反向PCR克隆转基因水稻的外源基因旁侧序列

以反向PCR（IPCR）为基础建立了适合于处理大量材料的克隆转基因水稻中外源基因旁侧序称的技术体系，该方法中用小量法提取转基因水稻总DNA；总DNA用10倍过量的限制性内切酶在50μL反应体积中进行过夜酶切；酶切片段在20μL体积中进行自连接，之后进行套式PCR（nested-PCR)扩增旁侧序列。在套式PCR结合了热启动PCR和降落了PCR技术以增强PCR反应的特异性。用这种方法，本实验室在一周内克隆了35个转基因水稻株系中外源基因的旁侧序列，长度在300－750bp之，PCR产物的特异性用Southern杂交进行了证明，实验结果表明这个方法具有快速、稳定和高效的优点。     

转基因油菜W-4 T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系.为建立W-4的转基因事件特异性PCR检测技术,应用温度不对称PCR（TAIL-PCR）扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列.其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G＋C含量为31.27％、A＋T含量为68.73％;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G＋C含量为32.6％、A＋T含量为67.4％,表明该T-DNA整合在富含AT区.序列比对结果发现,该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A.而右边界则缺失了包括RBborder在内的62个碱基.结果表明：转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无载体序列的整合.依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计了2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485和405 bp的预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术.应用该检测技术可以从含有0.1％ W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达0.1％.可对W-4的转基因事件进行特异性检测.     

转基因油菜W-4T-DNA旁侧序列分析与事件特异性检测(英文)

W-4是通过农杆菌介导法将fad2基因的反向重复序列表达框转入甘蓝型油菜Westar后获得的转基因高油酸油菜品系。为建立W-4的转基因事件特异性PCR检测技术,应用温度不对称PCR(TAIL-PCR)扩增获得转基因油菜W-4的T-DNA插入位点的左、右旁侧序列。其中右边界旁侧序列长度为290 bp,其碱基组成G+C含量为31.27%、A+T含量为68.73%;左边界旁侧序列长度为365 bp,其碱基组成G+C含量为32.6%、A+T含量为67.4%,表明该T-DNA整合在富含AT区。序列比对结果发现,该转基因事件中,T-DNA左边界序列完全整合到油菜基因组中,仅有1个碱基由G转换成了A。而右边界则缺失了包括RB border在内的62个碱基。结果表明:转基因高油酸油菜T-DNA的整合是一次无载体序列的整合。依据左、右边界旁侧序列和转基因载体的T-DNA左右边界序列设计了2对特异性引物TLF/TLR和TRF/TRR,能从W-4基因组DNA中扩增出大小分别为485和405 bp的预期产物,而在其他转基因油菜、非转基因油菜的基因组DNA和空白对照中均无特异性扩增产物,据此建立了W-4的转基因事件特异性PCR检测技术。应用该检测技术可以从含有0.1%W-4基因组DNA的混合样品中扩增出特异产物,检测灵敏度达0.1%。可对W-4的转基因事件进行特异性检测。     

转基因番木瓜“华农一号”事件特异性定性PCR检测方法的建立

以我国自主研发的转基因抗环斑病毒番木瓜"华农一号"为研究对象,应用TAIL-PCR技术,用载体中靠近右边界的Nos启动子序列设计特异引物,扩增插入的旁邻序列;根据测序结果,设计了产物长度分别为753和298 bp但均跨越转化载体和番木瓜基因组序列的2套特异引物,对"华农一号"进行检测,证明其可特异地把"华农一号"从转基因番木瓜品系中检测出来;2对引物的检测灵敏度都可以达到0.05%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求;利用2对特异引物对"华农一号"的果肉、果皮、种子进行检测,可得到特异性良好的扩增.     

转基因水稻种子中外源元件的PCR检测

基因重组技术突破了传统育种所遇到的一些障碍，能够准确、快速地把目的基因导入寄主细胞中，从而赋予寄主以抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆境、延熟等优良特性，或使其营养品质得到改善。但转基因农作物潜在的风险还是一个尚待研究的领域，有关转基因植物对环境安全、生物物种安全、人类安全与健康的影响尚无定论。各国都纷纷针对转基因产品的贸易制定了相应政策，并建立了许多转基因产品的检测方法［1，2］。 水稻是一种重要的粮食作物。自1988年第一批水稻转基因植株问世以来，中国、日本、泰国、德国、菲律宾、瑞士、英国、加拿大等国家在水稻转基因研究领域取得了一系列成果，许多转基因水稻品系已进入田间试验。预计在不久的将来，转基因水稻将实现商品化［3］。因此，有必要建立快速、简便、灵敏的转基因水稻种子检测方法。     

转基因香石竹Moonlite品系特异性定性PCR检测方法的建立

以转基因香石竹品种Moonlite(月之伊人)为研究对象,通过TAIL-PCR方法,获得外源基因插入位点的左侧旁邻序列。根据旁邻序列设计引物,建立品系特异性定性PCR方法,其扩增片段覆盖了转化载体及香石竹基因组临界序列。本方法特异性好、灵敏度高,可快速、准确、高效地检测转基因香石竹Moonlite品种。     

转基因大豆、玉米和水稻外源基因检测通用标准分子的构建

将转基因大豆、玉米和水稻的主要外源Cry1A(B)基因、BAR基因、CP4-EPSPS基因、PAT 基因和内参RBCL基因目标片段分别克隆到克隆载体pMD18-T中,构建获得的质粒可作为定性检测3种转基因粮食作物的上述外源基因的通用标准分子质粒pMD18-T-PAT-CP4-EPSPS-Cry1A(B)-BAR-RBCL,长约4.7 kb.经过双酶切、测序及PCR扩增,获得与预期片断大小及序列一致的目的基因片段,证明所构建的标准分子质粒是正确的,可以用来作为不同品种转基因粮食作物定性检测CP4-EPSPS基因、Cry1A(B)基因、BAR基因和PAT基因的通用阳性标准分子.     

外源基因插入位点旁侧序列的研究方法及进展

外源基因插入位点的研究,是转基因植株分子检测的一项重要内容。本文综述了近些年用于旁侧序列测定的染色体步移技术及其发展,介绍了基于基因组文库和PCR的染色体步移技术。同时总结了基因组文库步移、反向PCR、锅饼PCR、T-linker PCR和TAIL-PCR的原理及其特点,以期在实验方法的选择上提供参考意见。     

根据标记基因快速检测转基因水稻

该研究以Bar基因和Gus基因为标记基因 ,根据Basta抗性和Gus染色 ,对转基因水稻植株进行检测 ,具有快速、简便、经济的优点     

转基因大豆OsDREB3品系特异性定性PCR检测方法的建立

为建立转基因大豆OsDREB3品系特异性定性检测方法,以转基因大豆OsDREB3为研究对象,通过染色体步行方法,成功获得转基因大豆OsDREB3上pCAMBIA1301质粒外源基因插入位点的5′端旁侧序列,其扩增片段覆盖了转化载体及转基因大豆基因组旁侧序列,扩增片段大小为344bp。同时根据旁侧序列设计引物,建立OsDREB3品系特异性定性PCR方法,以典型的转基因作物证明该方法检测转基因大豆OsDREB3具有高特异性,灵敏度为0.1%。     

水稻转基因成分快速检测方法基层应用分析

水稻转基因越来越多地被广大群众所关注,农业农村部保持遏制非法转基因的高压态势,转基因成分检测成为县区级一项常规性检测任务,如何在速测过程中确保检测结果的准确性,避免假阳性或者假阴性成为基层工作者亟待解决的问题。本文重点介绍了基层主要检测转基因成分分类、安全性、现场稳定性、灵敏度、检测原理、检测步骤及应用,以确保结果的准确性、有效性和可比较性。     

热加工过程对转基因水稻检测的影响

热加工会导致食品中DNA的降解和破坏,为研究热加工过程对转基因水稻检测的影响,试验采用水煮、高温灭活、高温烘干和微波4种外源模拟热加工的方法处理目前我国3种转基因水稻（KF6,KMD1和TT51-1）。并按照国家标准对相应的参数进行检测,内源基因SPS,CaMV35S启动子,NOS终止子和抗虫基因Bt,4种参数的PCR扩增结果显示,热加工过程无论对内源基因和外源插入基因的检测都有影响,表明现行的标准对转基因水稻加工品的检测存在局限,同时我们重新设计了针对抗虫基因Bt 的引物用于检测热加工处理的样品,扩增结果优于标准引物。     

籼、粳型转基因水稻花粉源基因飘流差异研究

[目的]在同等条件下研究比较籼、粳型转基因水稻花粉源基因飘流差异,为控制转基因水稻基因飘流提供参考.[方法]以籼型转基因水稻Bar9311和粳型转基因水稻B2为花粉供体材料,常规籼稻特籼占25和籼型不育系博A为受体材料,在自然条件下研究籼、粳型转基因水稻向不育系和常规稻的基因飘流频率.[结果]当受体为不育系时,无论花粉源是籼型还是粳型转基因水稻,在不同距离点的基因飘流频率均为粳型>籼型.10m试验区内籼型转基因水稻向不育系各点平均基因飘流频率为1.325%~23.948%,粳型为3.906%~45.934%;而当受体为常规稻时,籼型转基因水稻向常规稻各点平均基因飘流频率为0.015%~1.189%,粳型为0.041%~0.435%.此外,随着距离的变化,在6m内的基因飘流频率是粳型<籼型,之后两者出现交互现象.无论籼型还是粳型转基因水稻,向不育系基因飘流的频率远高于向常规稻的飘流频率,且基因飘流频率均随与花粉源距离的递增而递减.[结论]不同类型的花粉供体或受体,都会对基因飘流频率产生影响.     

转基因大豆MON87751品系特异性实时荧光定量PCR检测方法建立

[目的]为完善我国转基因检测方法体系,建立转基因大豆MON87751品系特异性实时荧光聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction, PCR)检测方法。[方法]根据MON87751的3′端邻接区序列设计特异性引物和探针,建立MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法,并测定该方法的灵敏度、特异性及可重复性。[结果]灵敏度测试显示,其定量下限为40拷贝;重复性试验显示其相对标准偏差在可接受范围内。[结论]该研究建立的MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性良好,灵敏度高,有良好的可重复性,适合对转基因大豆MON87751品系进行检测鉴定。     

GTS40-3-2大豆转化体特异性的定性PCR检测

为了建立转基因大豆GTS40-3-2转化体特异性定性PCR检测方法,本研究根据已公布的转基因大豆GTS40-3-2的旁侧序列信息,用Primer 5.0软件在左右边界的结合位点处设计了5对引物组合,选取扩增片段为370 bp最佳引物组合后,优化了反应体系中引物浓度和退火温度.以Lectin为内标基因,验证检测引物的特异性及灵敏度,建立了转基因大豆GTS40-3-2转化体特异性定性PCR检测方法.结果表明,该方法成本低、效率高,具有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点,已通过全国六家实验室的循环验证,能特异地检测大豆样品中GTS40-3-2转化体,最低限可达0.05％.研究表明,该方法满足我国转基因生物安全管理过程中对GTS40-3-2大豆的检测需求,具有良好的应用前景.     

用叶片检测转基因水稻对潮霉素反应的可靠性研究

水稻的转基因研究一般以潮霉素磷酸转移酶(HyglomychlPhosphtobamfemse,6P6)基因HPT作为选择标记,因此潮霉素抗性检测的可靠性至关重要.该项研究以中花11和日本晴的T1,T2和T6代转基因水稻为材料,研究了苗期、减数分裂的完全伸展叶和乳熟期不同部位的叶片对潮霉素的抗性反应,同步提取相应叶片的DNA进行HPT基因的PCR扩增,两者符合率达到97.04%.结果表明,利用叶片对潮霉素的反应检测转基因水稻的方法适用于不同世代、不同生育期和不同部位的叶片,具有很高的可行性和可靠性.     

转基因水稻外源基因的遗传和表达初步研究

将天蚕抗菌肽B基因应用基因枪法导入水稻TN1发芽肿胚，获得转基因植株2株，转基因水稻T1－T5 5个世代不同株系，对bar基因、抗菌肽基因的遗传和表达进行初步研究。结果表明：转基因后代株系bar^R:bar^S在部分符合3：1分离比率。T1、T4转基因株系PCR、Southern印迹分析表明，T18株有抗菌肽B基因；T4仍有4个株系有抗菌肽基因，其他的株系基因丢失，T3 1个株系Northern印迹证明抗菌肽基因在RNA水平有表达；抗菌肽B转基因水委对白叶枯病的抗病性有提高，抗性能传递到高世代，在T3得到抗病性提高的株系。     

转基因水稻多重PCR和Real-time PCR定性检测中的问题与策略

随着转基因水稻研究在世界范围内的研究和开发,以及转基因水稻商业化的争议性加剧,相关部门对粮食安全、食品安全更加关注,农业科研单位检测转基因水稻也将具有重要意义。参照农业部的质检标准书和转基因PCR检测中的实践经验,对抗虫转基因水稻在转基因检测中可能出现的问题进行了技术层面和理论层面分析;同时对转基因抗虫水稻的启动子、终止子、内参基因、靶基因等几个元件的检测分别进行探讨,并重点分析了启动子和终止子的检测工作,根据研究者的工作经验报道,从植物病毒学原理和植物基因工程的理论角度,提出了对转基因PCR定性检测中可能遇到问题的解决方案。