花生长链酰基辅酶A合成酶6基因(LACS6)的克隆、鉴定与组织表达

长链酰基辅酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase:LACS)是油脂代谢的重要催化酶。为揭示花生脂肪酸代谢机理,采用RT-PCR技术,首次从花生Arachis hypogaea L.克隆到LACS6(GenBank登录号:KU301860),分析该基因的结构组成,预测编码氨基酸与其他植物的同源性,采用Real-Time PCR技术对LACS6的组织表达进行研究。结果显示,花生LACS6基因全长2 116bp,包含2 088bp的ORF,编码695个氨基酸,有23个外显子和22个内含子。氨基酸序列比对显示花生LACS6有真核生物酰基辅酶A合成酶保守结构域,并含有保守的激活位点和绑定位点。同源性分析发现花生LACS6与鹰嘴豆、绿豆、大豆、梅等13种物种的氨基酸一致性在79%~87%,进化树分析显示,花生LACS6与鹰嘴豆等豆科植物亲缘较近。实时荧光PCR分析表明,花生LACS6在花生根、茎、叶、子房柄、仁和花等组织均有表达,且差异明显。子房柄和花的表达量极高,与根、茎、叶和仁等组织有极显著差异,花生LACS6组织的表达量大小排序为花子房柄叶仁茎根。本研究结果为揭示花生脂肪酸代谢和品质改良提供理论依据。     

油茶种仁成熟过程油脂合成代谢的转录组分析

以普通油茶品种"闽43"种仁为试验材料,应用转录组测序技术分析油茶种仁成熟阶段中3个发育时期转录组的表达差异,探讨油茶种子油脂代谢的分子机制。转录组测序结果发现,与脂肪酸和甘油三酯代谢相关的4个基因乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶α亚基基因(ACCase α-CT)、β酮脂酰合酶基因(KASⅢ)、长链酰基辅酶A合酶基因2(LACS2)和甘油三磷酸酰基转移酶基因4(GPAT4)随着油茶籽的成熟,表达水平呈上升趋势。4个基因的RT-q PCR的分析结果与转录组数据一致,此外,种仁的含油量的变化趋势与4个基因的表达水平相一致。研究结果表明,4个基因在油茶籽油脂代谢过程中发挥重要作用,有助于油茶籽含油量的增加。     

玉米长链酰基辅酶A合成酶1基因鉴定及其蛋白磷酸化位点检测

【目的】对玉米中长链酰基辅酶A合成酶1(ZmLACS1)基因及其蛋白磷酸化位点进行鉴定,为研究玉米脂肪酸的降解及其利用机制奠定基础。【方法】通过结构域分析查找质谱鉴定到蛋白中的长链酰基辅酶A合成酶1,通过系统发育树分析判断玉米中长链酰基辅酶A合成酶1与拟南芥超家族中长链酰基辅酶A合成酶的同源性,通过质谱分析鉴定该蛋白的磷酸化修饰位点。通过3D建模模拟长链酰基辅酶A合成酶1的结构以及磷酸化位点所在位置。【结果】玉米长链酰基辅酶A合成酶1(ZmLACS1)与拟南芥中的长链酰基辅酶A合成酶1(AtLACS1)具有高度同源性;通过质谱分析鉴定到3个该蛋白的磷酸化位点分别为S360、Y365和S366,同时鉴定到的磷酸化位点位于长链酰基辅酶A合成酶的保守结构域(AMP-binding domain)中,3个磷酸化位点位置一致,位于两个α螺旋中间,处于蛋白结构的关键位置。【结论】磷酸化修饰可能是调节长链酰基辅酶A合成酶1功能的关键性方式之一,ZmLACS1可能与AtLACS1在功能上具有相似性。     

棉铃虫酰基辅酶A△9去饱和酶基因的分子鉴定

采用RT-PCR及RACE法,克隆得到了棉铃虫酰基辅酶AA9去饱和酶cDNA全序列.根据序列分析发现该基因全长为2931 bp,编码区长度为1062 bp,编码353个氨基酸残基,相对分子质量为40.66 kD.发育表达模式结果表明,酰基辅酶A△9去饱和酶基因在5龄初期转录水平较高;饥饿和保幼激素对其转录有明显的抑制作...     

大白菜LACS家族基因鉴定与表达分析

长链脂酰辅酶A合成酶(LACS)能催化游离的脂肪酸形成酰基辅酶A,是脂肪酸激活、转运、氧化及储存脂合成等生化途径的关键酶，在许多生物过程中发挥重要作用。本研究利用生物信息学方法鉴定大白菜LACS家族基因成员，分析其亲缘关系、蛋白质理化性质、染色体定位、共线性关系、基因结构、蛋白保守结构域和基因表达模式。结果表明，从大白菜全基因组共鉴定到13个BrLACS基因成员，分成4组，不均匀地分布在7条染色体和1个Scaffold上。BrLACSs的蛋白长度和分子量分别为199～1 072 aa和23.10～121.10 kDa。与拟南芥AtLACS1、AtLACS5和AtLACS6共线性的BrLACS基因发生了扩张，出现了双拷贝(BrLACS5a、BrLACS5b和BrLACS6a、BrLACS6b)及三拷贝(BrLACS1a、BrLACS1b和BrLACS1c)。表达模式分析表明，BrLACS4和BrLACS8基因在大白菜不同器官/组织中表达量最高，尤其在控制花器官蜡质性状中起着重要作用，在有蜡粉大白菜中的表达量显著高于无蜡粉大白菜。本研究结果为解析大白菜LACS基因在控制大白菜蜡质性状中的分...     

续随子ElPDAT1基因生物信息学及表达特性分析

磷脂:二酰甘油酰基转移酶1(PDAT1)是不依赖于脂酰-CoA催化二酰甘油(DAG)合成三酰甘油(TAG)的关键酶,在种子油脂代谢过程中起关键作用。为了研究ElPDAT1基因在续随子种子油脂合成过程中的调控作用,对ElPDAT1进行了生物信息学分析,并采用qRT-PCR技术研究了该基因在续随子不同器官中的表达特性。结果表明,ElPDAT1基因c DNA全长2 968 bp,其中,开放阅读框为2 037 bp,共编码678个氨基酸,预测等电点和相对分子质量分别是5.94,75.38 ku。ElPDAT1蛋白二级结构的主要结构元件是α-螺旋(34.81%)和无规则卷曲(43.95%)。ElPDAT1基因系统进化树分析表明,续随子与同科植物蓖麻、木薯、麻疯树的亲缘关系较近。qRT-PCR研究发现,ElPDAT1基因在各个器官中均有表达,且在种子中的表达量明显高于其他器官;ElPDAT1基因在种子发育中期表达量达到最大,其表达量为叶的5.82倍,说明ElPDAT1基因可能在续随子种子油脂合成过程中起调控作用。研究结果可为揭示该基因的生物学功能及全面解析续随子油脂合成机制提供科学依据。     

毛果杨中链酰基辅酶A合成酶的克隆及酶学分析

中链酰基辅酶A合成酶(MACS)属于腺苷酸合成酶超基因家族,催化中链脂肪酸与辅酶A结合形成相应的中链酰基辅酶A。本研究通过同源检索毛果杨基因组数据库中的4CL基因,克隆得到毛果杨PtMACS1的基因序列(基因编号:estExt_fgenesh4_pg.c_640066)。通过序列分析可知,Box I和Box II两个在4CL中保守的结构域在该蛋白中并不保守。将PtMACS1与原核表达载体 pET-30a(+) 构建融合表达载体PtMACS1- pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白进行表达。镍柱纯化重组蛋白后进行酶学活性分析,研究结果表明该蛋白对中链脂肪酸己酸、壬酸、癸酸显示出明显活性:Kcat分别为(1302.65)、(1933.46)、(2015.51) mol/(minmg),以该蛋白的最适底物癸酸测得该蛋白的最适反应温度为37 ℃,最适反应pH为7.0。该结果表明,PtMACS1属于毛果杨中链酰基辅酶A合成酶家族一员,为后续毛果杨腺苷酸合成酶超基因家族的鉴定及分类分析提供资料。      

甘蓝型和白菜型油菜肉桂酰辅酶A还原酶1基因的克隆与表达

【目的】分别克隆甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和白菜型油菜(Brassica rapa L.)肉桂酰辅酶A还原酶1(cinnamoyl-CoA reductase 1,CCR1)基因,并进行生物信息学和表达模式分析。【方法】基于甘蓝型油菜和白菜型油菜转录组测序信息,分别从contig文库中获得了一个CCR1基因mRNA转录本片段,利用RACE技术分别获得一个CCR1基因的cDNA全长,对其进行生物学分析,并用实时定量PCR方法分析CCR1基因在甘蓝型和白菜型油菜开花期根、茎、叶、花中的表达差异。【结果】所克隆的甘蓝型油菜和白菜型油菜CCR1基因序列经同源序列比对分析后,将其分别命名为BnCCR1(登录号:KX138521)和BrCCR1(登录号:KX138522)。BnCCR1全长1 388bp,开放阅读框(ORF)长为1 032bp,编码343个氨基酸,分子质量11.56ku,等电点4.99;BrCCR1全长1 366bp,ORF长为1 026bp,编码341个氨基酸,分子质量为11.36ku,等电点5.0。2物种CCR1编码蛋白质二级结构无信号肽和跨膜结构域;亚细胞定位显示该蛋白在细胞质中存在的可能性最大。CCR蛋白多重比对分析显示,BnCCR1和BrCCR1均具有CCR蛋白典型的一个NAD(P)结合域和一个底物结合域(NWYCY)。系统进化树分析结果表明,BnCCR1和BrCCR1与同属十字花科的菘蓝、亚麻荠、拟南芥CCR形成了一个独立分支,且亲缘关系较近;其蛋白质三级结构均与矮牵牛CCR1(PDB:4r1t.1A)蛋白质三级结构相似,结构稳定。实时荧光定量PCR分析结果表明,CCR1基因在白菜型油菜和甘蓝型油菜根、茎、叶、花各器官中均有表达,其中在木质化程度较高的根和茎中表达丰度明显高于叶和花。【结论】从白菜型油菜和甘蓝型油菜中分别克隆到CCR1基因cDNA全长,该基因主要在木质化程度较高的根和茎器官中表达。     

紫苏PfPDAT基因单核苷酸多态性分析

[目的]磷脂:二酰甘油脂酰转移酶(PDAT)是植物油脂合成最后一步酰基化反应的关键酶之一,研究紫苏PfPDAT基因单核苷酸多态性,旨在分析该基因多态性与紫苏种子油脂含量之间的关系。[方法]以脂肪酸含量不同的7个紫苏品种为试材,通过直接测序法分析PfPDAT基因cDNA全长序列的单核苷酸多态性及其与油脂含量的关系。[结果]在所测总长度为14 679bp的核苷酸序列中,共检测到9个SNP和2个InDel,单核苷酸多态性频率分别为1/1 631bp和1/7 340bp,其中编码区含2个SNP,非编码区为7个。编码区和非编码区发生SNP的频率分别为1/5 439bp和1/543bp。根据PfPDAT基因序列多态性将供试紫苏材料分为不同的单倍型,单倍型H1和H2中都包含有油脂含量较高和含量较低的材料。[结论]PfPDAT基因的单倍型分类与紫苏油脂含量之间没有显著相关性,同时也反映了植物种子油脂合成的复杂性。     

酰基辅酶A硫酯酶11基因(ACOT11)及其家族的研究进展

酰基辅酶A硫酯酶(ACOTs)是一类催化脂肪酰基辅酶A水解形成游离脂肪酸(FFA)和辅酶A(CoA)的酶.这类酶通过维持细胞内的FFA、脂肪酰基辅酶A以及CoA的适当水平在脂质代谢中发挥了非常重要的作用.ACOT11作为ACOTs家族成员之一,对温度和摄食量的变化较为敏感,所以该基因对生物体的能量保存、炎症的调节和内质...     

Long Chain Acyl-Coenzyme A Synthetase 4 (BnLACS4) Gene from Brassica napus Enhances the Yeast Lipid Contents

Long-chain acyl-Coenzyme A (CoA) synthetases (LACSs) catalyze the formation of long-chain acyl-CoA, and play important roles in fatty acid metabolism including phospholipids, triacylglycerol (TAG) biosynthesis and fatty acid β-oxidation. Here, we report the characterization of a LACS gene from Brassica napus. It is highly homologous to Arabidopsis LACS4 and thus designated as BnLACS4. The cloned gene BnLACS4 could complement a LACS-deficient yeast strain YB525. It is mainly expressed in flowers and developing seeds where lipid biosynthesis is at high rate in Brassica napus. When transiently expressed in tobacco leaves, BnLACS4 is localized in endoplasmic reticulum (ER), the common site for eukaryotic pathway of lipid biosynthesis. Expression of BnLACS4 in the yeast strain pep4 increased its lipid content. Taken together, our results suggest that BnLACS4 may be involved in lipid biosynthesis in B. napus.     

二色补血草硫氧还蛋白过氧化物酶基因LbTPx的克隆及其表达

从二色补血草(Limonium bicolor)cDNA文库中分离出一个新的硫氧还蛋白过氧化物酶基因(LbTPx)全长cDNA序列.基因全长1016 bp,其中:5'非翻译区146 bp,3'非翻译区69 bp,开放读码框(ORF)801 bp,共编 码266个氨基酸;编码蛋白的分子质量为47.99× 10-24...     

扶桑绵粉蚧钙调蛋白基因的克隆与生物信息学分析

钙调蛋白(calmodulin,CaM)对生物体内多种Ca2+依赖的细胞功能和酶体系都有重要的调节作用。为研究扶桑绵粉蚧的信号转导受体蛋白,首次克隆了扶桑绵粉蚧钙调蛋白基因PsCaM的cDNA全长序列,其开放阅读框(ORF)包含447bp的片段,编码148个氨基酸。PsCaM基因由3个内含子和4个外显子组成。3个内含子的长度分别为73、81、72bp,分隔的4个外显子的长度分别为33、133、183、98bp。功能域分析结果显示:该蛋白具有2个EF-hand结构域,有13个Ca2+结合位点;该蛋白的理论等电点是6.21,属于稳定蛋白,且没有跨膜区域;通过同源建模获得了其蛋白的三维结构。多序列比较显示,PsCaM基因相对较保守。     

猪A组轮状病毒Vp4全基因的克隆与序列分析

应用RT-PCR技术，从猪A组轮状病毒总RNA中扩增了2331bp的Vp4全基因，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至克隆载体pCEM-T中，转化至受体菌株JM109中，通过质粒提取、限制性内切酶酶切、PCR、序列测定等方法鉴定，构建出重组阳性克隆质粒pCEM-T-Vp4。经DNASTAR软件分析核苷酸和氨基酸序列，结果显示该实验株与黑龙江株和美国株的同源性最高，均达到99％以上，并具有轮状病毒Vp4全基因的抗原表位区。     

马铃薯乙烯响应因子基因的克隆表达及生物信息学分析

根据番茄ERF5基因(NM_001247583.1)序列设计引物,采用RT-PCR方法得到马铃薯ERF基因的cDNA,并对其进行生物信息学及表达分析.结果表明:该cDNA全长789bp,阅读框为732bp,编码243个氨基酸.序列同源性分析表明该基因序列与番茄ERF5基因的序列同源性达82%,氨基酸序列同源性达70%.对该马铃薯ERF基因的氨基酸序列经BLAST进行多序列比对,发现该氨基酸序列的98～160bp为AP2结构域,属于AP2/EREBP转录因子的EREBP亚族ERF类.蛋白质三级结构预测表明该基因的AP2结构域非常保守.对ERF基因进行荧光定量PCR分析,表明该基因可能参与了马铃薯块茎解除休眠与发芽过程的调控.     

仿刺参过氧化氢酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

研究仿刺参（Apostichopus japonicus）免疫相关基因的功能和作用机制可为仿刺参养殖病害的防控提供科学依据。克隆了仿刺参过氧化氢酶（catalase）基因的全长cDNA序列,全长1 885 bp,其中5′\|非翻译区（5′\|untranslated region,UTR）长76 bp,3′\|UTR长306 bp,开放阅读框（open reading frame,ORF）1 503 bp,编码500个氨基酸,预测蛋白分子量为56.56 kDa。氨基酸序列比对结果显示,仿刺参Catalase与三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）和紫海胆（Strongylocentrotus purpuratus）的相似度最高,为75%。仿刺参catalase cDNA推导的氨基酸序列具有过氧化物酶定位信号PTS2、与还原型辅酶Ⅱ(NADPH) 结合的氨基酸残基及与其它物种高度保守的Catalase近端血红素配体签名序列（351RLFSYSDTH359）。系统进化分析显示仿刺参处于无脊椎动物分支中,和紫海胆位于同一小支上。实时定量PCR结果显示,catalase mRNA在仿刺参肠、体壁、肌肉、呼吸树、体腔细胞和管足中均有表达,在肠中表达量最高。在细菌脂多糖LPS刺激后4 h,体腔细胞中catalase mRNA表达量显著升高,表明仿刺参的catalase基因在应对外来病原菌刺激的免疫应答中发挥了重要作用。     

三角帆蚌中WNT4基因克隆及表达分析

为进一步了解WNT4在三角帆蚌性别决定过程中的作用,通过RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆获得了三角帆蚌WNT4基因的全长cDNA,共1560 bp,其中5’-UTR 396 bp、3’-UTR 24 bp,开放阅读框（ORF）为1140 bp,可以编码379个氨基酸,且该序列含有Wnt家族特有结构域。对WNT4的氨基酸序列进行同源性分析后,发现该基因在物种间的进化关系和结构功能具保守性。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现WNT4基因在三角帆蚌雌雄多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、性腺、斧足和肝)均有表达,表明其参与了多样的生物学过程,在腮、斧足、肝中表达量较高,在性腺、闭壳肌、斧足中雌雄间有显著性差异,且雌性三角帆蚌的性腺、闭壳肌表达量显著高于雄性。原位杂交结果显示,WNT4在雌性三角帆蚌的卵母细胞上有明显的杂交信号,推测WNT4基因与性别决定相关。     

河川沙塘鳢GH基因及侧翼的克隆与生物信息学分析

利用长片段PCR、基因组步移法及T-A克隆技术,成功克隆出河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)GH基因全长序列,提交至GenBank获得登录号MH717101。河川沙塘鳢GH基因全序列长5 120 bp,5'端和3'端侧翼序列长度分别为920、682 bp,经预测,上游区域含有MF3、GAGA factor、HNF-3alpha、C/EBP、R2、GATA-1等多种转录调控元件;转录单元长3 518 bp,包含4个内含子和5个外显子,4个内含子大小分别为75、333、2 070和121 bp,5个外显子长度分别为150、131、117、138和373 bp,第3内含子长达2 070 bp,其长度是翘嘴鲌(Culter alburnus)第3内含子的4倍以上;开放阅读框区(open reading frame,ORF)为594 bp,编码由197个氨基酸残基组成的蛋白质多肽。河川沙塘鳢与鲈形目、鲉形目、鲤形目、鲇形目等13种鱼类的氨基酸序列同源性比较表明,其与彼氏冰鰕虎鱼(Leucopsarion petersii)同源性最高,为83.8%,与草鱼(Ctenopharyngodon idella)同源性最低,为49.1%,在180~197氨基酸序列处,河川沙塘鳢表现出高度不保守性,与所列鱼类氨基酸排列均完全不一致。该研究结果为进一步研究河川沙塘鳢GH基因的表达、功能及其转录调控特征奠定了分子基础。     

龙眼TFL1基因的克隆与表达

以‘红核子’龙眼叶芽为材料,克隆了龙眼TFL1-1和TFL1-2基因的c DNA序列和基因组DNA序列,进行序列分析,并对这两个基因在花芽分化过程中的表达进行了研究.结果显示,龙眼TFL1-1基因c DNA开放阅读框共519 bp,编码173个氨基酸,TFL1-2基因c DNA开放阅读框共525 bp,编码175个氨基酸;两个基因DNA序列均含有4个外显子和3个内含子;序列分析和系统进化树分析表明,龙眼TFL1-1和TFL1-2都是TFL1同源基因,龙眼TFL1-1基因与柑橘、梨的TFL1基因亲缘关系较近;基因表达结果表明,龙眼TFL1-1和TFL1-2基因的功能都与抑制花芽分化有关.