鸡CD40L基因的原核表达及多克隆抗体的制备

为了研究鸡CD40L作为分子免疫佐剂的免疫原性,试验采用鸡的脾脏细胞克隆鸡CD40L基因,构建表达载体pET28a-cCD40L进行原核表达,以纯化的重组蛋白免疫长耳白兔,获得兔抗鸡CD40L多克隆抗体,用间接ELISA检测多克隆抗体效价,并进行Western-blot检测。结果表明:获得分子质量为26 ku的重组融合蛋白,多克隆抗体效价为1∶12 800;表达的融合蛋白不仅能与鼠抗His克隆抗体发生特异性反应,而且与获得的兔抗鸡CD40L多克隆抗体发生特异性反应。说明鸡CD40L融合蛋白具有较高的反应活性,所获得的兔抗鸡CD40L多克隆抗体具有良好的特异性。     

高致病性禽腺病毒血清4型Hexon蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】原核表达禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)Hexon蛋白,并制备兔抗Hexon多克隆抗体,为FAdV-4 Hexon功能研究提供材料。【方法】采用基于PCR的长DNA序列准确合成(PCR-based accurate synthesis, PSA)方法,设计全长拼接引物,在引物两端各设计保护性碱基合成FAdV-4 Hexon基因;利用同源重组技术将其连接至pCzn1-Hexon表达载体,获得pCzn1-Hexon重组质粒进行原核表达,采用纯化重组蛋白免疫新西兰白兔制备兔抗Hexon蛋白的多克隆抗体。以间接ELISA方法测定多克隆抗体效价;通过Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】重组原核表达质粒pCzn1-Hexon经双酶切及测序鉴定证明构建正确;获得的重组蛋白以包涵体的形式表达,分子质量约为41 ku;用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔后,通过间接ELISA方法检测抗体效价高达1∶512 000。以制备的多克隆抗体为一抗,通过Western blotting和IFA检测到鸡肝...     

牛病毒性腹泻病毒E0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV) E0蛋白,纯化后免疫小鼠制备E0蛋白多克隆抗体用于BVDV的检测技术研究。【方法】采用PCR扩增BVDV的E0基因,将其连接至pET-28a (+)构建重组表达载体pET28a-E0。将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导、亲和层析纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定E0蛋白的表达情况。将纯化的E0蛋白免疫小鼠制备BVDV E0多克隆抗体,并通过Western blotting、细胞免疫荧光试验、ELISA等试验检测该多克隆抗体的特异性和效价,以及在BVDV检测中的应用。【结果】成功构建原核表达载体pET28a-E0,表达并纯化E0蛋白,制备的BVDV E0多克隆抗体可特异性识别纯化的E0蛋白及pET28a-E0在BL21中表达的总蛋白。进一步Western blotting、细胞免疫荧光试验、双抗夹心法ELISA证明制备的E0多克隆抗体可用于BVDV的检测。间接ELISA结果表明,E0多克隆抗体效价高于1∶64 000。【结论】制备的BVDV E0多克隆抗体效价高、抗原结合特异性强,为BVDV E0蛋白的生物学功能研究及BVDV的检测提供了材料支持。     

牛副流感病毒3型HNex蛋白表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在获得牛副流感病毒3型(BPIV3)的HNex蛋白及其多克隆抗体。以提取的BPIV3细胞毒的RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增包含血凝素神经氨酸酶(HN)的基因片段,然后以此为模板扩增编码HN蛋白膜外区片段(HNex基因),并进行氨基酸序列测定。将HNex基因插入克隆载体pEASY-Blunt Simple中,经双酶切连接至pET-30a(+)表达载体中,构建重组原核表达载体pET-30a-BPIV3-HNex,转化大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS感受态细胞,IPTG诱导后,用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。经亲和层析方法纯化的HNex蛋白作为免疫原,制备兔抗BPIV3-HNex多克隆抗体。结果显示,本研究成功克隆BPIV3 HNex基因。原核表达蛋白结果表明,53 ku处有特异条带出现,并且可以与鼠抗His发生特异性免疫反应。免疫兔的血清中BPIV3 HNex抗体效价为1∶819200。Western blotting结果表明,制备的兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体能与BPIV3蛋白发生特异性反应。总之,本研究利用原核表达系统表达BPIV3 HNex蛋白,并获得兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体,为进一步探索BPIV3 HN蛋白的功能及亚单位疫苗研制提供参考。     

蛋鸡TRPV6基因的原核表达、纯化及抗体制备

为制备蛋鸡TRPV6蛋白多克隆抗体,根据其基因序列,设计1对特异性引物,以卵巢组织中提取的总RNA为模板,扩增蛋鸡TRPV6基因1 801～2 176nt的375bp序列,构建原核表达质粒pET-32a（＋）-TRPV6;将重组质粒转化BL21（DE3）,经IPTG诱导表达TRPV6融合蛋白,通过镍离子螯合柱纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗鸡TRPV6多克隆抗体,分别通过酶联免疫吸附试验（ELISA）法和Western blot检测抗体的效价和抗体特异性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a（＋）-TRPV6,SDS-PAGE蛋白电泳检测发现目的蛋白大小约35 000;Western blot分析显示,表达的TRPV6融合蛋白具有良好的免疫原性,其抗体可与大肠杆菌表达的产物特异性结合;ELISA显示其抗体效价达1∶100 000。获得纯化的融合蛋白和多克隆抗体对研究TRPV6钙离子通道在蛋鸡髓质骨形成的作用机理具有重要作用。     

非洲猪瘟病毒Georgia 2007/1株CD2v蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

本研究旨在通过原核表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)Georgia 2007/1株EP402R基因,获得其编码的CD2v重组蛋白,并针对纯化的CD2v重组蛋白制备多克隆抗体。将ASFV EP402R全长基因进行密码子优化后连入pET-28a(+)表达载体,构建原核重组表达质粒,经1 mmol/L IPTG于16℃诱导12 h后,利用SDS-PAGE和Western blotting对重组蛋白进行表达鉴定和反应原性分析。以纯化的CD2v重组蛋白为免疫原制备鼠源抗CD2v多克隆抗体,随后以间接ELISA方法、间接免疫荧光试验及Western blotting分别检测多克隆抗体的效价和特异性。结果显示,ASFV EP402R基因克隆至pET-28a(+)获得pET-28a-EP402R重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后经诱导表达获得CD2v重组蛋白,其大小约为47 ku,重组蛋白主要以包涵体形式存在,部分也可以融合表达蛋白形式存在。Western blotting结果显示,其可溶性上清经镍柱纯化后能被ASFV阳性血清识别,具有良好的反应原性。间接ELISA检测该多克隆抗体效价可达1∶512 000,间接免疫荧光试验和Western blotting表明该多克隆抗体可特异性识别真核表达的CD2v蛋白。以上结果表明,通过原核表达的ASFV CD2v重组蛋白具有较好的免疫原性,利用重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV EP402R生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。     

猪膜联蛋白A2多克隆抗体的制备、亲和纯化与鉴定

本研究旨在制备并亲和纯化兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。通过PCR从质粒pA2-EGFP中将编码猪膜联蛋白A2与增强型绿色荧光蛋白融合基因(Annex A2-EGFP)亚克隆到pET-30a(+),构建了原核表达质粒p30a/AE,转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导以包涵体形式表达了猪ANNXA2-EGFP融合蛋白,用Ni-Resin HP树脂对表达的目的蛋白进行亲和纯化。用纯化的ANNXA2-EGFP融合蛋白免疫兔,制备兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体。将以前纯化的猪可溶性GST-ANNXA2融合蛋白偶联NHS活化琼脂糖凝胶FF,亲和纯化多克隆抗体。用GST-ANNXA2亲和纯化的多抗效价达到1∶12800,Western blot和免疫组化结果证实具有高特异性。制备的高效价和高特异性兔抗猪膜联蛋白A2多克隆抗体,为进一步研究膜联蛋白A2在病毒感染中的作用奠定了基础。     

牛副流感病毒3型HNex蛋白表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在获得牛副流感病毒3型（BPIV3）的HNex蛋白及其多克隆抗体。以提取的BPIV3细胞毒的RNA为模板，利用RT-PCR方法扩增包含血凝素神经氨酸酶（HN）的基因片段，然后以此为模板扩增编码HN蛋白膜外区片段（HNex基因），并进行氨基酸序列测定。将HNex基因插入克隆载体pEASY-Blunt Simple中，经双酶切连接至pET-30a（+）表达载体中，构建重组原核表达载体pET-30a-BPIV3-HNex，转化大肠杆菌Rosetta^TM（DE3）pLysS感受态细胞，IPTG诱导后，用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。经亲和层析方法纯化的HNex蛋白作为免疫原，制备兔抗BPIV3-HNex多克隆抗体。结果显示，本研究成功克隆BPIV3 HNex基因。原核表达蛋白结果表明，53 ku处有特异条带出现，并且可以与鼠抗His发生特异性免疫反应。免疫兔的血清中BPIV3 HNex抗体效价为1：819 200。Western blotting结果表明，制备的兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体能与BPIV3蛋白发生特异性反应。总之，本研究利用原核表达系统表达BPIV3 HNex蛋白，并获得兔抗BPIV3 HNex多克隆抗体，为进一步探索BPIV3 HN蛋白的功能及亚单位疫苗研制提供参考。     

鸭干扰素刺激基因的克隆、表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆、表达鸭干扰素刺激基因（interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 5,IFIT5）并制备其多克隆抗体。根据GenBank公布的绿头鸭IFIT5（登录号：KF956064）序列设计特异性引物,PCR扩增获得鸭IFIT5基因,并构建原核表达重组质粒pET-30a-IFIT5和pET-32a-IFIT5及真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5。原核表达获得鸭IFIT5重组蛋白后,进行SDS-PAGE分析,并利用镍柱亲和层析方法对重组蛋白进行纯化。以纯化的鸭IFIT5重组蛋白为免疫原制备兔抗鸭IFIT5多克隆抗体。利用间接ELISA测定多克隆抗体效价、用Western blotting鉴定其特异性;将真核表达重组质粒pcDNA3.1-IFIT5转化BHK21细胞,通过间接免疫荧光法鉴定多克隆抗体的反应性。结果表明：目的蛋白主要以包涵体的形式存在;制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体效价达1：49 600,可特异性识别鸭IFIT5重组蛋白,间接免疫荧光试验则表明纯化的多克隆抗体可特异性识别BHK21瞬时真核表达的鸭IFIT5蛋白。综上,成功克隆了鸭干扰素刺激基因IFIT5,制备的兔抗鸭IFIT5多克隆抗体可用于鸭IFIT5蛋白的检测,可为鸭IFIT5蛋白的后续研究提供材料支撑。     

抗羊口疮病毒蛋白ORFV086多克隆抗体的制备及其应用

本试验旨在克隆表达羊口疮病毒(ORFV)蛋白ORFV086,制备兔抗ORFV086蛋白多克隆抗体并检测ORFV086蛋白的表达。以ORFV基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增ORFV086的基因片段,将其克隆入原核表达载体pET-33b(+)。将构建的pET33b-086重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3) pLys 感受态细胞,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,以纯化蛋白作为免疫原,免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。应用ELISA和Western blotting方法对所得抗体进行检测。结果显示,重组蛋白pET33b-086主要以包涵体形式存在,分子质量约为100 ku;目的蛋白经切胶纯化回收后作为免疫原制备的多克隆抗体效价达1:128000;纯化的多克隆抗体可用于检测重组及天然ORFV086蛋白,特异性好。本试验制备了ORFV086多克隆抗体,为深入研究ORFV086蛋白在羊口疮病毒感染过程中的作用奠定了基础。     

扩展莫尼茨绦虫vasa基因的原核表达及多克隆抗体的制备

试验旨在表达、纯化扩展莫尼茨绦虫VASA蛋白,并制备兔抗VASA多克隆抗体。根据扩展莫尼茨绦虫全基因核苷酸序列设计特异性引物,利用PCR方法扩增vasa基因片段;将扩增产物与原核表达载体pET-22b(+)连接,获得重组质粒pET-22b-VASA;经Amp抗性筛选阳性菌,双酶切、PCR测序鉴定后,将其转化大肠杆菌(DE3)感受态细胞中,并进行IPTG诱导表达;重组融合蛋白经镍柱纯化后,进行Western blot鉴定;将融合蛋白免疫兔,制备多克隆抗体。结果显示,重组质粒pET-22b-VASA构建正确,通过IPTG诱导获得大小约32 200的VASA重组融合蛋白;Western blot分析表明其与鼠抗His单克隆抗体呈阳性反应。纯化的VASA蛋白免疫兔获得了多克隆抗体,ELISA检测其效价为1∶128 000。本试验成功制备了具有免疫原性的VASA蛋白及其兔源多克隆抗体,为VASA蛋白生物学功能及该蛋白在绦虫体内的分布等研究奠定基础。     

基因Ⅱ型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

旨在利用原核表达系统表达基因Ⅱ型鹅星状病毒(goose astrovirus, GoAstV)ORF2蛋白,制备兔源多克隆抗体,并对制备的多抗进行效价检测及鉴定。根据GoAstV-GDZJ37株ORF2基因序列设计特异性表达引物,利用RT-PCR方法进行目的基因扩增,将其连接至原核表达载体pET-32a(+);经酶切鉴定和测序正确后,转化至表达感受态细胞,并进行诱导表达及SDS-PAGE分析。以无His标签的ORF2蛋白作为免疫原免疫新西兰大白兔,制备兔源多克隆抗体。将含His标签的ORF2蛋白经Ni-NTA亲和层析法进行纯化,并以纯化后的蛋白作为检测原,通过I-ELISA方法检测兔源多克隆抗体的效价,并通过Western blot及IFA检测方法鉴定其特异性。结果显示,克隆获得GoAstV-GDZJ37株ORF2基因,并利用原核表达系统分别表达2种重组蛋白,大小分别为77、95 kDa,且均为不可溶性表达。I-ELISA结果显示,多克隆抗体的效价为1∶102 400,表明无His标签的ORF2蛋白具有良好的免疫原性;Western blot及IFA结果显示,多克隆抗体可与含His标签...     

绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。【方法】采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。【结果】试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10...     

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

[目的] 利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒（Goose astrovirus 1,GAstV-1）结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。[方法] 根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）,构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。[结果] 酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1：128 000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。[结论] 原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。     

新型鸭呼肠孤病毒DH13株σC蛋白的原核表达及其多克隆抗体制备

试验旨在建立新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）σC蛋白的原核表达系统,制备σC蛋白的多克隆抗体,并评估所制备抗体的效价。通过RT-PCR方法扩增获得NDRV DH13株σC基因,连接至pET-30a（+）及pET-32a（+）载体中,构建原核表达质粒,并将其转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导获得两种σC重组蛋白,经SDS-PAGE分析蛋白表达形式。利用切胶方法纯化不含His标签σC重组蛋白,利用Ni-NTA柱纯化含His标签σC重组蛋白。以纯化的无His标签蛋白为免疫原免疫兔子获得兔抗σC多克隆抗体,Western blotting分别使用抗His标签的单克隆抗体和NDRV-σC蛋白阳性血清两种一抗评估抗体的特异性,间接ELISA（iELISA）检测抗体滴度。SDS-PAGE结果显示获得34和37 ku两种重组蛋白,且均得到高效表达。Western blotting结果显示制备的多克隆抗体具有良好的特异性,所制备的抗体与σC蛋白亲和力较好。间接ELISA检测结果显示其效价达1：25 600。本试验成功构建σC蛋白的原核表达系统,制备的σC蛋白多克隆抗体为深入研究σC蛋白的生物学功能及开展NDRV基因工程疫苗的研发奠定了基础。     

双峰驼TLR2多克隆抗体的制备及其在免疫组化检测中的应用

为了制备兔抗双峰驼Toll样受体2(TLR2)的多克隆抗体并鉴定其活性,试验选择双峰驼TLR2基因序列,选取编码区,经软件分析预测该区域编码蛋白的主要氨基酸抗原位,选择对应的核苷酸序列进行基因合成,构建双峰驼TLR2重组质粒(pET28a-TLR2);通过原核表达系统诱导pET28a-TLR2表达,并优化异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)表达条件;表达的蛋白溶解变性后,与Ni-NTA镍柱填料结合,经亲和层析法纯化,用纯化后的蛋白免疫新西兰白兔并制备多克隆抗体;利用SDS-PAGE鉴定蛋白表达和纯化情况,间接ELISA试验、Western blot检测及免疫组化验证并评价多克隆抗体的效价与反应性。结果表明：成功表达双峰驼TLR2重组蛋白,大小约为64 kDa,最佳诱导表达条件：IPTG浓度为0.4 mol/L、诱导时间为5 h,蛋白质以包涵体的形式表达;抗体效价为1∶256 000,能特异性识别目的蛋白;在双峰驼十二指肠肠系膜淋巴结和脾脏中,抗体能特异性识别双峰驼TLR2阳性细胞,细胞类型以单核/巨噬细胞为主,具有良好的特异反应性。说明成功制备的兔抗双峰驼TLR2多克隆抗体具有良好...     

猪唾液酸黏附素氨基端结构域基因的克隆表达及其多克隆抗体制备

本试验旨在克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因,进而构建原核表达载体并诱导表达重组蛋白,以制备多克隆抗体。试验中应用RT-PCR技术从健康仔猪肺巨噬细胞中克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域的cDNA序列,并将其亚克隆到原核表达载体pET-32a中,构建重组表达质粒pET-Sn150,成功表达了分子质量大小约为43.1 ku的γ亚单位重组蛋白。将重组蛋白pET-Sn150免疫小鼠,制备获得鼠抗pET-Sn150重组蛋白多克隆抗体,将得到的重组蛋白多克隆抗体采用间接 ELISA 和Western blotting试验方法检测,ELISA测定多克隆抗体的血清效价为1∶12800;Western blotting试验结果证明,制备的鼠抗pET-Sn150多克隆抗体可以与重组蛋白进行特异性结合,从而证明重组蛋白具有较好的免疫原性。本试验克隆出猪唾液酸黏附素的近氨基端结构域基因并成功表达,为进一步研究其结构与功能奠定了基础。     

牛偏爱密码子优化后的Beta蛋白多克隆抗体制备

本研究旨在优化λ噬菌体bet基因,使其能够在牛细胞中高效表达,通过密码子优化及全基因合成方法制备牛bet基因,并进行原核表达和多克隆抗体制备及抗体效价评估。从GenBank中获得λ噬菌体bet基因的序列,登录号为AP005153,用牛偏爱密码子对其进行优化并将其合成。根据优化后的基因序列设计引物,用PCR扩增优化后的bet基因,随后将其克隆到pET28原核表达载体,并转化入大肠杆菌BL21中进行诱导表达。表达的蛋白产物利用亲和层析的方法进行纯化,用His tag的抗体进行Western blot鉴定。用纯化后的蛋白免疫CD1小鼠,得到抗Beta蛋白的血清,通过ELISA测定该多克隆抗体的滴度。结果表明:通过双酶切和测序,成功挑选出正确的原核表达质粒pET-bet;SDS-PAGE,电泳结果显示融合蛋白表达成功;用纯化后的蛋白免疫试验鼠后得到多克隆抗体,经Western blot检测,该多克隆抗体能与His-Beta融合蛋白特异性结合;经ELISA方法检测该多克隆抗体的滴度为1∶41 700。成功地制备了Beta蛋白的多克隆抗体,为深入探索bet基因的生物学功能和在牛及大型哺乳动物中的应用奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒B438L蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

本研究旨在通过构建非洲猪瘟病毒（ASFV）B438L基因原核表达系统表达p49重组蛋白,并制备抗p49蛋白的多克隆抗体。根据ASFV Georgia 2007/1（GenBank登录号：FR682468.1）公布的基因序列合成B438L基因,并将其插入pET-28a （+）载体,构建pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16 ℃经1 mmol/L IPTG诱导12 h,通过SDS-PAGE对重组蛋白表达形式进行分析;利用串联质谱技术鉴定重组蛋白是否正确表达;将纯化的p49重组蛋白免疫小鼠制备鼠源抗p49多克隆抗体,利用间接ELISA方法测定该多克隆抗体的效价,并以间接免疫荧光试验及Western blotting检测该多克隆抗体的特异性。结果显示,试验成功构建了pET-28a-B438L重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经诱导表达获得了p49重组蛋白,重组蛋白主要以包涵体形式表达,大小约为60 ku;串联质谱技术进一步证实该蛋白为p49。间接ELISA检测制备的鼠源抗p49多克隆抗体效价达1：64 000,间接免疫荧光试验及Western blotting结果表明制备的鼠源抗p49多克隆抗体能特异性识别p49蛋白。以上结果表明,该原核表达的ASFV p49重组蛋白具有良好的免疫原性,利用表达的p49重组蛋白制备的多克隆抗体具有较高的抗体效价和特异性,为进一步研究ASFV p49蛋白的结构与功能、研制相关的ASFV诊断试剂及疫苗提供了生物材料。     

人MxA基因的原核表达及其抗血清的制备

本试验旨在利用大肠杆菌BL21(DE3)表达MxA融合蛋白pET32a(+)-MxA,制备兔抗人MxA抗血清。采用PCR技术获得MxA基因,然后将MxA基因重组到pET32a(+)载体中,筛选阳性克隆,转化大肠杆菌,IPTG诱导表达,用超声波裂解重组菌BL21(DE3)培养物,纯化蛋白质后免疫新西兰兔制备抗血清。SDS-PAGE分析结果显示,pET32a(+)-MxA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中以包涵体形式高效表达;获得的抗血清经间接ELISA法检测效价为1∶6400;Western blotting检测结果显示,抗血清可与真核表达的MxA蛋白进行特异性结合。试验结果表明,在大肠杆菌中成功表达了pET32a(+)-MxA融合蛋白,制备了具有高度特异性的兔抗人MxA抗血清,这样为采用酶标法测定病毒患者全血细胞或由干扰素诱导的细胞产生的MxA蛋白质含量及临床诊断试剂盒的开发和应用打下了基础。