表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。在体外稳定试验中，重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后，单个菌落和菌液均呈绿色；在体内稳定试验中，经ICR小鼠连续传代10次，从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色，证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。SDS-PAGE结果显示，鼠伤寒沙门氏菌表达的GFP分子量约为27kD，这与预计的分子量大小一致。用免疫剂量的重组细菌接种BALB/C小鼠后，观察1个月未见有异常现象，同时剖栓后也未见脏吕有眼观病变。表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗的研制提供一个优良模型，为研究沙门氏菌疫苗和沙门氏菌疾病的致病机理的提供了一个有力的工具，同时在相关疾病的免疫防制基础研究中亦有重要应用价值。     

细菌重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗研究进展

鼠伤寒沙门氏菌 ( St)是一种肠道致病菌 ,通过基因突变可构建许多鼠伤寒沙门氏菌减毒株 ,例如 :X40 72、X42 17、X45 5 0、X4989、X4990、 X40 64、 SL 3 2 61、 GID10 1、 GID10 5、GID10 6和 BRD5 0 9等 ,它们均是两个或多个基因的精确突变 ,其基因型和表型均很稳定 ,可用作构建细菌性疫苗的表达载体。国内外学者相继研制了肺炎链球菌、结核杆菌、百日咳杆菌、产单核细胞李斯特菌、鼠疫耶尔森菌、土拉弗郎西斯菌、铜绿假单胞菌、淋病奈瑟菌、牛布氏杆菌、破伤风梭菌、炭疽芽孢杆菌、沙眼衣原体和猪肺炎支原体等细菌的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗。文章着重讨论了这些疫苗的构建及其免疫机制等方面的研究进展 ,从而为新型菌苗的研制提供一种新的思路     

表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌感染动力学

用表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550(pYAGFP)给BALB／c小鼠尾静脉注射和口服，时小鼠脏器进行细菌计数，并用间接ELISA法测定血清中抗细菌的抗体。结果表明，静脉注射重组菌的小鼠在肝脏、脾脏中重组菌数量有2个峰值，总的趋势是越来越少，而血清中抗体效价越来越高，可以初步推断，肝脏、脾脏中的细菌数量与血清中的抗体水平呈一定的相关性；口服重组菌的小鼠，在各脏器中重组菌的数量呈现正态分布的变化趋势，其中派伊尔结(Peyer’s patches，PPs)中细菌数量与血清中的抗体水平呈一定的相关性，而脾脏、肝脏及肠系膜淋巴结中细菌数量与血清中的抗体滴度无关。     

以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的重组NDV-HN口服疫苗的构建与鉴定

试验旨在构建表达鸡新城疫病毒(NDV)HN基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)。以pMD18-T-HN为模板,通过PCR扩增出NDV HN基因片段,定向插入原核表达载体pYA3493中,将重组表达质粒pYA3493-HN转入χ6097,再转入减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd,通过双酶切和PCR对质粒进行鉴定。结果表明,携带NDV HN基因片段的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌SL1344ΔcrpΔasd(pYA3493-HN)构建成功。本研究结果为开发鸡新城疫的口服基因工程活载体疫苗奠定了基础。     

PCR扩增invA基因特异性检测沙门氏菌

建立了扩增invA基因检测沙门氏菌的PCR方法。对收集的50个血清型123株沙门氏菌及7种27株非沙门氏菌进行PCR,2％琼脂糖电泳检查,结果所有沙门氏菌都扩增出了300bp的特异性产物,非沙门氏菌都未扩增出此目的条带。产物的特异性由slot blot杂交进一步证实。通过电泳判定结果,该法可检出扩增体系中10pg染色体DNA及10~2cfu的纽波特沙门氏菌50029。为下步克隆而设计的两个酶切点（Bam HI,Eco RI）对引物的特异性没有影响。本研究为沙门氏菌的检测提供了简洁、敏感、特异的新方法,同时为克隆invA基因做属特异性探针打下了基础。     

鸡体内减毒鼠伤寒沙门氏菌的繁殖和免疫反应

初步研究了cya和crp双基因突变减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)在鸡体内的繁殖和免疫反应。1、4或7日龄肉鸡分别经口感染10^8或10^9CFU减毒S．typhimurium X4550，接种后3—4周鸡体内特异性细胞和体液免疫达到最高峰。4日龄口服10^9CFu组免疫效果最佳，但1日龄高剂量组表现增重降低及免疫抑制。28日龄每鸡口服攻击10^10CFU强毒S．typhimurium 50333，各免疫组保护率为100％。同时免疫鸡还能全部或部分阻止沙门氏菌在肝脏和脾脏的繁殖。接种后病毒S．typhimurium在泄殖腔的检出时间为4周左右。     

小灵猫鼠伤寒沙门氏菌的分离与鉴定

2只从市场收购的野生小灵猫急性发病死亡，病变为肝肿大、坏死、心内外膜出血、肠炎、肠外膜有出血斑点。经实验室检查，分离到1株致病力强的鼠伤寒沙门氏菌，抗原模式为1，4，5，12：1；1，2药敏试验结果表明对多种药物具有较强耐药性。     

鸵鸟鼠伤寒沙门氏菌的分离与鉴定

某鸵鸟场共饲养２５０余只非洲鸵鸟,自１９９８年１１月开始零星死亡,病鸟临床表现排便不畅,粪便呈卵石状;以胃,肠消化道粘膜充出血为主要病变特征。从送检的两只病死鸟鸟分离到两株细菌,经生化试验,血清学试验证实两株细菌均为鼠伤寒沙门氏菌,其抗原为４,５,１,２：ｉ：１,２。     

鼠伤寒沙门氏菌粘附素样糖蛋白的分离与鉴定

鼠伤寒沙门氏菌用去污剂NP-40处理，获得细菌外膜增溶液，经ConA-Sepharose4B亲和层析，甘露糖洗脱，得到了ConA结合糖蛋白，SDS-PAGE电泳显示出了5条蛋白带，分子量在15～43kD之间。用不同处理并借助扫描电镜观察细菌在雏鸡肠上皮的粘附情况，表明分离的ConA结合糖蛋白具有粘附素样作用，肠粘膜表面含乙酰氨基葡萄糖的糖复合物则可能是粘附素的受体。     

鸭沙门氏菌的分离与鉴定

禽沙门氏菌病是由沙门氏菌属中的一种或多种引起禽类急性或慢性疾病的总称.沙门氏菌的血清型复杂,到目前为止,大约有2 400多个血清型,而感染禽类的主要有鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、鸭沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌等几个血清型（文明等,2000）     

减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗载体研究进展

活载体疫苗技术的发展促使产生了更多的疫苗设计新思路.沙门菌是一种肠道细菌,目前已通过基因突变的方法构建了许多种减毒株,如GID101、GID105、X4064、ZJⅢ、Ty800、X4632、X4550、X4072和X3730等,这些减毒株被突变掉了两个或两个以上的基因,然而其基因型和血清型仍很稳定,所以人们常将其用作基因疫苗的表达载体或运送载体.现在已有许多种细菌、病毒和寄生虫的减毒沙门菌活载体疫苗被研制成功.文章对沙门菌的减毒方法,减毒沙门菌的免疫机理以及其用途和作为疫苗载体的优缺点做了简述.     

表达猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒的构建及免疫原性分析

试验旨在构建表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒并分析评价其免疫效果。将重组克隆质粒pMD-19T-ENO与腺病毒穿梭载体AdV4-GFP分别进行双酶切,构建重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO;将经PacⅠ酶线性化后的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO转染293细胞,获得重组腺病毒Ad4-M/ENO,采用PCR和间接免疫荧光试验（IFTA）鉴定猪附红细胞体ENO基因在293细胞中的表达,再对293细胞进行培养,测定重组腺病毒的滴度;将30只BALB/c小鼠分为3组：重组腺病毒Ad4-M/ENO组、AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组,分别进行免疫接种,采用ELISA方法检测血清中猪附红细胞体IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平,在三免2周后检测小鼠脾脏中CD4⁺和CD8⁺含量。结果显示,构建的重组腺病毒穿梭质粒AdV4-M/ENO目的基因片段大小为1 182 bp;重组腺病毒Ad4-M/ENO包装成功,能在293细胞中表达,滴度为1×10⁹ PFU/mL。经重组腺病毒Ad4-M/ENO免疫后的BALB/c小鼠血清中IgG、IgG₁、IgG_2a抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平及淋巴细胞亚群CD4⁺、CD8⁺含量均显著或极显著高于AdV4-GFP空载体对照组和PBS对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,本试验成功构建了表达猪附红细胞体ENO基因的重组腺病毒,且该重组腺病毒能诱导小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答反应。     

EnMIC2重组减毒沙门氏菌的构建及免疫保护效果研究

成功构建了表达鸡毒害艾美耳球虫(Eimeria necatrix)广东株(GD)微线蛋白-2基因(EnMIC2)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌，在IPTG诱导下获得了EnMIC2的高效表达，SDS-PAGE分析表明，表达产物约占菌体总蛋白的8．6％，分子量大小约为35ku，与抗E．necatrix的高免血清进行Western Blotting，结果为阳性。将重组减毒沙门氏菌以10^8和10^9 CFU／鸡免疫4日龄岭南黄肉鸡，免疫后2周血清中可检测到特异性IgG，3周时抗体水平达到峰值，同时可在肠道检测到特异性IgA的分泌。免疫接种后3周，试验鸡分别经口攻击感染500个E．necatrix(GD)孢子化卵囊，结果显示免疫组与非免疫组有相似的排卵囊曲线；但10^8和10^9CFU免疫组的卵囊总产量分别能降低26．62％和48．92％。     

猪链球菌2型溶菌酶释放因子MRP在重组沙门菌中的表达

从猪链球菌2型(SS2)四川分离株分离溶菌酶释放因子基因mrp,将其克隆至T载体上,再将asd基因插入到重组质粒的抗生素抗性基因中,电击转入asd缺陷型沙门菌X4072中表达,形成依赖asd基因的质粒-宿主平衡致死系统。经酶切、PCR及蛋白电泳鉴定,证实重组菌株能够稳定表达MRP,从而为SS2的防制提供了可能候选疫苗株。     

猪致病性链球菌的分离鉴定

采集33例临床症状疑似猪链球菌感染猪的全血及内脏器官进行涂(触)片染色镜检,取有球菌感染的样品16份进行血琼脂平板分离纯化试验;根据血琼脂平板上菌落形态、溶血情况及对单个菌落涂片染色镜检结果,共筛选出12份可疑样品,进一步采用液体培养基对12份样品进行增菌及纯化培养;选取纯化培养菌进行链球菌生化试验,结果共鉴定出11株纯化的猪链球菌;11株猪链球菌均对小鼠表现出高致病力.     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。     

9型猪链球菌广东株的分离鉴定和基因序列分析

为了解9型猪链球菌广东分离株毒力因子基因型、基因变异和进化情况,本试验采集发病猪脑脊液、关节液、脾脏、肝脏、淋巴结进行细菌分离培养和生化鉴定,采用PCR方法鉴定其血清型及部分毒力基因,对cps9D、gdh、gapdh与orf2基因进行序列测定和分析,并构建系统发育树。结果显示,分离菌镜检为革兰氏阳性链状球菌,在鲜血琼脂平板中呈β溶血,可发酵大多数糖类,能成功扩增cps9D基因,含重要的保守基因gdh及毒力基因gapdh和orf2,表明分离菌株为9型猪链球菌。分离菌株cps9D、gdh、gapdh、orf2基因核苷酸序列与GenBank上国内外参考菌株的同源性分别为95.9%~100.0%、98.6%~99.8%、98.7%~99.6%和95.5%~99.9%,说明分离菌株与国内外其他9型猪链球菌毒株核苷酸同源性都较高,且与国内外的流行毒株基本一致,未发生太大的变异。系统发育树表明,分离株与国内外来源不同的猪链球菌分离株同源性高,亲缘关系密切。