胶体金免疫电镜技术检测和鉴定病汁液中不同形态的植物病毒

 本文报道胶体金免疫电镜技术的建立:铜网捕获病毒后,用其稀释约200倍的同源抗血清修饰处理3~5分钟,羊抗兔IgG-金复合物标记3~5分钟,经磷钨酸负染,电镜下可见病毒粒子周围金颗粒特异性吸附,而背景上非特异性吸附很少。用此技术成功地快速检测和鉴定了病汁液中线状病毒(大麦黄花叶病毒,大麦温和花叶病毒,小麦梭条斑花叶病毒,芜菁花叶病连和马铃薯Y病毒)、棒状病毒(烟草花叶病毒、长叶车前草花叶病毒和土传小麦花叶病毒)以及球状病毒(水稻矮缩病毒、黄瓜花叶病毒和大麦黄矮病毒)。用0.5M PBSpH7.0制备病汁液,可大幅度提高同源抗血清对黄瓜花叶病毒的捕获能力。     

马铃薯Y病毒组的提纯

马铃薯 Y 病毒组的有些成员容易提纯,并且容易获得高产量(20mg 以上/千克组织)。这些病毒有菜豆黄色花叶病毒的某些株系、三叶草黄脉、曼陀罗鞋带病毒、天仙子花叶、花生斑驳、辣椒脉斑驳、马铃薯Y、烟草蚀纹和芜菁花叶病毒的有些株系。马铃薯病毒组其他成员已证明提纯极其困难,常常得到产量很低。例如包括菜豆黄色     

用聚乙二醇沉淀法粗提纯植物病毒

南方菜豆花叶病毒(SBMV)经两次PEG沉淀提纯的粗提纯病毒制剂和经密度梯度提纯的精提纯病毒制剂,在电镜下均能观察到大量的球状病毒,且均具有典型的核蛋白吸收图谱。两种方法提纯的病毒制剂免疫家兔,都能制备出效价高达1/1024(免疫双扩散法)的抗血清。此外,烟草花叶病毒(TMV),黄瓜花叶病毒(CMV),马铃薯Y病毒(N株系)(PVY~N),苜蓿花叶病毒(AMV)和烟草坏死病毒(TNV)用PEG沉淀法粗提纯病毒也均获得良好的效果。     

A-蛋白结合乳胶粒子的乳胶凝集试验检测植物病毒研究

用 A-蛋白结合乳胶粒子,再吸附烟草坏死病毒(TNV)抗血清中的免疫球蛋白 G(IgG),制成乳胶致敏抗体复合物。这种复合物可检测病株粗提液和部分提纯液中的 TNV,它们的灵敏度分别为1:4096和0.625微克/毫升。特异性强。该方法也适用于白三叶草花叶病毒(WCMV)、大豆花叶病毒(SMV)、苜蓿花叶病毒(AMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)等的检测试验。     

芝麻坏死花叶病毒的鉴定

 自武昌芝麻坏死花叶病株得到1个病毒分离物,根据该分离物生物学特性、粒体形状、血清学性质、外壳蛋白分子量和核酸组分、大小,明确为自然侵染芝麻的一种新病毒,定名为芝麻坏死花叶病毒(Sesame necrotic mosaic virus,SNMV)。在人工接种7科38种植物中,SNMV侵染6科23种;体外稳定性状:稀释限点10^-4~10^-5,致死温度80~85℃,体外存活期限40d;病毒可通过土壤和接触传播。SNMV病毒粒体球状,表面有粒状突起,直径约32nm。制备病毒抗血清用琼脂双扩散方法测定效价为1:128。SNMV和红三叶草坏死花叶病毒(RCNMV)、甜三叶草坏死花叶病毒(SCNMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)和花生矮化病毒(PSV)抗血清没有反应。病毒外壳蛋白亚基分子量为38 100道尔顿;核酸1个组分,大小约4700nt,另含RNA片段,大小约600nt,可能为卫星RNA。依据上述病毒特性,SNMV可能归属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)。     

小RNA深度测序鉴定昭通市烟草脉斑病病毒

烟草脉斑病在云南昭通市的烟草上发生危害严重,为明确昭通市烟草脉斑病的病毒种类,本研究采集昭通市的4个烟草种植区症状表现为疑似烟草脉斑病的烟草样品,采用小RNA深度测序技术对不同来源的混合样品进行小RNA测序分析。结果显示混合样品中的病毒分别属于烟草花叶病毒属Tobamovirus、马铃薯Y病毒属Potyvirus和马铃薯卷叶病毒属Polerovirus。根据不同病毒属设计通用引物,分别对不同地区的烟草样品进行RT-PCR验证,结果表明,烟草样品中病毒种类有烟草花叶病毒、烟草脉带花叶病毒、烟草脉扭病毒和马铃薯Y病毒的PVYN、PVYN-Wi和PVYNTN株系。     

进一步研究A蛋白在检测病毒粒体的免疫电镜技术中的应用

在前一篇(Shukla 和 Gough,1979)我们报道了检测二种线状植物病毒甘蔗花叶病毒(SCMV)和烟草花叶病毒(TMV)改良的流行免疫电镜技术(Derrick,1973;Milne 和 Luisoni,1977)。它包括在用特异抗血清包被铜网前,预先用 A 蛋白(一种金黄葡萄球菌细胞壁蛋白)包被铜网。虽然这条件对严格比较来说还不是最理想的,但此方法比起单用抗血清处理诱捕的 SCMV和 TMV 病毒粒体的数量多。此技术特别适合在植物抽提液中含病毒浓度低的病毒。     

北京地区辣椒病毒病毒原种类及黄瓜花叶病毒株系鉴定

近十年来,经鉴定,明确了北京地区辣椒病毒病毒原有7种,即黄瓜花叶病毒(CMV)占病株样品的55％,烟草花叶病毒(TMV)占26％,马铃薯Y病毒(PXY)占13.2％,烟草蚀纹病毒(TEV)占11.8％,马铃薯X病毒(PVX)占10.4％,苜蓿花叶病毒(AMV)占2％,及蚕豆萎蔫病毒(BBWV)占1.4％。其中CMV可划分为4个株系,即重花叶株系,坏死株系,轻花叶株系和带状株系。     

烟草脉带花叶病毒cp基因的原核表达及抗血清制备

 利用马铃薯Y病毒属病毒的简并引物, 通过RT-PCR技术获得了云南烟草病毒分离物YND的3'端约1.7 kb片段, 序列分析证明该分离物为烟草脉带花叶病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)。将TVBMVcp基因克隆到表达载体pET-22b (+)上, 在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达出分子量为35.0 kD的融合蛋白。利用该融合蛋白制备了TVBMV的多克隆抗体, ELISA测定抗血清效价为1/4 096。Western blotting和DIBA分析结果表明, 获得的抗血清和原核表达的病毒蛋白及植物病汁液中的病毒均有特异性反应, 可用于TVBMV的快速检测。     

北京地区辣椒病毒病毒原种类及黄瓜花叶病毒株系鉴定

近十年来,经鉴定,明确了北京地区辣椒病毒病毒原有7种,即黄瓜花叶病毒(CMV)占病株样品的55％,烟草花叶病毒(TMV)占26％,马铃薯Y病毒(PXY)占13.2％,烟草蚀纹病毒(TEV)占11.8％,马铃薯X病毒(PVX)占10.4％,苜蓿花叶病毒(AMV)占2％,及蚕豆萎蔫病毒(BBWV)占1.4％。其中CMV可划分为4个株系,即重花叶株系,坏死株系,轻花叶株系和带状株系。