龙眼亚硫酸盐氧化酶(DlSO)基因的克隆及表达分析

【目的】探讨龙眼果实亚硫酸盐氧化酶基因(DlSO)在硫残留生物降解中的作用。【方法】以龙眼总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE法获得龙眼亚硫酸盐氧化酶基因全长cDNA序列,命名为DlSO;运用荧光定量PCR对其表达量进行分析;使用ClontechIn-Fusion技术构建原核表达载体,使其在Rosetta(DE3)大肠杆菌中表达。【结果】DlSO序列全长1413bp,包含一个1182bp的开放阅读框,一个长37bp的5’非翻译区序列和194bp的3’非翻译区,预测编码393个氨基酸;同源性和系统进化分析结果均表明DlSO与毛果杨SO亲缘关系最近;荧光定量结果表明,在龙眼不同组织中,DlSO基因都有表达,其中在叶片中表达量最高,其次是花、幼果、根和果肉,在茎和果皮组织中DlSO基因的表达量最低;成功构建pET-32a-DlSO原核表达载体,经IPTG诱导后在Rosetta(DE3)大肠杆菌中成功表达。【结论】克隆了龙眼亚硫酸盐氧化酶基因(DlSO),并且成功构建了pET-32a-DlSO原核表达载体,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达出融合蛋白,为下一步研究龙眼亚硫酸盐氧化酶的作用奠定了基础。     

梨PbChiⅡ基因的克隆及荧光定量表达分析

以鸭梨为试材,采用qRT-PCR技术克隆鸭梨果实几丁质酶基因PbChi Ⅱ,并对几丁质酶氨基酸序列进行聚类分析;同时采用荧光定量PCR的方法对鸭梨植株不同器官及水杨酸(salicylic acid,SA)和梨轮纹病菌(Botryosphaeria berengeriana de.Not.f.sp.piricola(Nose)Koganecawa et.Sokwwa)处理后几丁质酶基因的表达量进行了分析,以期为该基因的进一步研究与利用提供参考依据。结果表明:PbChi Ⅱ基因长度为969bp,核苷酸序列及推导的氨基酸序列与沙梨的同源性均达到100%,该基因属于第Ⅱ类几丁质酶基因;PbChi Ⅱ在根和果实中表达量较大。在鸭梨果实中,SA和病原菌可诱导该基因表达,且表达量在48h达到最高,初步推测PbChi Ⅱ可能参与SA介导的植物抗病防卫反应的信号通路及轮纹病菌引起的防卫反应。     

蝴蝶兰多酚氧化酶基因克隆及序列分析

 利用RT-PCR和RACE技术从蝴蝶兰中克隆的多酚氧化酶同源基因, 命名为PhPPO, 其cDNA 全长1 851 bp, 完整的编码框长1 647 bp, 编码549个氨基酸, 生物信息学分析表明其具有酪氨酸酶家族的特征, 具有保守的CuA 和CuB 结合区, 以及向叶绿体运输的导肽结构。将其亚克隆到表达载体pPRoEXHTa上, 在BL21 (DE3) 进行表达, 经ITPG诱导, 获得蝴蝶兰PPO原核表达蛋白。     

香蕉皮多酚氧化酶特性研究

研究了香蕉皮中多酚氧化酶(PPO)的特性。结果表明,香蕉皮PPO的最适温度为35℃,最适p H值为6.5,75℃以上水浴5min、100℃水浴20s可以完全钝化香蕉皮PPO的活性,香蕉皮PPO存在同工酶。香蕉皮PPO的最适反应底物浓度为0.125mol/L。动力学研究结果表明,香蕉皮PPO的Km=0.087922mol/L,Vmax=0.00924OD404/min。考查了柠檬酸、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、EDTA-2Na对PPO的褐变抑制效果和PPO酶液4℃保存时间与其活性的关系。     

茶树NADPH氧化酶基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

以茶树(Camellia sinensis)‘迎霜’为试验材料,采用同源克隆的方法,利用RACE和RT-PCR技术获得茶树NADPH氧化酶基因Cs RBOHA的c DNA全长(Gen Bank登录号:KJ782632)。该基因全长3 157 bp,开放阅读框2 769 bp,编码922个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白分子量为103.33 k D,理论等电点为9.28;C端序列较保守,N端序列保守性较低,与烟草和蓖麻的相似性达79%,进化关系最近;蛋白结构具有典型的家族特征。该蛋白分布于细胞质膜上,与预测结果一致。实时荧光定量PCR结果显示,该基因的表达存在组织特异性,并且在低温(4℃)、高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、ABA(200 mg·L-1)和干旱(10%PEG 6000)条件下出现不同程度的上调。     

紫甘薯多酚氧化酶性质探讨

甘薯是世界上一种重要的粮食和能源作物,由于加工过程中其组织中的多酚氧化酶易催化多酚类物质氧化成黑色素,严重影响了其加工品质.以济薯18为材料,研究了pH值、温度、底物浓度等对其多酚氧化酶(PPO)活性的影响.结果表明:紫甘薯济薯18中PPO活性在360 am处最大,其最适反应时间为11 min,最适pH值6.5,最适温...     

金针菇多酚氧化酶动力学特性的研究

以金针菇为原料,研究了温度、pH以及底物浓度对多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性的影响。建立了金针菇酶促褐变反应的动力学方程,结果表明:金针菇PPO最适温度为50℃,最适pH5.0。采用Michaelis—Menten机理描述得金针菇PPO相应的动力学参数KM=0.075mol/L,Vmax=5.744U/min。同时,考察金针菇不同部位PPO活性,结果表明:菌柄上PPO活性>菌盖>菌柄中>菌柄下。     

鸭梨、黄金梨果实结构与耐贮性的关系

以耐贮性强的鸭梨和不耐贮的黄金梨为试材,分别研究了果实组织结构的差异,结果表明:鸭梨果实表面角质层厚,且深入表皮细胞间隙,表皮细胞较厚,排列紧密,表皮下有4～5层含有大量被染成紫红色的单宁类物质;黄金梨角质层薄,表皮细胞少,不连续,甚至没有表皮细胞,表皮下细胞含单宁物质较少,有的几乎没有。此外,鸭梨近果皮果肉中石细胞多、石细胞团大;黄金梨近果皮果肉中石细胞少、石细胞团小。     

翠冠梨PG基因家族两成员的克隆及其表达与货架期果实软化的关系

以早熟砂梨翠冠果实为材料,克隆了多聚半乳糖醛酸酶（PG）基因家族中的两成员功PGj和PpPG2。PpPGI cDNA序列全长1793bp,开放阅读框为287-1666bp,DNA序列长2757bp,包括8个外显子和7个内含子,编码一个含有459个氨基酸残基的蛋白,预测的等电点（pI）为8．47,估计的相对分子质量为49...     

基于EST数据库的葡萄APETALA2基因cDNA克隆及其表达分析

APETALA2(AP2)是拟南芥生长发育特别是花器官发育过程中重要的调控基因。利用生物信息学方法以拟南芥APETALA2基因cDNA序列作为模板,对葡萄EST数据库进行同源检索筛选,电子克隆出葡萄AP2基因(Vv-AP2)cDNA序列。以香悦葡萄花cDNA为模板,根据电子克隆的葡萄AP2基因cDNA序列设计特异引物,分别利用RACE技术和特异PCR技术获得该基因3’末端和5’末端,序列拼接后获得葡萄的APETALA2基因的cDNA全长。该cDNA的全长为2 208 bp,命名为Vv-AP2。Vv-AP2核苷酸序列有一个1 536 bp完整的开放读码框(ORF),其5’与3’末端非翻译区分别为268 bp和376 bp。其中,3’末端含有28 bp的Ploy+(A)。该基因在GenBank基因数据库的注册号为FJ809943。氨基酸推导结果表明该cDNA共编码了511个氨基酸,具备完全保守的核定位信号序列(KKSR)以及2个高度保守的重复序列即AP2结构域。分别采用半定量RT-PCR和SYBR Green I实时定量RT-PCR初步分析了Vv-AP2在葡萄叶、茎、花序、花等不同器官中的表达水平。其中,Vv-AP2在花序和花中的表达量明显高于叶和茎。     

套袋对鸭梨果实内挥发性物质的影响（初报）

利用ＧＣ／ＭＳ／ＤＣ联用仪测定了未套袋鸭梨和套袋鸭梨果实内的挥发性物质成份,结果表明,未套袋鸭梨含有２３种挥发性物质,其中以丁酸乙酯和己酸戊酯为主。鸭梨套袋后,酯类种类减少,含量降低,但烷类和醇类含量增加。     

杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白PbCBL10基因的克隆和表达特性研究

【目的】为了探明杜梨类钙调磷酸酶B亚基蛋白(Calcineurin B-like protein,CBL)基因的序列特征和表达特点,【方法】以杜梨幼苗为试材,运用同源克隆和半定量RT-PCR对PbCBL10基因进行克隆和表达分析。【结果】结果表明,PbCBL10基因编码区cDNA长度为801 bp,编码的多肽由266个氨基酸组成。该多肽预测的等电点为4.56,估计的相对分子质量为30.45 ku。其对应基因组DNA序列长1 983 bp,包括9个外显子和8个内含子。通过PSORT进行亚细胞定位分析发现PbCBL10蛋白位于质膜上的几率最大。PbCBL10基因编码的多肽具有4个钙离子结合域EF手形结构和1个钙调磷酸酶A亚基结合位点。PbCBL10与番茄SlCBL10(NP_001239045)和拟南芥AtCBL10(NP_195026)蛋白间的同源性较高,分别为82%和77%,并与AtCBL10亲缘关系最近。PbCBL10基因在杜梨幼苗根、茎和叶片中均为诱导型表达,50~200 mmol.L-1CaCl2、20μmol.L-1ABA、100 mmol.L-1NaCl、10%(w/v)PEG6000或180 mmol.L-1甘露醇处理后其表达量明显上调。【结论】PbCBL10基因具备植物CBL基因家族的固有特征,能够响应胞内钙浓度变化,对ABA、盐碱、干旱和渗透胁迫均存在转录响应。     

鸭梨同源异型突变株的花器官分析

以20a树龄同一梨园中1株能稳定遗传的花器官变异鸭梨和普通鸭梨为试材,采用形态观测法进行了花芽发育、花粉萌发率、表观形态等方面的研究分析。结果表明:该突变株的花发育与普通植株花的正常发育最明显的差别在于花器官花瓣完全或部分缺失、雄蕊相应增多;花瓣对应位置的雄蕊花丝粗、花药大;花粉萌发率高;部分特化的花瓣上着生有花药。根据试验结果,推断该突变株可能是梨的花同源异型突变株,控制花器官发育的B功能区发生了突变引起花器官异常。该突变株为进一步认识植物花发育的内在调控机制、研究花的发育机理提供了可能。     

套袋对鸭梨果实内含物变化及内源激素水平的影响

试验测定了套袋和未套袋鸭梨果实生长发育过程中淀粉、可溶性糖和可滴定酸的含量变化及IAA、GA3在果实发育不同阶段的含量。结果表明,套袋果实和未套袋果实淀粉、糖、酸的变化趋势基本一致,但在果实整个发育时期,套袋果实糖和酸的含量均低于未套袋果实,采收前糖的快速增长时期,套袋果晚于未套袋果。盛花后130d这段期间,套袋果淀粉含量低于未套袋果,采收时稍高于未套袋果。套袋果肉中IAA、GA3的含量,在果实发育的各阶段均低于未套袋果。     

新疆红肉苹果PGIP基因的克隆及原核表达

【目的】研究克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]PGIP基因并进行原核表达,探讨其抗病机制。【方法】根据Genbank中已经发表的‘金冠’苹果PGIP保守区域设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段连接到原核表达载体pET30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】序列分析表明,新疆红肉苹果PGIP基因cDNA编码区全长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为MsPgip,GenBank登录号为JQ001783。MsPgip分子质量为36.6 kD,等电点为7.05,有6个潜在的N-糖基化位点,信号肽为N端24个氨基酸残基。该蛋白质还具有2个连续的24个氨基酸残基大小的LRR基序(LSQLKNLTFLDLSFNNLTGAIPSSLSQ LPNLNALHLDRN-KLTGHIPIS)。与已克隆的‘澳洲青苹’、‘金冠’、‘富士’苹果PGIP氨基酸序列同源性均高达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子质量与预期一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

鸭梨芽变优系主要器官性状研究

采用田间观察和室内分析相结合的方法,对2个鸭梨芽变优系(巨鸭梨、光鸭梨)的生物学及遗传学性状进行研究,为培育鸭梨新品种奠定基础。结果表明:巨鸭梨:果实巨大,花朵较大,花瓣数目多,花粉粒较长;叶片和栅栏组织均较厚,叶片叶绿素含量和净光合速率都较高,属于鸭梨特大果新品系。光鸭梨:果面洁净(果点稀而大,果面锈斑面积小),果肉质地细腻而酥脆,酸味较浓;枝条皮孔和叶片气孔密度均较小;果实成熟期比普通鸭梨晚约7 d。属于外观品质和内在品质俱佳的鸭梨优质新品系。与普通鸭梨相比,巨鸭梨雄蕊多出1条Rf 0.206酶带,而少了1条Rf 0.556酶带;光鸭梨未展叶雏梢多出了2条酶带(Rf 0.079和Rf 0.127),Ф1 cm的幼果多出1条活性较强的Rf 0.560酶带,Ф2 cm的幼果少了1条Rf 0.860酶带。巨鸭梨和光鸭梨既有与普通鸭梨共同的遗传基础,又有一定的遗传差异,是鸭梨新的变异类型。