大豆胞囊线虫抗性候选基因Rhg1的克隆及其功能验证

大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode,SCN)是大豆生产上一种危害严重的世界性害虫,给大豆的产量和品质造成极大的损失。大豆抗性品种选育是其防治措施中最经济、有效的方法。文章拟利用RT-PCR方法克隆得到大豆胞囊线虫抗性候选基因Rhg1,通过构建植物过量表达载体pCAMBIA3301/Rhg1,并采用根癌农杆菌介导的大豆子叶节方法转化大豆东农50。PCR检测草丁膦抗性植株,表明目的基因已经整合到了大豆基因组中;实时荧光定量PCR结果也进一步证实,目的基因在转基因植株中有较高水平的表达丰度。在胞囊线虫的侵蚀下,转基因植株体内的超氧化物歧化酶含量显著高于野生型植株,而丙二醛含量低于野生型植株。研究证实了Rhg1为大豆胞囊线虫的主抗基因,同时为大豆胞囊线虫的分子抗性育种提供理论基础。     

大豆RACK1基因RNAi载体构建及植株转化

[目的]筛选大豆RACK1基因的RNAi突变体,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程的调控作用提供依据.[方法]采用RT-PCR克隆大豆叶片RACK1基因核心保守序列片段,以植物表达载体pCAMBIA 1301为基本载体,构建抑制大豆RACK基因表达的RNAi载体.通过农杆菌介导转入大豆子叶节,经潮霉素筛选转基因植株,利用PCR、Southern blot及RT-qPCR进行转基因植株检测.[结果]克隆获得大豆RACK1基因核心保守序列片段432 bp;将该基因片段连接到pCAMBIA1301表达载体内含子两侧,通过酶切分析,RNAi载体构建正确.通过农杆菌介导,将该载体转入大豆中黄13号,获得23个转基因大豆株系;经PCR和Southern blot检测,确定大豆RACK1基因RNAi片段已融合到大豆基因组中.经定量RT-qPCR分析,不同转基因大豆株系RACK1基因mRNA的表达量具有明显差异,其在株系5的表达量最高,为对照的68.5%;株系7最低,降至对照的19.9%.[结论]成功构建了大豆RACK1 RNAi表达载体并导入大豆基因组中,获得23个农杆菌介导的RACK1 RNA干扰表达的大豆转基因植株,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程中的功能和作用奠定了基础.     

RNA沉默在植物与根结线虫互作基因研究中应用

基因沉默或RNA干扰（RNA interferance,RNAi）是双链RNA诱导的序列特异性基因沉默,是转录后水平上对基因的表达进行负调控。随着植物与根结线虫相互关系的研究的深入以及基因工程技术的发展,揭示了基因工程方法防治线虫危害的新途径。最近研究表明,dsRNA基因在植物体内表达,线虫取食这种转基因植物后线虫致病力下降并使植物有效抵抗多种根结线虫。这种转基因植物具有有效低抗线虫危害特性,而且其抗性是广谱的。该文对RNAi的研究历史、植物根结线虫抗性基因以及RNAi技术防治根结线虫的新途径等方面的研究进展进行了综述。     

大豆土传病害抗性资源筛选

大豆根腐病、疫霉病和胞囊线虫病是生产上极难防治的土传病害,目前有效的防治措施就是种植抗病品种,抗病种质的筛选鉴定是抗病育种的基础。本研究针对这3种病害进行抗病性鉴定,为抗病育种提供良好的单抗和多抗资源。用人工接种鉴定的方法,对76份大豆材料分别接种大豆尖孢镰刀菌、大豆疫霉菌1号生理小种和胞囊线虫3号生理小种,进行单一病害鉴定,按各病害的抗性评价标准对每份大豆种质资源进行抗性评价。共计筛选出抗根腐病材料11份,抗疫霉病材料13份,中抗大豆胞囊线虫材料9份。中抗及抗两种病害的品种(系)有6份,占鉴定总数的7.9%;同时对3种病害表现中抗以上的材料只有1份,占鉴定总数的1.3%。研究结果将为新品种培育和抗病基因挖掘提供理论依据。     

过表达酵母PAC1增强转基因大豆对大豆花叶病毒的抗性

【目的】大豆花叶病毒（soybean mosaic virus,SMV)病是中国大豆产区最主要的病害之一,严重影响大豆产量和籽粒品质。核糖核酸酶PAC1能够识别和降解植物RNA病毒或类病毒复制过程中产生的dsRNAs,从而有效抑制病毒在寄主中的复制与积累。PAC1的这一特点为广谱抗RNA病毒及类病毒转基因作物的创制和培育提供了有效的靶标基因。本研究利用转基因技术,将来源于粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)的PAC1导入栽培大豆,研究过表达PAC1对大豆SMV抗性的影响,为抗SMV转基因大豆新品种选育提供依据。【方法】采用酶切连接技术,将PAC1连接到双元表达载体pCAMBIA3300中,构建植物表达载体pCAMBIA3300-PAC1。目的基因启动子为组成型强启动子CaMV 35S,终止子为NOS,筛选标记为草铵膦抗性基因BAR。采用农杆菌介导转化法,将PAC1导入栽培大豆品种Williams82。在利用PAT/BAR试纸、PCR及除草剂（500 mg·L^-1 Basta）喷施检测基础上,通过Southern杂交技术进一步分析外源基因在转基因大豆中的整合情况和拷贝数。采用人工摩擦接种法,对T₂和T₃代转基因大豆株系进行田间抗SMV鉴定农艺性状调查,分析转基因大豆对SMV抗性及遗传稳定性。并利用qRT-PCR技术分析接种SMV 28 d后转基因大豆中SMV积累水平。【结果】共转化2 600多个外植体,获得耐草铵膦（5 mg·L^-1）大豆再生植株76株。PCR检测结果表明,其中65株能够扩增出目的条带,大豆遗传转化效率为2.48%。对T₁-T₃代转基因大豆株系喷施除草剂表明,在500 mg·L^-1 Basta处理7 d后,转基因植株表型没有明显变化,而对照（非转基因大豆）植株叶片则黄化枯死。Southern杂交结果表明,外源基因以低拷贝的方式(1-2个)整合至大豆基因组中。摩擦接种SMV SC-3鉴定表明,在接种35 d后,对照出现严重花叶、皱缩等典型SMV发病症状,而转基因大豆仅部分叶片表现出轻微的花叶症状,其病情指数降低至11.11-22.22,较对照（病情指数36.81-46.24）显著降低,且SMV抗性在转基因大豆不同代际间能够稳定遗传。qRT-PCR分析表明,在接种SMV SC-3株系28 d后,转基因大豆中SMV CP表达水平较对照极显著下降。农艺性状调查表明,在未接种SMV条件下,转基因大豆在叶形、花色、种皮色、种脐色、株高、节数、结荚高度、生育期及百粒重等方面与对照没有显著差异。【结论】PAC1过表达显著抑制了SMV的积累及症状发展,增强了转基因大豆对SMV的抗性水平。     

大豆胞囊线虫生理小种及其SSR标记研究进展

大豆胞囊线虫病（Heterodera glycines Ichinohe）是世界上大豆生产的毁灭性病害之一。胞囊线虫本身具有异质性存在生理分化,因此该病极难控制;选育抗病品种是控制该病害最有效的措施,而SSR标记是分子辅助选育抗胞囊线虫新品种选育和抗性鉴定的重要手段之一。通过概述大豆胞囊线虫各生理小种在我国的分布情况、...     

Na~+转运蛋白SKC1基因转化大豆的研究

本研究构建了水稻Na+转运蛋白SKC1基因植物表达载体pTF-SKC1,标记基因为Bar基因。以子叶节为外植体,利用农杆菌介导法将SKC1导入大豆中。经过除草剂抗性筛选后获得的再生植株经PCR方法鉴定,转基因植株阳性率为50%,初步证明SKC1基因已整合到大豆基因组中。耐盐性试验结果表明,转基因植株的耐盐性高于对照。     

大豆胞囊线虫外胞囊际真菌对线虫胞囊孵化的抑制作用

大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)病是大豆生产中的主要病害,利用真菌的某种代谢产物作为生防因子是解决大豆胞囊线虫病的一个重要的途径,为获得有效抑制胞囊病的真菌,本研究利用平板涂布的方法分离不同轮作制度下大豆胞囊线虫外胞囊际真菌,研究真菌浸出液对大豆线虫胞囊孵化的影响。结果表明,玉米—大豆—土豆轮作的大豆胞囊线虫外胞囊际真菌最多菌数达41.67株/皿;大豆—土豆—玉米为29.67株/皿;大豆重茬的胞囊际没有分离到真菌,玉米—大豆—玉米为1.67株/皿,玉米—玉米—大豆为0.33株/皿。在大豆—土豆—玉米胞囊分离的菌株中选取9株进行大豆胞囊线虫的孵化抑制试验,获得抑制率达到50%的真菌6株。     

大庆地区抗线虫大豆生产技术规程

<正>大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode,SCN)是危害大豆生产的限制性病害,大庆市风沙干旱盐碱地是世界上大豆胞囊线虫的严重发病区域。目前,防治该病最经济有效方式就是利用抗病品种~([1])。抗线虫大豆耐盐碱、优质高产、抗逆性强,对线虫病害具有较好抗性。应用抗线虫品种防治大豆胞囊线虫病和重迎茬~([2]),既可减少农药施用量,提高大豆单产,又可降低生产成本。抗线     

高产抗病大豆品种抗线虫11的选育

大豆胞囊线虫病是由大豆胞囊线虫(Soybean Cyst Nematode,简称SCN)侵染引起的,危害世界大豆生产的重要病害之一[1].我国大豆胞囊线虫病主要分布在东北和黄淮海两个大豆主产区,每年发生面积150万hm2以上.要想解决大豆胞囊线虫病问题,最经济有效的方法就是种植抗线虫病品种[2].由于抗线虫高油品种滞后于生产,因此加快抗线大豆种质资源创新及新品种选育步伐是当前黑龙江省大豆生产的迫切要求.     

吉林省大豆孢囊线虫病初步研究

对吉林省36个县(市)330块大豆地进行了抽样调查和分离鉴定,结果表明:34个县(市)有大豆孢囊线虫病发生,占调查总数的94％。该病在柳河、长岭、镇莱、白城和靖宇发生严重,扶余、吉林、舒兰、通榆、农安、榆树、德惠、磐石次之。按照Golden鉴定大豆孢囊线虫生理小种的方法,用五个国际上的标准鉴别寄主即Peking,PI88788,PI90763,Pickett和感病对照品种Lee对吉林省孢囊线虫发生较重的地块分得的线虫进行了生理小种鉴定,结果分析表明:吉林省大豆孢囊至少存在两个生理小种,即3号和7号小种,其中3号小种出现频率较高,是吉林省大豆孢囊线虫的优势小种。     

中国大豆胞囊线虫的形态学观察

从辽宁、黑龙江、山东和山西４省６个地点采集大豆胞囊线虫标本，制成雌虫、雄虫、胞囊、阴门锥和２龄幼虫的永久封片，在光学显微镜下进行了形态学的系统观察及电镜扫描，并与日本、美国的大豆胞囊线虫做了形态学比较。我国４省６个地点的大豆胞囊线虫的各个虫态的形态基本相同，与日本、美国的资料基本一致，为同一个种ＨｅｔｅｒｏｄｅｒａｇｌｙｃｉｎｅｓＩｃｈｉｎｏｈｅ．     

大豆抗胞囊线虫的分子标记研究

为了在分子水平验证大豆材料的抗病性,以对大豆胞囊线虫3号生理小种表现为抗性和感性的大豆为试材,利用已经报道的与SCN抗病基因连锁的SSR标记引物,对供试的大豆材料进行指纹图谱鉴定。结果表明:引物Satt130无扩增结果,Satt301没有多态性,Satt309和Satt082表现出多态性。聚类分析结果表明,所有供试材料被分成3大类,其中在合丰25×抗线4号正反交组合中,抗病亲本抗线4号与(抗线4号×合丰25)F2、(合丰25×抗线4号)F3抗病后代抗-221、抗-131聚为一类;感病亲本合丰25与感病材料(合丰25×抗线4号)F2感-121被聚为一类,在这个区域将感病材料分开。而其它后代材料则聚为一类,并没有将抗感材料区分开。     

几丁质酶活性与大豆对胞囊线虫抗性的关系

为了明确几丁质酶在大豆抗大豆胞囊线虫中的作用,测定了不同抗性大豆品种被大豆胞囊线虫侵染前后以及供试诱导剂诱导被大豆胞囊线虫侵染后不同抗性大豆品种根内几丁质酶活性变化。结果表明,正常生长情况下,不同抗性大豆品种根内几丁质酶活性无明显差异。接种大豆胞囊线虫后,无论是抗病品种还是感病品种几丁质酶活性均增高。经过几丁质、壳聚糖和低聚糖诱导处理大豆胞囊线虫侵染的大豆后,均能在一定程度上诱导几丁质酶活性进一步增强,并随着时间的延长,酶活性表现出一定的消长趋势;与其他两个诱导剂处理相比,几丁质诱导处理大豆后几丁质酶活性高峰提前,酶活性增加幅度大。     

大豆胞囊线虫的行为及其对环境的适应性

大豆胞囊线虫是我国大豆主产区的主要病害之一,已造成大豆产量严重损失。线虫行为学是深入研究线虫生活史和线虫与寄主植物相互关系的关键。介绍了大豆胞囊线虫的休眠、侵入、运动与迁移、取食和繁殖等方面的行为以及各种行为对环境的适应,以期从行为学和生态学角度为大豆胞囊线虫病的防治提供依据。     

大豆胞囊线虫病的发生与防治

1　发生在20 世纪 60 年代,大豆胞囊线虫病(Hetero dera glycines)主要在黑龙江省西北部松嫩平原干旱少雨地区的盐碱地、沙壤土、壤土地块发生,局部大豆田发生较重,对产量影响较大。在东北部三江平原,多雨潮湿、低洼内涝地区、白浆土地块大豆田即使发生也比较轻,而且大部分大豆     

大豆抗孢囊线虫4号生理小种新品种的选育研究

 从 1991年开始进行大豆抗孢囊线虫 (HeteroderaglycinesIchinohe)的育种研究 ,并利用一些抗源 (P14 376 5 4、灰皮支黑豆等 )进行了大量杂交工作 ,通过连续单株选拔、加大抗性好的组合群体数量、南繁北育、早代鉴定等措施 ,筛选出一些高抗、中抗的品种和品系 ,如中黄 12 (中作 5 2 39)、中黄 13(中作 975 )及中黄 17(中作 976 )等品种己正式审定推广 ,后两个品种己通过国家审定 ;有一批品系正在参加国家和省的大豆区域试验。这些品种和品系将对推动大豆生产起一定作用。     

不同植物对大豆孢囊线虫种群的影响

采用田间盆栽试验方法,研究不同作物品种对大豆孢囊线虫群体的影响,以寻找对大豆孢囊线虫具有抑制作用的作物品种。结果表明：在自然条件下少量大豆孢囊线虫会孵化为2龄幼虫,遇适宜寄主孵化率迅速提高,但非寄主植物对孢囊线虫的孵化影响不大,在处理38d后,适宜寄主根围2龄幼虫数量显著高于非寄主植物根围2龄幼虫数量。在作物生长100d后,农科六号、中黄13、黑乌豆、小粒黑豆和菜豆（改良保丰一号）处理土壤中的孢囊数量是原始孢囊数量的2.3～9.4倍,这5种植物为大豆孢囊线虫的良好寄主;但在豇豆（之豇28-2）、谷子（新吨谷1号）、大葱（中华巨葱）、番茄（精选L-402）和玉米（郑单958）等作物处理中,土壤孢囊数量仅为原始孢囊数量的58%～63%,可有效减少土壤中大豆孢囊线虫的数量。     

大豆胞囊线虫病的抗性机制研究

大豆胞囊线虫病是一种危害大豆的重要病害,引起大豆根系发育受阻和群体产量严重下降。为了进一步研究大豆胞囊线虫病的抗性机制,并对其进行有效的防治,综述了大豆胞囊线虫病的生理分化以及大豆胞囊线虫病的抗性基因和分子机制,对大豆胞囊线虫病抗性研究及品种选育进行了展望。