中华常春藤细菌性叶斑病病原菌的鉴定

 2015年春季在昆明市区绿化带种植的中华常春藤上发现一种由细菌侵染而引起的病害,称为中华常春藤细菌性叶斑病。通过发病症状、菌落形态观察、致病性测定、Biolog分析,16S rDNA序列和核糖体DNA内转录间隔区(internal trans-cribed spacer, ITS )序列分析比较,对昆明地区的常春藤叶斑病病原菌及其系统进化关系进行研究。分离病原菌接种中华常春藤叶片完成科赫法则验证,发病初期在叶片表面形成带有黄色叶晕的不规则褐色斑点,后期叶片边缘形成倒V字型坏死并起皱。将菌株CCT1和CCT6测序结果与现有的黄单胞菌菌株的16S rDNA序列和核糖体DNA的ITS序列构建进化树,结果均显示病原菌与野油菜黄单胞菌的序列相似度最大,属于同一支。研究确定该病原菌为野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。这是中国首次报道由X. campestris 引起的中华常春藤叶斑病。     

红掌细菌性疫病的病原菌初步鉴定

 在云南西双版纳的红掌上发现一种由细菌侵染引起的病害,从叶片的病组织上分离到具有致病性的杆状细菌,将分离的病原菌接种于健康的红掌上,表现出与田间一致的症状。感病初期在叶缘或叶脉间出现水渍状小点,后期病斑多呈棕褐色至黑色坏死,病健交界处多呈黄色。从接种发病的病斑与田间标样上分离的病原菌菌落形态完全相同。通过菌株的培养性状、常规生理生化特性及透射电镜下菌体形态观察结果,将病原菌初步鉴定为黄单胞菌属(Xanthomonas)。BIOLOG鉴定和致病性测定结果进一步鉴定病原菌为地毯草黄单胞菌花叶万年青致病变种Xanthomonas axonopodis pv. dieffenbachiae(Xad)(McCulloch & Pirone) Vauterin et al.     

新疆加工型辣椒细菌性斑点病的发生和病原鉴定

 新疆加工型辣椒主要产区巴音郭楞蒙古自治州发生了一种严重危害辣椒的细菌性病害。从发病辣椒叶片中分离细菌,通过烟草过敏性反应、马铃薯软腐试验和接种辣椒等致病性测定,确定了13个致病菌株,各菌株之间致病力无明显差异。通过菌体形态、培养性状观察、生理生化反应、寄主范围测定,结合16S rDNA和rpoD基因扩增、序列测定和系统发育分析,将病原菌鉴定为丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae)。病原菌人工接种还能侵染番茄、茄子、马铃薯及黄瓜、四季豆、白菜、萝卜、芹菜等植物。P. syringae pv. syringae引起加工型辣椒细菌性斑点病在国内属首次报道。     

番茄细菌性斑点病病原菌鉴定

 1998~1999年在吉林省、辽宁省、黑龙江省等地的大棚番茄上发现一种番茄病害,并从其病叶、病茎杆上分离得到了23个细菌菌株。接种番茄幼苗上,发病症状与自然发病症状完全一致,并从接种病株上重新分离到此病原细菌。各菌株致病力无明显的差异。经革兰氏染色反应、菌体形态、培养性状、生理生化反应、G+C mol%等鉴定,确认该病原菌为丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato(Okabe)Young,Dye&Wilkie)。该病菌引起番茄细菌性斑点病(又称叶斑病)。病菌除侵染番茄外,尚能侵染茄子、辣椒、龙葵、白花曼陀罗和毛曼陀罗。该病害尚属我国大陆首次报道。     

一串红穿孔病病原鉴定和初侵染源分析

 2021年夏季,受台风“烟花”影响,上海市奉贤区海湾镇大面积一串红种苗突发穿孔病,本文按照柯赫氏法则鉴定病原物并进行初侵染源分析。从田间病样中分离出的黄色分离物YchA回接一串红形成穿孔症状,在非寄主本氏烟草上可激发过敏反应。16S rDNA序列分析显示YchA为黄单胞菌属;以持家基因fyuA、gyrB、rpoD进行多位点序列分析(Multi-locus sequence analysis, MLSA)发现,菌株YchA与核桃细菌性黑斑病菌(Xanthomonas arboricola pv. juglandis, Xaj)亲缘关系最近;Biolog鉴定系统分析显示,一串红穿孔病病原为Xaj的可能性约为68%。对育苗基质、种子和灌溉水的检测发现,种子和灌溉水带菌。这些结果表明,一串红细菌性穿孔病的病原为树生黄单胞菌(X. arboricola),可能是一个新致病变种;种子带菌是病害的初侵染来源,灌溉水带菌扩散。     

7种检疫性植物病原黄单胞菌III型分泌系统和效应蛋白编码基因的差异性分析

 γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的黄单胞菌属(Xanthomonas)的大多数种类可引起植物病害,多数是我国检疫对象。与其他革兰氏阴性植物病原细菌一样,植物病原黄单胞菌可通过高度保守的III型分泌系统(type-III secretion system, T3SS)分泌效应蛋白(T3SS-secreted effectors, T3SEs)进入植物细胞,在非寄主植物和抗病寄主植物上产生过敏反应(hypersensitive response, HR)以及在感病寄主植物上具有致病性。尚不清楚哪些种类的黄单胞菌具有T3SS和缺少哪些T3SE是否可作为检疫的依据。搜集7种检疫性植物病原黄单胞菌,通过PCR和Southern杂交试验结果发现:香蕉细菌性青枯病菌(X. campestris pv. musacearum)的ICMP287和ATCC49084菌株、甘蔗流胶病菌(X. axonopodis pv. vasculorum)ATCC13901菌株、洋葱细菌性叶枯病菌(X. axonopodis pv. allii)的LMG576和LMG578菌株中不含有tale基因,并且ATCC13901菌株既不含有T3SS基因也不含有hpa1和xopQ基因;菜豆细菌性疫病菌(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株不含有hpa1基因。相应地,推测含有2~12个tale基因的黄单胞菌有:大豆斑疹病菌(X. axonopodis pv. glycines)ICMP5732和ATCC43911菌株、豌豆细菌性疫病菌(X. axonopodis pv. vignicola)ATCC11648菌株、棉花细菌性角斑病菌(X. campestris pv. malvacearum)ATCC12131和(X. campestris pv. phaseoli)ATCC49119菌株。大豆细菌性斑疹病菌ATCC43911菌株尽管含有hpa1、xopQ和hrcC基因,但在非寄主烟草上不能激发HR反应;而甘蔗流胶病菌ATCC13901菌株不含有hpa1、xopQ和hrcC基因,却激发烟草产生HR反应。这些结果对于分析比较不同植物病原黄单胞菌的致病性因子和设计特定的植物检疫靶点提供了科学线索。     

云南甘蔗白条病的多基因联合鉴定

甘蔗白条病是由白条黄单胞菌Xanthomonas albilineans(Ashby) Dowson引起的甘蔗重要病害。2017年在云南保山、孟定和金平蔗区的甘蔗上发现疑似白条病的病害。从病株蔗茎中分离得到圆形,凸面,光滑,有光泽,黄色的细菌菌落。经柯赫氏法则验证,分离得到的细菌为该病害的病原菌。使用16S rRNA基因、gyrB基因和rpoD基因对分离得到的病原菌进行了分子鉴定,BLAST和系统发育分析表明本研究所获得的病原菌的3个基因的核苷酸序列与白条黄单胞菌GPE PC73菌株(GenBank登录号:FP565176)对应基因的核苷酸序列一致性均为100%,在系统发育树中处于同一分支。根据田间症状诊断、柯赫氏法则验证及分子鉴定结果,确认云南保山、孟定和金平发生的甘蔗病害为X.albilineans引起的甘蔗白条病。     

香椿细菌性叶斑病病原菌初步研究

在山东省滨州市和泰安市田间调查,发现香椿上一种新的细菌病害。从采集的病叶上分离到15个细菌菌株,选出其中6个菌株,在自然条件下人工伤口接种香椿,发病症状与自然发病症状一致,从接种发病的病叶上又重新分离到与接种菌株相同的病原细菌,供试6个细菌菌株均为该病的致病菌。经染色反应、生理生化测定及菌体形态和培养性状等比较分析,确认香椿细菌性叶斑病致病菌为油菜黄单胞菌楝树致病变种[Xanthomonas campestris pv.azadirachtae(Desai.Gandhi.Pateletkotas thane 1966)Dye 1978]。     

进境加拿大豌豆中豌豆细菌性疫病菌的检测

 利用MT选择性培养基从进境加拿大豌豆样品上分离到一株细菌分离物(编号1314),对该分离物进行PCR检测、16S和23S rRNA序列扩增、多位点序列分析、Biolog测定、烟草过敏性反应和致病性测试。豌豆细菌性疫病菌(Pseudomonas syringae pv. pisi, Ppi)特异引物AN7F/AN7R扩增分离物1314和Ppi菌株ATCC 11043得到预期272 bp的条带,二者的PCR产物序列一致,与GenBank中Ppi (X97405)的序列相似性为99.57%。分离物1314的部分16S rRNA、23S rRNA序列以及16S-23S序列均与Ppi菌株ATCC 11043一致。选择gap1、gltA、gyrB和ropD 4个看家基因进行多位点序列分析,系统发育树显示分离物1314与Ppi菌株聚在同一组内。Biolog鉴定结果表明:分离物1314为Ppi,PROB值为0.898,SIM为0.72。该分离物人工接种豌豆茎秆能引起水渍状症斑,接种烟草叶片产生过敏性反应。基于上述试验结果,将分离物1314鉴定为豌豆细菌性疫病菌。     

落葵上发现短小杆菌属(Curtobacterium)一个新的致病变种

 1994年在江苏省南京及镇江地区新发现了落葵细菌性叶斑病,从病斑所分离的10个细菌菌株经柯赫氏法则验证,均确系该病的病原菌。采用形态观察、表型特征和生理生化特性测定、数值分析、血清学反应、细胞化学成分分析和DNAG+C mol%测定进行了鉴定,并与植物病原棒形细菌15个标准菌株进行了比较。该病原菌为革兰氏阳性细菌,不规则短杆状,有一根鞭毛,亚极生或侧生,结合其生理生化特性、细胞化学成分和DNAG+C mol%测定结果,认为应属于短小杆菌属(Curtobacterium)的萎蔫短小杆菌(Cur.flaccumfaciens),数值分析也支持这一结论。此外,据血清学反应结果及其对短小杆菌属的其它植物寄主的致病情况,认为该病原菌应是萎蔫短小杆菌种下一个新的致病变种,定名为Curtobacterium flaccumfaciens pv.basellae pv.nov.(萎蔫短小杆菌落葵致病变种)。     

浙江西兰花花球头腐病的病原鉴定

为明确近年来浙江省宁波市部分地区发生的西兰花花球头腐病的病原,通过田间症状观察、致病性测定、Biolog和脂肪酸(fatty acid methyl ester,FAME)分析将分离到的病原菌鉴定为荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens.利用16S rDNA和核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列构建的系统发育树也都显示分离的西兰花菌株与假单胞菌聚合成群,其中与荧光假单胞菌的亲缘关系最近,序列同源性分别为99%和98%.表明浙江省西兰花花球上发生的细菌性头腐病由荧光假单胞菌引起.     

我国部分地区土壤中绿僵菌的物种多样性

绿僵菌是一种广泛存在且具有较高经济、生态价值的极具发展前景的绿色安全生物防治材料。为了更好地了解我国绿僵菌资源的生物多样性,本研究从13个省份不同生境中采集土壤样品,采用选择培养的方法对绿僵菌菌株进行分离纯化,通过形态学、分子生物学获取其ITS1和ITS4序列等方法鉴定菌株。在用MEGA软件依据邻接法（NJ）构建基于绿僵菌菌株ITS1和ITS4序列的系统发育树并进行同源性分析的基础上,采用香农-威纳指数、优势度指数和均匀度指数评价其多样性。结果表明,在607份土壤样品中,分离出绿僵菌属真菌共计222株,其中优势菌种金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae 130株,优势度指数为0.586;另有马昆德绿僵菌Metarhizium marquandii 83株、黄绿绿僵菌Metarhizium flavoviride 7株、罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii 2株。林地的香农-威纳指数最高,为0.983,说明其物种丰富度最高。林地的均匀度指数最高,为0.709,说明其不同种间分配最均匀。     

山西壶瓶枣缩果病病原菌分离和鉴定

 2005~2008年山西壶瓶枣缩果病害发生严重,造成了巨大的经济损失。本文利用真菌ITSrDNA和细菌16S rDNA基因的通用引物,分别对分离自山西晋中的罹病壶瓶枣果实表面寄生真菌和细菌基因组DNA进行PCR扩增,将扩增产物进行核苷酸序列测定,在GenBank数据库进行Megablast同源性分析,确定壶瓶枣果实的主要寄生菌是细极链格孢菌(Alternaria alternata)、白囊耙齿菌(Irpex lacteus)、青霉菌(Penicillium expansum)、芽枝孢菌(Cladosporium tenuissimum)4种真菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)4种细菌。回接试验证明链格孢菌、青霉菌、芽枝孢菌是壶瓶枣果实主要的致病真菌,而所分离的细菌没有致病性。     

海南玉米穗腐病病原菌分离鉴定及优势种的遗传多样性分析

为了阐明海南省玉米穗腐病病原菌的种类,结合形态学和分子生物学方法对83份病样进行了病原菌的分离和鉴定,最终获得12种病原菌,包括拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)、层出镰孢(F.proliferatum)、亚粘团镰孢(F.subglutinans)、木贼镰孢(F.equiseti)、新知镰孢(F.andiyazi)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、拟康宁木霉(T.koningiopsis)、卵孢木霉(T.ovalisporum)、喙刚毛球腔菌(Exserohilum rostratum)、玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)和可可毛色二孢(Lasiodiplodia theobromae)。其中,拟轮枝镰孢分离频率占65.06%,为优势种。以拟轮枝镰孢的EF-1α、histone 3和β-tubulin基因序列为基础进行多基因家系分析,以明确海南省与内陆部分省份不同菌株之间的遗传关系。结果表明,海南省内菌株之间具有丰富的遗传多样性,而且海南省和内陆省份菌株之间存在高频率的基因交流。     

海南槟榔细菌性叶斑病病原鉴定

In 2008, a severe bacterial disease was observed in Wenchang, Hainan Province. Symptoms consisted of small circular to elongated brown lesions surrounded by yellow halos. All isolates, which formed white colonies, were gram-negative and each had a single, polar, sheathed flagellum. Isolates were oxidase and catalase positive, negative for arginine dihydrolase, gelatin hydrolysis and starch hydrolysis, and acid production from levan. Sequences of the 16S rDNA gene of the isolates shared 98% sequence identity with that of Burkholderia andropogonis strain LMG2129 (GenBank accession No. NR118985). Pathogenicity tests were conducted and fulfilled Koch's postulates, indicating that these isolates are causative agent of the disease. The results led to the conclusion that the causal pathogen of betel palm bacterial leaf spot was B. andropogonis. It is the first report of B. andropogonis causing bacterial leaf spot of betel palm in mainland China.     

甜樱桃流胶病原菌的分子鉴定和致病性检测

 为明确甜樱桃流胶病的病原菌,采用普通细菌学方法从15个病样中分离获得10个代表性菌株,对病原菌的形态学特征、生理生化特性以及致病性进行了研究。利用PCR对菌株的16S-23S rDNA转录间隔区(ITS)序列进行扩增,扩增产物克隆测序,结果显示该菌株属于丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)。用MegAlign构建系统发育树,结果显示该菌株与丁香假单胞菌丁香致病变种(P. syringae pv. syringae)亲缘关系最近,两者最先聚在一起。分离菌株中均可检测到syrB基因。研究结果表明P. syringae pv. syringae为甜樱桃流胶病的病原菌。     

芹菜细菌性软腐病病原的分离与鉴定

 由植物病原细菌引起的芹菜软腐病在北京地区普遍发生,其中以顺义及通州区县较为严重。自发病芹菜茎段中分离细菌,通过接种芹菜进行致病性测定,确定了54个致病菌株。虽然菌株间致病力有一定的差异,但大多数菌株对芹菜致病力强。通过培养性状和菌体形态观察、生理生化反应和Biolog测定,结合胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum 6个管家基因(pgi、rpoS、mdh、proA、mtlD、icdA)的基因扩增、序列测定和多基因联合系统发育分析,将病原菌鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌P. carotovorum的3个亚种。其中45个菌株为P. carotovorum subsp. odoriferum,频数为83.33%;6个菌株为P. carotovorum subsp. carotovorum,频数为11.11%;3个菌株为P. carotovorum subsp. brasiliensis,频数为5.56%。上述结果显示,北京地区芹菜细菌性软腐病的病原菌为胡萝卜软腐果胶杆菌P. carotovorum的3个亚种,其中以P. carotovorum subsp. odoriferum为优势种。     

半夏细菌性软腐病原菌的分离及鉴定

 在浙江省人工栽培的半夏[Pinellia ternata(Thunb.) Breit.]上发现一种新的软腐病害,软腐症状常常表现在块茎上,高温高湿条件可导致叶面腐烂和整株死亡。为了对病原菌进行鉴定,从软腐的半夏病株块茎中分离到10个菌株,分别指定为RF1~RF10,并进行了致病性测定、形态观察和细菌学特性分析,同时对RF1菌株进行了分子鉴定。结果表明,10个菌株均可经人工接种导致半夏、胡萝卜、马铃薯、番茄、黄瓜和白菜软腐。在电镜下菌体呈短杆状,两端钝圆,具有4~6根周生鞭毛。兼性厌氧、革兰氏阴性,DNA中G+C mol%为51。RF1菌株的16S rDNA测序和系统发育学分析表明,其与胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum)M1菌株报告的序列相同点为99%,与该亚种另2个菌株(E161和441)的序列相同点达97%。结果表明,半夏软腐病原菌应归属于胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜软腐亚种。