减蛋综合征病毒的分子生物学

减蛋综合征病毒具有典型的腺病毒形态结构,其基因组长33.2kb,分子量为22.6×106Da,各地分离株间有变异。以DNA复制为界,EDSV基因组分为早期E区(包括Eib、E2a、E2b、E3和E4区)和晚期L区(L1－L5区),早期区编码病毒复制所必需的酶类;晚期区编码五邻体、六邻体等主要结构蛋白,以及DNA结合蛋白、末端前体蛋白等病毒包装蛋白。EDSV分子生物学的深入研究为建立本病的诊断与防制技术,开发理想的表达载体系统,及确定其在病毒学中的分类地位奠定了基础。     

鸡鸭鹅A型禽腺病毒的PCR检测和分析

为了解A型禽腺病毒在家禽中的分布情况,从不同地区外表健康家禽中采集泄殖腔拭子,根据鸡胚致死孤儿病毒（Chicken Embryo Lethal Orphan Virus,CELOV）的全基因组序列设计引物,采用PCR方法扩增了禽腺病毒（Fovl Adenoviruses,FAV）病毒基因组右未端ITR片段和ORF 8片段。结果表明：A型禽腺病毒在家禽中分布比较广泛,鸡群、鸭群和鹅群的阳性率分别为23．8％、51．7％和17．2％。ITR片段扩增产物测序结果表明,禽腺病毒分离株与A型禽腺病毒CELOV、FAV-JS株在ITR片段具有很高同源性,而与FAV-9、火鸡腺病毒A型和鸭腺病毒A型的同源性较低。ORF8片段扩增产物测序结果表明,分离株的ORF8的序列与CELOV、FAV-JS株的ORF8片段也具有高度同源性。     

火鸡出血性肠炎病毒分子生物学研究进展

本文阐述了火同血性肠炎病毒近年来在分子生物学方面的研究进展。HEV基因组全长26263bp，是目前所知道最短的禽腺病毒。基因组中G＋C含量为34.93%。与其它腺病毒相似，含有39bp的末端重复序列，晚期蛋白基因（52k,Ⅲa，五邻体，核心蛋白，六邻体，肽链内切酶，100k,P^Ⅷ，和纤维蛋白），早期基因（聚合病毒，末端蛋白，DNA结合蛋白）和中期基因VIa2及其编码蛋白与其它腺病毒相比具有相似性，基因组中无明显的E1、E4区。然而，作为腺病毒分类的三个标准即基因组长度、末端重复序列及G＋C含量，其与牛腺病毒在分类地位上最接近，开放阅读框架与已发表的禽腺病毒无相似性。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的复制缺陷型重组腺病毒的构建

利用大肠杆菌内质粒间同源重组的方法,将狂犬病病毒G基因插入腺病毒基因组的E1基因区,构建了带有狂犬病病毒G基因的重组腺病毒质粒。重组质粒经Pme酶切,线性化后转染293细胞,成功获得了均一的复制缺陷型重组腺病毒。荧光显微镜下能观察到重组腺病毒GFP报告基因的表达。用PCR方法证实了重组腺病毒基因组中含有G基因,RT-PCR方法可检测到G基因的转录产物mRNA,Westernblotting方法能检测到重组腺病毒在29细胞中表达的G蛋白。此重组腺病毒在293细胞连续传代10次,PCR方法都能扩增出G基因目的条带。试验结果表明,狂犬病病毒G基因已成功重组到腺病毒基因组中,不但能稳定表达,而且能在重组腺病毒基因组中稳定存在。     

ALV-J和REV诱导雏鸡腔上囊细胞凋亡试验

禽白血病/肉瘤病毒群可引起禽类的多种肿瘤性疾病[1].1988年英国的Payne及其同事又从肉用型鸡群中分离得到了一株新的白血病病毒,命名为J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J, ALV-J).该亚型主要感染肉鸡,可使肉仔鸡早期发生白血病,并可造成免疫抑制[2].     

基因自然重排鸡传染性法氏囊病病毒的分子特征

为了对某鸡群疑似传染性法氏囊病(IBD)的病例进行分子诊断、病毒分离和分子特征分析，本试验通过核酸检测调查该鸡群法氏囊组织和病毒分离物中传染性法氏囊病病毒(IBDV)的感染情况，将分离得到的毒株命名为GL1906,继而对该病毒基因组双节段的VP2高变区(vVP2)序列和VP1-b序列进行分析。结果显示，GL1906 vVP2基因的特征性氨基酸位点在222A、256I、284A、294I和299S上均符合超强毒株(vvIBDV)的特征，但279N符合致弱毒株的特征；VP1-b基因在242D、390L、393E与弱毒株一致，287A与vvIBDV一致，此外第777～782位核苷酸序列为GGTGCC,与弱毒株一致；GL1906 vVP2的核苷酸、氨基酸序列与vvIBDV的同源性最高，在系统进化树中与vvIBDV同为A3分支；GL1906 VP1-b的核苷酸、氨基酸序列与B节段属于独特来源的NN1172同源性最高，在系统进化树中同属于B3独特分支。结果表明，本试验分离株GL1906的基因组双节段vVP2和VP1-b具有不同的来源，是基因型为A3B3的基因自然重排毒株。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株ORF63基因的序列特征及表达与启动子活性分析

斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型(SpltMNPVⅡ)分离株是繁殖率和毒力极强的新型病毒株,ORF63是该病毒分离株的一个功能未知基因。从SpltMNPVⅡ分离株基因组中克隆了ORF63。序列分析表明,该基因读码框为1 071 bp,编码356个氨基酸,蛋白质分子质量为41.3 kD;起始密码子ATG上游存在一个早期和晚期启动子基序,编码蛋白序列含有CNX、MutH等多种结构域。启动子活性和转录时相分析表明ORF63是一个早、晚期表达的基因,在病毒感染4 h和18 h时有2个转录峰,24 h以后转录水平略有下降,但总体趋于稳定。构建该基因的原核表达载体pET-28a-ORF63,并转化大肠杆菌BL21(DE3),表达并纯化融合蛋白后制备多克隆抗体,Western blot检测制备的多克隆抗体特异性较好,效价可达1∶3 200以上。由以上结果推测,SpltMNPVⅡ分离株的ORF63基因是一个早期和晚期均有表达的病毒基因,可能与SpltMNPVⅡ感染宿主细胞后自身DNA的复制有关,参与早期芽生病毒(BV)的发生和晚期包涵体衍生病毒(ODV)的成熟2个过程。     

疙瘩皮肤病病毒基因组测序完成

疙瘩皮肤病是一种主要在非洲危害养牛业的病毒性传染病 ,其被国际兽疫局 (OIE)列为 A类传染病。病原是痘病毒科羊痘病毒属中的疙瘩皮肤病病毒 (lum py skin disease virus,L SDV)。最近 ,美国科学家报道了 L SDV的基因组序列 ,其基因组长 15 1kb,由中央的编码区和两翼的长为 2 .4kb的倒置末端重复序列 (ITR)组成 ,有 15 6个推测的基因。除了大部分基因与猪痘病毒、Yaba病毒和兔痘病毒有较高的同源性以外 ,还发现了其独有的与病毒感染宿主范围和毒力有关的基因疙瘩皮肤病病毒基因组测序完成@郭志儒…     

转基因畜禽的研究进展

转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物.自Mintz等(1979)将猴腺病毒伴随病毒(SV40)DNA导入小鼠早期胚胎的囊胚腔,得到了第一个承载有人工导入外源基因的嵌合体小鼠以来,在短短的十多年里,国内外关于转基因的研究渗透到了生物学的各个领域,为许多基因研究提供了大量宝贵的资料[1].     

从病鸡肿瘤组织中同时检测出网状内皮组织增生症病毒(REV)和J亚群禽白血病病毒(ALV-J)

禽网状内皮组织增殖病病毒（reticuendotheliosis virus,REV）是禽网状内皮组织增殖病的病原,属反转录病毒科中C型致肿瘤病毒类的一种.该病毒主要侵害火鸡,但也能引起鸡、鸭等禽类以淋巴-网状组织增生为特征的肿瘤性的病理综合征[1～2].REV基因组两端的长末端重复序列（LTR）非常保守,同源性在94%以上[4].通过PCR方法,特异性地扩增REV LTR序列常被用作检测REV存在的方法[4～6].     

猪白细胞介素2基因的克隆及腺病毒表达载体的构建

根据GenBank中收录的猪白细胞介素2(pIL-2)基因序列,设计1对特异性引物.运用RT-PCR技术从刀豆素(Con A)诱导的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到pIL-2基因,并将其克隆至pGEM-T Easy栽体上.核苷酸测序结果显示,获得的基因序列全长493 bp,含465 bp的开放阅读框,编码154个氨基酸,与已知pIL-2核苷酸序列和氨基酸序列的同源性都高达100%.将克隆的pIL-2基因编码阅读框亚克隆至腺病毒穿梭栽体pShuttle-CMV,电转化含腺病毒基因组(pAdEasy-1)的大肠埃希茵细胞BJ5183-AD-1,成功获得了重组腺病毒DNA,将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD-293细胞,经过病毒基因组的PCR鉴定和转录水平的RT-PCR鉴定,初步表明,获得了表达pIL-2的重组腺病毒.     

ANP32A物种特异性差异限制甲型禽流感病毒聚合酶在宿主中作用的研究

当具有新抗原性的人畜共患流感病毒获得在人类中传播的能力时,流感大流行将随时可能发生。宿主范围变化受禽类病毒成分与人类宿主间兼容性的限制,包括受体偏好、病毒粒子稳定性及禽类病毒RNA依赖性RNA聚合酶的在人类细胞中的低活性。哺乳动物在适应过程中,会自动选择异三聚体病毒聚合酶成分,尤其是PB2蛋白的突变体,但其作用方式尚不清楚。研究结果显示,宿主ANP32A蛋白的物种特异性差异是限制禽类病毒聚合酶在哺乳动物细胞中作用的因素。禽类ANP32A蛋白在富含亮氨酸重复序列与羧基端低复杂度酸性区结构域间还有33个氨基酸。禽类病毒侵染哺乳动物细胞后,禽类ANP32A蛋白促使禽类病毒聚合酶达到类似于哺乳动物适应聚合酶的水平。删除鸡ANP32A中禽类特异性序列可阻断该活性,但将其插入人体ANP32A或紧密相关的ANP32B,可强化禽类病毒聚合酶作用。H5N1或H7N9亚型禽流感病毒感染人体后,迅速选择替换聚合酶蛋白,如PB2(E627K),从而将病毒聚合酶替换为较短的哺乳动物ANP32A。因此,ANP32A被认为是支持流感病毒复制的重要宿主合作伙伴,是新抗病毒药物的候选宿主靶蛋白。     

囊素对哺乳动物免疫促进作用的研究Ⅰ.囊素对猪瘟疫苗接种猪体液免疫的影响

囊素(bursin)是禽类法氏囊组织产生的一种三肽物质,主要存在于法氏囊组织提取液中[1～2].它在体外能够促进禽类和哺乳动物前体B淋巴细胞的分化和增殖[1～3],在体内能使胚胎期切除法氏囊的小鸡出现法氏囊复生[4],还可显著提高新城疫和法氏囊病疫苗接种鸡的抗体水平[5～6],延长抗体持续时间.这说明囊素对提高鸡的免疫力和疫苗免疫效果具有显著促进作用.但它对哺乳动物是否也具有类似作用,目前尚未见报道,为此,作者进行了本研究,现报告如下.     

鸭白细胞介素2全基因组结构分析

依据鸡白细胞介素2（chIL-2）全基因组序列设计引物探针,以简易基因组抽提法获得的鸭外周血单核细胞基因组DNA为模板,用长距离聚合酶链式反应（LD-PCR）扩增出鸭白细胞介素2（duIL-2）全基因片段。经序列测定,得到的duIL-2基因组DNA序列全长为3528bp。运用生物信息学方法对duIL-2的基因、启动子结构和cDNA序列编码的成熟蛋白进行系统分析,结果表明,duIL-2基因具有典型的4个外显子和3个内含子结构,和已知禽类及哺乳类同系物基因总体结构具有明显的相似性。鸭和鸡及其他哺乳动物IL-2基因的启动子序列具有显著的保守性,都具有AP-1、NF-AT、CD28RE、OCT、TATAbox转录起始因子结合位点和预测的转录起始位点。duIL-2cDNA序列编码的成熟蛋白进化分析表明,鸭和鹅的亲缘关系最近,和哺乳动物的亲缘关系较远,显示出明显的种属差异。     

表达A型口蹄疫病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达A型口蹄疫病毒(FMDV)衣壳蛋白的重组腺病毒,本研究通过人工合成A型FMDVP1-2A、2B和3C融合基因,将其克隆到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中,利用E.coli BJ5183内同源重组将目的基因插入腺病毒骨架质粒pAdEasy-1中,获得携带A型FMDV P1-2A-2B-3C基因的重组AdEasy-1。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染AD-293细胞,获得重组腺病毒rAd-A09。经PCR检测,该重组腺病毒在传代过程中目的基因稳定存在,病毒滴度在第8代时可达到108.5TCID50/mL。间接免疫荧光检测和western blot分析表明,rAd-A09在AD-293细胞中产生FMDV的结构蛋白VP0、VP1和VP3。该重组腺病毒的构建为口蹄疫新型疫苗的研究奠定了基础。     

表达虎源H_5N_1亚型禽流感病毒NP蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

将A/Tiger/Harbin/132/2007(H5N1)的NP基因克隆入pVAX1载体中,然后将含有NP基因的表达盒(CMV+NP+PolyA)克隆入pVAXE3的SspⅠ酶切缺失处,获得含有NP基因表达盒的穿梭载体pVAXΔE3-NP。用SalⅠ+NruⅠ分别对pVAXΔE3-NP和pPoly-2-CAV-2进行双酶切,将含有NP基因表达盒的片段定向克隆入pPoly-2-CAV-2,获得在E3区缺失处插入NP基因表达盒的重组质粒pCAV-2-NP。释放CAV-2-NP重组基因组,脂质体介导转染DK细胞,获得了能使DK细胞产生典型腺病毒样细胞病变的CAV-2-NP重组病毒。从形态学、基因组水平、NP基因的转录、NP蛋白的表达以及重组病毒的生长特征等方面进行鉴定。结果表明,CAV-2-NP具有典型的CAV-2形态特征,在繁殖过程中没有对H5N1NP表达盒片段进行缺失或重排,并且能够转录H5N1NP基因的mRNA,ELISA和免疫荧光分析表明重组表达产物可被流感病毒NP基因单克隆抗体1G6G4所识别。     

江西省J-亚型禽白血病的血清学调查

<正>禽白血病(Avian Leukosis AL)是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus ALV)和禽肉瘤病病毒(A-vian Sarcoma Virus ASV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称[1]。1991年以前,禽病工作者对禽白血病病毒的分类按照感染宿主范围、血清中和试验、干扰试验和病毒的基因组结构将其划分为A、B、C、D、E、F、G、H、I等9个亚群,其中A、B、C、D、E亚群主要     

表达犬瘟热病毒H基因的重组犬2型腺病毒的构建与鉴定

将犬瘟热病毒 ( canine distemper virus,CDV ) H基因表达盒克隆入转移质粒 p VAXΔE3,构建含 CDV H基因表达盒的转移质粒 p VAXΔ E3L PH,用 Nru 和 Sal 分别酶切转移质粒 p VAXΔ E3L PH和犬 2型腺病毒全基因组质粒p Poly2 - CAV- 2 ,将 CDV H基因表达盒定向克隆入 p Poly2 - CAV- 2质粒中 ,构建 E3区部分缺失的包含 CDV H基因表达盒的犬 2型腺病毒重组质粒 p CAV- 2 / CDVL PH。 Asc 和 Cla 对 p CAV- 2 / CDVL PH进行双酶切 ,释放 CAV- 2 /CDVL PH重组基因组 ,利用脂质体将 CAV- 2 / CDVL PH重组基因组与去除 Sal 和 Nru 片段的 CAV- 2基因组两端片段共转染 DK细胞 ,盲传和重复转染 3次 ,4 d后出现典型 CAV- 2病变 ,获得重组病毒 CAV- 2 / CDVL PH。用 CDV H基因特异性引物经 RT- PCR扩增重组病毒 DK细胞培养物 ,能够扩增出相应的核酸片段 ,表明 CAV- 2 / CDVL PH在DK细胞繁殖的过程中能够转录 CDVL P H的 m RNA,重组病毒免疫犬 ,可以诱导犬产生特异的抗 CAV- 2 HI抗体和抗 CDV中和抗体     

表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因重组腺病毒的构建及其免疫原性

RT-PCR扩增猪流感病毒A/Swine/Fujian/1/2001(H5N1)株的HA基因,构建重组腺病毒穿梭质粒pDC315-H5HA-EGFP.采用Ad-Max同源重组系统和共转染技术,构建了表达H5N1亚型猪流感病毒HA基因的复制缺陷型重组腺病毒(rAd-H5HA-EGFP).经目的基因PCR检测及序列测定,结果表明:HA基因已经正确地插入到腺病毒的基因组中;通过RT-PCR检测与Western blot分析,结果表明:HA基因能够进行正确转录,并且所表达的蛋白具有相应的生物学活性.子代重组腺病毒rAd-H5HA-EGFP经增殖、纯化后感染性滴度可达2.26×1010 TCID50 mL-1.rAd-H5HA-EGFP免疫BALB/c小鼠能够诱导特异性的HI抗体产生,有效阻止病毒在体内的复制.     

表达猪瘟病毒石门株E0抗原的重组腺病毒构建及免疫性的研究

应用PCR从pMD18-T-E0质粒中扩增编码CSFV E0蛋白的基因片段,定向克隆到重组腺病毒Adeasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用细菌内同源重组“两步转化法”构建携带CSFV E0基因的重组腺病毒基因组质粒pAdEasy-E0,转染293细胞,成功包装出重组腺病毒pAd-E0,PCR证实E0基因已整合至腺病毒基因组中,用Western blot检测到重组病毒感染293细胞中E0蛋白的表达。重组病毒免疫小鼠和猪,结果2次免疫后产生明显的免疫应答,ELISA检测小鼠血清抗体滴度分别为1∶512和1∶10240;猪血清抗体滴度分别为1∶16和1∶64。本研究成功构建了表达猪瘟病毒E0基因的非复制型重组腺病毒,该重组病毒免疫小鼠可产生较高的抗体滴度,免疫猪后能提供一定的保护效果。