仔蟹头胸甲宽的CV为12%,极显著低于E、D组(P0.01);A组仔蟹体质量SGR最低,为8.1%/d,各组间无显著性差异(P0.05)。研究表明,室内单体养殖红壳色仔蟹能显著提高其成活率,有助于获得更多育种家系相关性状的信息。     

睾丸提取液、EGF、雌激素对小鼠精原干细胞 体外存活和增殖的效果

为探讨成年小鼠睾丸提取液(testicularabstract,TA)、表皮生长因子(epidermalgrowthfactor,EGF)、雌二醇-17β(estradiol-17β,E2)对小鼠精原干细胞(spermatogonialstemcells,SSCs)体外存活及增殖的作用。用胶原酶-胰蛋白酶消化、差速贴壁法分离8d小鼠的SSCs,培养于STO细胞饲养层上,培养液中分别添加不同浓度的TA、EGF和E2,观察SSCs的存活时间和增殖能力。结果显示,添加3种因子后,SSCs的平均存活时间与对照组相比虽无显著差异。但在20～40ng/mlEGF和10～100pg/mlE2组中SSCs的平均存活时间均明显延长,且在较长时间段内观察到了处于明显增殖期的细胞。提示20～40ng/mlEGF和10～100pg/mlE2对小鼠SSCs的体外存活和增殖具有一定良好作用。     

不同胁迫条件下6种药品对罗非鱼存活率的影响

为探究不同胁迫条件下牛磺酸(A)、维生素C(B)、葡萄糖(C)、泼洒姜-芳草(D)、应激宝(E)和渔精元(F)6种药品对罗非鱼存活率及行为的影响。本研究以罗非鱼(17.03±5.21)g为实验对象,观测其在缺氧、二氧化氯及氨氮胁迫条件下6种药品对罗非鱼的存活情况及影响。结果表明:在缺氧胁迫下,144 min后E组的罗非鱼存活率最高为33.33%,其它各组存活率均为0%;360 min后各组的存活率均为0%;在二氧化氯的胁迫下,B组与其它各组差异显著(P0.05),75 min后B组的存活率最高(100%),其它组存活率均为0%;在氨氮的胁迫下,F组与各组差异显著(P0.05),360 min后F组的存活率(93.33%)最高。     

猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫研究

将昆明鼠随机分为A,B,C,D4组,各组分别采用含有猪轮状病毒(RV)JL94株VP7基因的重组真核表达质粒pcDNA-VP7,含有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH98株N基因的重组真核表达质粒pcDNA-N,pcD-NA-VP7和pcDNA-N、真核表达载体pcDNA3.1(+),肌肉注射3次,每次间隔2周。首次注射前后定期采血,检测血清抗体和外周血淋巴细胞中CD4+,CD8+T细胞数量的变化。A,C组小鼠血清在首免后第14天即可检出针对RVVP7的阳性抗体(P/N≥2.0)。B组小鼠血清在首免后第39天检出针对TGEVN蛋白的阳性抗体(P/N≥2.0)。A,B,C组小鼠在首免后外周血CD4+、CD8+T细胞数量与D组小鼠相比,在不同时间有显著差异(P<0.05),并明显高于D组小鼠。说明猪轮状病毒与传染性胃肠炎病毒核酸免疫后能诱发机体免疫反应。     

克服小鼠早期胚胎体外培养发育阻滞的研究

为探讨不同培养基及共培养对克服小鼠早期胚胎体外发育阻滞的影响,用不同成分组成的5种常用培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养,后以KSOM作为基础培养基,KSOMFBS为对照,分别与小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和卵丘细胞(CC)进行共培养,观察从2细胞发育到4细胞的胚胎数和囊胚数的变化。结果发现5种培养液中从2-细胞发育到4-细胞的胚胎率为30.5%~43.5%,差异不显著。KSOM组囊胚率为40.9%,显著高于其他各组(27.9%~30.0%)。共培养后,各组中克服发育阻滞的胚胎数和囊胚数均有显著提高,其中添加胎牛血清组4细胞胚胎数和囊胚数显著高于不添加组,输卵管上皮细胞组显著高于卵丘细胞组。结果显示共培养对克服小鼠2-细胞发育阻滞作用明显,添加胎牛血清效果明显好于不添加,输卵管上皮细胞共培养效果好于卵丘细胞。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明：1）在7H染色体的84.30—86.00cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2）该基因长1 033bp,其完整开放阅读框为762bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域（分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸）。3）同源比对与系统进化分析表明：青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具...     

岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究

【目的】研究岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性。【方法】采用组织分离法分离纯化魔芋软腐病球茎及叶柄中的致病菌,通过魔芋球茎、胡萝卜及马铃薯块的侵染试验初步确定其致病性,再利用魔芋球茎侵染致病及盆栽致病性试验确认其致病性;经菌落与细胞形态、生理生化特性及16SrRNA序列测定确定病原菌的类型。【结果】从魔芋软腐病球茎及叶柄中共分离获得16株细菌,侵染试验表明,其中CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1、CDS2-B2、CZS-B4和CZS-B6共6株细菌可使魔芋球茎表现软腐症状,并导致盆栽魔芋发病;6株细菌的菌落与细胞形态均存在差异;在魔芋、胡萝卜及马铃薯块上的侵染能力不同;16SrRNA序列分析表明,菌株CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2均与菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)亲缘关系最近,菌株CZS-B4与菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)亲缘关系最近,相似度为98.8%,菌株CZS-B6与菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的相似度达99.9%。【结论】导致岚皋县魔芋软腐病的致病细菌存在生物多样性,其致病性也存在差异,其中新发现的魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pecto-bacterium chrysanthemi)致病性最强,菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)致病性较弱。     

广西4种丛生竹基本特性的研究

以广西壮族自治区4种丛生竹:撑篙竹、花吊丝竹、粉单竹和马蹄竹为研究对象,探索其横切面维管束分布特征以及主要物理力学特性。结果表明,粉单竹维管束分布较为紧密,维管束密度最大,撑篙竹、花吊丝竹维管束分布较为分散,马蹄竹维管束密度最小;粉单竹的基本密度、气干密度和全干密度,以及力学特性在4种丛生竹中最大,其次是花吊丝竹,撑篙竹与马蹄竹物理力学特性相近。研究发现,粉单竹材性最好,可进行工业化加工利用,花吊丝竹、撑篙竹及马蹄竹可分离出竹青部分再进行高效加工利用。     

危害陕西茶区茶树的小绿叶蝉种类订正及对我国茶树小绿叶蝉的再认识

【目的】通过对危害陕西茶区茶树的小绿叶蝉进行鉴定,明确陕西茶区该类害虫的学名和特征,并对危害我国茶树的小绿叶蝉种类进行了探讨。【方法】运用网捕法采集小绿叶蝉成虫,用显微照相机(CCD)拍摄成虫照片,在解剖镜下观察其一般形态和雄性外生殖器特征,并对小绿叶蝉种类进行鉴定。【结果】采自陕西茶区茶园的小绿叶蝉的外部形态和雄性外生殖器特征与小贯小绿叶蝉Empoasca(Matsumurasca)onukii相同,而与该地已有报道的小绿叶蝉的特征不同。【结论】危害陕西茶区茶树的小绿叶蝉应为小贯小绿叶蝉(Empoasca(Matsumurasca)onukii),我国茶树小绿叶蝉的种名有待进一步明确。     

陕西菜田2种粉虱数量结构及烟粉虱生物型鉴定

旨在研究陕西菜田烟粉虱和白粉虱的数量结构,为粉虱风险评估和防治策略制定提供理论依据。利用定点调查与普查相结合的方法,对陕西关中、陕南和陕北不同生态区、不同季节、不同蔬菜作物以及不同菜田烟粉虱和温室白粉虱的种群分布和组成进行研究,并结合mtDNA-CO1标记基因实现对陕西菜田烟粉虱的生物型鉴定。结果表明,烟粉虱和温室白粉虱的分布和种群组成因地区、季节、作物种植模式不同而异。其中烟粉虱均呈现优势分布,并占到种群数量的67.2%～100%。采用标记基因技术、序列同源性分析和系统发育研究,明确了陕西菜田烟粉虱生物型为Q型烟粉虱。     

新疆南疆部分地区3种璃眼蜱的分子生物学鉴定

旨在对新疆南疆部分地区璃眼蜱属的蜱进行分子生物学鉴定,了解其分布情况。采集新疆南疆部分地区蜱,通过形态学鉴定将璃眼蜱属蜱作为样本,通过12SrDNA和16SrDNA基因扩增、测序及序列分析进行蜱种类鉴定。13个采样点共559只璃眼蜱属蜱,鉴定为3种,分别为小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。     

苏州近郊4种不同森林群落稳定性研究

稳定性是一个评价群落结构与功能的指标,一直是生态学研究的热点。本文依据林分地上部分指标建立稳定体系,对苏州近郊4种人工林分,应用数学生态学方法,分析冬青针阔混交林、栎树针阔叶混交林、湿地松林和木荷林的林分稳定性。结果表明,多样性并不完全能够代表稳定性;4种林分群落稳定性主要因林分密度不同而异;稳定性依次为湿地松林＞冬青湿地松林＞栎树湿地松林＞木荷林。其中湿地松林可能会发展成为针阔混交林;木荷林中在生长过程中会因竞争产生限制,可能演替形成栎树—木荷混交林;2种针阔混交林在未来演替也可能向落叶阔叶、常绿阔叶混交林发展;该地区木荷林密度过大,稳定性较弱,应采取适当的抚育措施,提高其林分稳定性。     

外源蛋白在苜蓿体细胞胚中的表达

【目的】探讨转基因苜蓿植株根、茎、叶和体细胞胚中外源GUS的表达情况,为外源蛋白在苜蓿体细胞胚中的积累提供理论依据。【方法】以在加拿大广泛种植的N4.4.2紫花苜蓿品种的叶柄为外植体,进行农杆菌GV3101介导的苜蓿遗传转化,将感染的苜蓿叶柄外植体置于不同的转化培养基中培养,获得了适合于农杆菌介导的转基因苜蓿植株,将其用于转基因体细胞胚的诱导。采用PCR方法筛选阳性株系,并对其进行GUS组织化学染色分析,对转基因植株根、茎、叶和体细胞胚进行荧光定量分析。【结果】以苜蓿叶柄为外植体成功获得11株阳性转基因植物,转化效率为30.6%。GUS荧光定量分析结果表明,体细胞胚中GUS外源蛋白的表达量明显高于根、茎和叶,是其表达量的3～6倍;根、茎和叶中GUS表达量较低,且三者间没有明显差异。【结论】苜蓿体细胞胚能积累相对高的外源蛋白,是外源蛋白表达的最佳材料,为外源蛋白大量工厂化生产奠定了实验基础。     

高等植物花发育的研究进展

以金鱼草和拟南芥菜为例,介绍近年高等植物花发育的研究进展。ＴＦＬ和ＣＥＮ基因具有维持花序分生组织特性的功能;ＤＣＬＶ１基因在营养型分生组织向生殖型分生组织转化中起调节作用;ＬＥＹ、ＡＰ１、ＣＡＬ和ＦＬＯ控制花分生组织形态特征;ＡＰ１／ＳＱＵＡ、ＡＰ２作用于Ａ功能区,控制萼片和花瓣的发育;ＡＰ３／ＤＥＦ、ＰＩ／ＧＬＯ执行Ｂ功能控制花瓣和雄蕊的发育;ＡＧ／ＰＬＥ对应于Ｃ功能区控制雄蕊和心皮的发育;Ａ、Ｂ、Ｃ三个功能区共同作用控制整个花器官的结构     

锦江河3种鳜的遗传变异及其多样性评价

为探究锦江河国家级水产种质资源保护区内鳜类遗传变异特征及其多样性水平,基于PCR扩增与测序技术对大眼鳜、斑鳜和中国少鳞鳜3个群体97尾鱼的线粒体控制区序列进行比较分析。结果显示,大眼鳜序列长度为843 bp,无变异位点,只有1种单倍型,斑鳜有852 bp和856 bp两种序列,28个多态位点和11个单倍型,中国少鳞鳜也有845 bp和846 bp两种长度,5个多态位点和5个单倍型;大眼鳜、斑鳜和中国少鳞鳜3种鳜鱼群体内的遗传距离分别为0. 000 0、0. 008 7±0. 002 0和0. 002 0±0. 000 9,单倍型多样度和核苷酸多态性分别为0. 000 0、0. 859 9、0. 736 7和0. 000 0、0. 008 7、0. 002 0。分析表明,3种鳜鱼在终止序列区和保守序列区存在种或属间差异,锦江斑鳜是一个遗传变异大,多样性丰富的稳定种群;中国少鳞鳜虽然单倍型多样度丰富,但遭受过瓶颈效应,导致其核苷酸多样性偏低;大眼鳜遗传组成单一,多样性十分贫乏,推测可能有入侵的养殖群体。锦江系梵净山国家级自然保护区内最大的河流,历史上鳜类资源丰富,但已遭严重的破坏,加强其鳜类遗传资源的研究与保护十分必要。