犬瘟热病毒R／20-8株核衣壳蛋白基因的克隆和表达

应用RT-PCR技术扩增出犬瘟热病毒（CDV）核衣壳（N）蛋白基因的高度保守序列，将其克隆至质粒pMD18-T中，获得了重组质粒pMD18-T-N。将N基因的目的片段克隆到表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游，并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21株，经IPTG诱导，N基因融合蛋白获得了高效表达。SDS-PAGE电泳和Western—blot分析结果显示，表达产物的分子质量为55ku，与CDV标准阳性血清呈阳性反应。表明，大肠杆菌表达的CDVN蛋白在免疫原性上与天然N蛋白具有一定的相似性，可作为诊断用抗原。     

犬瘟热病毒截短P蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备针对犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)P1蛋白的单克隆抗体(McAb),本研究利用重组犬瘟热病毒P1蛋白免疫BALB/c小鼠,并将其脾淋巴细胞与SP2/0进行融合,用CDV包被ELISA板,通过间接ELISA法筛选出两株稳定分泌抗CDV-P1的杂交瘤细胞株(E9E4C10、E9F8D9)。间接ELISA检测腹水效价均为1∶10⁶,亚类鉴定结果均为IgG2b。Western blotting和间接免疫荧光(IFA)分析结果表明,两株单克隆抗体均能与重组P1蛋白和CDV发生反应;ELISA叠加试验增殖结果表明,两株单克隆抗体识别的抗原表位不同。本研究制备的特异性抗CDV-P1的单克隆抗体为建立CDV免疫学检测方法和P蛋白的功能研究奠定了基础。     

抗犬瘟热病毒血凝素蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为制备抗犬瘟热病毒(CDV)血凝素蛋白的单克隆抗体,以CDV弱毒株Onderstepoort免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合制备杂交瘤细胞。用昆虫杆状病毒表达系统表达的血凝素蛋白作为ELISA包被抗原,进行杂交瘤细胞筛选,获得3株阳性杂交瘤细胞株,分别命名3A8、3E4和1C7。经鉴定,抗体均为IgG1亚型,轻链为kappa链。杂交瘤细胞培养上清中抗体效价为1∶64~1∶256,腹水中抗体效价为1∶10~5~1∶10~7,病毒中和试验表明,3E4对CDV具有中和活性,腹水中抗体中和效价为1∶512。制备的单克隆抗体为CDV感染动物的治疗和基因工程抗体的开发奠定了基础。     

1株抗欧洲型和美洲型PRRSV核衣壳蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

利用RT-PCR方法扩增出欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)SS-6毒株的核衣壳(N)蛋白基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1上,构建了重组表达质粒pGEX-N,并将其转化到大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的诱导下获得高效表达,重组蛋白的分子量约为40 ku。用纯化的重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV N蛋白的单克隆抗体。经细胞融合获得一株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,命名为1 B6,将其连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。亚型鉴定结果为IgG1型,其轻链为κ链;间接免疫荧光试验和免疫印迹试验均证明,1B6单抗既能与欧洲型PRRSV反应,也能与美洲型PRRSV反应;ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1:640,腹水的效价为1:256 000,为猪繁殖与呼吸综合征的诊断奠定了基础。     

犬瘟热病毒单克隆抗体的制备及鉴定

将纯化的犬瘟热病毒(CDV)分别与弗氏完全佐荆(CFA)和弗氏不完全佐剂(IFA)乳化制备的乳化抗原作为免疫原,以有限稀释法和间接ELISA法进行单克隆抗体的筛选,从而获得了3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株2F7、3G2、5E3.亚型鉴定结果显示,2F7为IgG2a型,3G2为IgGl,5E3为IgGM.用2F7制...     

抗马动脉炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备

为制备抗马动脉炎病毒(EAV)衣壳蛋白(N)的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达重组N蛋白,纯化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,细胞融合后经间接ELISA筛选获得两株能够稳定分泌抗EAV N蛋白的杂交瘤细胞株,MAbs亚型鉴定为IgG1,轻链为κ链。Western blot结果显示,这两株杂交瘤细胞分泌的MAb均能够识别EAV。EAV N蛋白MAb的制备,为EAV血清学检测方法的建立奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白单克隆抗体的制备

本研究是利用我国PRRS病毒分离株CH-1a株浓缩的病毒抗原免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,同时以PRRS病毒作为抗原进行间接ELISA检测,共筛选到22个阳性细胞株.分别经过3轮单克隆后,最终得到了16株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株.利用IDEXX-ELISA检测试剂盒和IFA试验对16株单克隆抗体进行鉴定,结果证实所获得的16株细胞分泌的抗体都是针对PRRSV的特异性抗体.将此16株单克隆抗体分别与用原核系统表达的PRRSV N蛋白、rtM和rtGP5蛋白进行特异性ELISA检测试验,结果表明16株单克隆抗体都仅识别表达的N蛋白,而与其它两种蛋白不发生反应,说明所获得的16株单克隆抗体均为抗PRRSV核衣壳蛋白的.单克隆抗体亚型鉴定试剂盒的鉴定结果显示,除01MAb为IgG2b、N1H11为IgG2a外,其余的单克隆抗体均为IgG1,而且所有单克隆抗体的轻链均为к链.至此证实我们获得了16株PRRV N蛋白单克隆抗体,这将为今后建立更为灵敏的检测PRRS病原的特异性诊断方法、分析PRRSV核衣壳蛋白的功能及鉴定B细胞抗原表位奠定重要基础.     

犬瘟热病毒单克隆抗体的制备和鉴定

将从水貂中分离的犬瘟热病毒(CDV) HB株,以培养纯化的犬瘟热病毒HB株免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,通过ELISA筛选,获得3株能稳定分泌抗犬瘟热病毒结构蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株.3株单克隆抗体菌属于IgG1亚类,其腹水效价可达到1∶51 200和1:204 800,细胞培养上清液效价可达到1:256和1:512.ELISA分析表明,单抗仅与CDV发生特异性反应,而与犬细小病毒(CPV)和犬腺毒(CAV)没有交叉反应;荧光免疫染色检测进一步表明单克隆抗体的特异性好.该特异性单抗的制备为建立有效检测犬瘟热病毒感染的方法奠定基础.     

抗猪繁殖与呼吸系统综合征病毒重组N蛋白单克隆抗体的制备

为了研究制备抗猪繁殖和呼吸系统综合征病毒重组核衣壳蛋白(N蛋白)单克隆抗体,试验用N蛋白免疫Balb/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选等技术制备单克隆抗体。结果表明:所制备的单克隆抗体3B5为IgG2a亚类,杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水单克隆抗体的ELISA效价分别为1∶800和1∶32 000,连续培养20代后能稳定分泌抗体。     

用RT—PCR检测犬外周血液单核细胞中犬瘟热病毒核衣壳蛋…

为了迅捷地诊断犬瘟热病毒（ＣＤＶ）感染，本研究采用及转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术，检测犬外周血液核细胞（ＰＢＭＣ）中ＣＤＶ核衣壳蛋白（ＮＰ）基因。以两套引物针对ＣＤＶＯｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ毒株ＮＰ基因的两个片段。应用ＲＴ－ＰＣＲ〉以６株ＣＤＶ毒株感染Ｖｅｒｏ细胞，用ＣＤＶ人工感犬染的的ＰＢＭＣ，在这两处细胞的提的ＲＮＡ中，手增ＮＰ基因片段，取得了较好的结果。在３２例临床疑为ＣＤＶ感染     

犬瘟热病毒重组核蛋白间接ELISA方法的建立

将已构建成功的重组质粒pGEX-4T-1-N转化大肠杆菌BL21株,在最佳诱导条件下获得犬瘟热病毒(CDV)重组N蛋白。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE和W estern-b lot分析,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。本研究初步建立了以纯化的N蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,经初步试验证实,该方法敏感、特异。试验结果表明,大肠杆菌中表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然核衣壳蛋白具有较高相似性,可作为诊断用抗原。     

尼帕病毒和亨得拉病毒核蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

尼帕病毒（Nipahvirus，NiV）和亨得拉病毒（Hendravirus，HeV）是近年来出现的2种新的高致病性副粘病毒，在我国尚未发现。为防范2种病毒在我国的出现，本研究开展了前瞻性工作，成功研制了针对2种病毒核蛋白（N）的单克隆抗体，可用于病毒监测与诊断。首先利用大肠杆菌表达的2种病毒N蛋白免疫BALB／c小鼠，细胞融合后应用间接免疫荧光的方法对杂交瘤细胞克隆进行筛选，获得了5株N蛋白特异单抗。单抗腹水的抗体效价均超过2×10^5，培养上清抗体效价1：64～1：256。Western—blot和间接免疫荧光试验证明，5株单抗均特异针对N蛋白，其中1株（H4D11）只与HeVN蛋白反应，而不与NiVN蛋白反应，表明它具有鉴别2种病毒的能力。所研制的单抗对建立2种病毒的检测技术，用于动物监测，以防范2种新发传染病在我国流行具有重要意义。     

犬瘟热重组N蛋白抗原间接ELISA方法的建立及应用

本研究以纯化的犬瘟热病毒（CDV）重组N蛋白为诊断抗原,建立了犬瘟热病毒抗体检测的间接ELISA诊断方法,将其命名为rN-CDVELISA。确定最佳抗原包被量为0．167μg/孔,待检血清最佳稀释倍数为1：100,其作用时间为45min,羊抗犬酶标抗体稀释倍数为1：2000,作用时间为60min,S／P值≥0．208者判为阳性,S／P值≤0．16者判为阴性,介于两者之间者判为可疑。该抗原不与犬细小病毒、犬传染性肝炎、犬副粘病毒、犬波特氏杆菌等4种疾病的阳性血清反应,具有良好的特异性;批内、批间重复试验,变异系数均小于15％,具有良好的重复性;检测血清样品96份,与进口诊断试剂盒的符合率为97．1％。本研究为现地免疫犬群抗体检测和进行CDV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法。     

犬瘟热病毒A株核衣壳蛋白基因的克隆、表达及特性分析

根据GenBank中A75／14株犬瘟热病毒（CDV）核衣壳蛋白（N）基因的核苷酸序列设计合成一对引物，经RT-PCRgA病毒总RNA中扩增出1600bp的N基因，将其克隆于pMD18-T载体对其进行序列分析。结果表明A株CDV与其它毒株N基因序列的同源性较高。将N基因定向克隆于原核表达栽体pPROEXX^TM HT，用重组质粒pPROEX^TM HT-N转化感受态E．coli DH5a细胞，用IPTG于37℃诱导表达了分子量约63Ku的重组N蛋白，占菌体总蛋白18％。经Western blot分析证实所表达的重组N蛋白具反应活性，将表达产物用ProBond^TM纯化试剂盒进行了纯化。用所获得的重组蛋白免疫家兔制备的多克隆抗体可与CDV全病毒发生特异性反应，经琼扩试验测定其效价为1：16。本实验为下一步用重组N蛋白作为诊断用抗原，建立特异的CDV抗体检测方法奠定了基础。     

犬瘟热病毒单克隆抗体夹心ELISA检测方法的建立

为建立方便快捷的犬瘟热病毒(CDV)检测方法,本实验应用杂交瘤细胞融合技术,建立了4株分泌抗CDV单克隆抗体(MAb)的杂交瘤细胞株,分别命名为A2、F7、H4和G12.相加ELISA试验显示4株MAb作用于CDV不同的抗原表位.选取相加指数较高的两株MAb G12和A2分别作为捕获抗体和酶标检测抗体,建立检测CDV的夹心ELISA检测方法,并对实验条件进行了优化.结果显示,该方法与犬细小病毒、犬副流感病毒、犬腺病毒1型、犬冠状病毒等犬类病毒无交叉反应,敏感度为5 μg/mL,变异系数小于6％.利用该方法与RT-PCR方法同时检测57份临床样品,两种方法的符合率为100％.本实验建立的MAb夹心ELISA方法具有特异、敏感、方便快捷等优点,适用于大批量临床样品检测.     

非典型犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因序列分析及其在大肠杆菌中的表达

为分析当地非典型犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性,根据已发表CDV的N基因序列设计引物,用RT-PCR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因,进行克隆和序列分析,结果表明:该非典型CDV的N基因与已发表的12个CDV强毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在96.6%～99.2%和97.9%～99.4%之间,与已发表的4个CDV疫苗弱毒株的同源性分别在93.2%～93.6%和96.4%～97.5%之间;在N基因系统发育进化树上,非典型CDV与12个强毒株处在同一亚群,而且与9个中国分离毒株的亲缘关系近于3个国外毒株。N基因在大肠杆菌中表达的重组N蛋白的分子量为62 ku,主要以包涵体的形式存在;用western blot分析,重组N蛋白可与CDV阳性血清发生特异性反应;以纯化的重组N蛋白为抗原建立的CDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。     

犬瘟热病毒融合蛋白、血凝蛋白、基质蛋白和核衣壳蛋白基因DNA联合免疫的研究

为研究犬瘟热病毒(CDV)融合蛋白(F)、血凝蛋白(H)、基质膜蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)基因核酸联合免疫的效力,本研究分别构建了表达经哺乳动物密码子优化的CDV F、H、M和N蛋白基因的真核重组表达质粒p CAGG-CDVF、p CAGG-CDVH、p CAGG-CDVM和p CAGG-CDVN;将其分别转染BHK-21细胞后通过间接免疫荧光试验表明,目的蛋白均获得正确表达。此外,将等量混合的重组质粒p CAGG-CDVF、p CAGG-CDVH、p CAGG-CDVM(3组份DNA疫苗)或重组质粒p CAGG-CDVF、p CAGG-CDVH、p CAGG-CDVM、p CAGG-CDVN(4组份DNA疫苗),分别以500μg/只经肌肉注射途径免疫A组(6只)或B组(6只)比格犬,间隔4周以相同剂量、途径加强免疫一次,并于初次免疫前、后不同时间检测血清CDV中和抗体。中和试验结果显示,A组和B组免疫犬,二免4周时,CDV中和抗体滴度平均值达到峰值,分别为6 log2和5.64 log2;在初免54周时,CDV中和抗体滴度均仍然维持5 log2。因此,3组份DNA疫苗为具有良好应用前景的犬瘟热候选疫苗。     

犬副流感病毒单克隆抗体的研制及其特性鉴定

为研制犬副流感特异性诊断试剂,我们以犬副流感病毒(CPIV)免疫8周龄BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术获得4株稳定分泌针对CPIV的单克隆抗体(MAb)细胞株,分别命名为4F386、584C9、4G7F4和4C9D8.4株MAb腹水针对CPIV的间接ELISA抗体效价达1:10~5～1:10~6,与犬瘟热病毒(CDV)和犬细小病毒(CPV)均不发生交叉反应.MAb 4F386和4C9D8为IgG,5B4C9和4G7F4为IgM.Western blot检测表明,4F386与CPIV的F蛋白发生特异性反应,4G7F4与CPW的HN蛋白发生特异性反应,而584C9和4C9D8不与变性的CPIV蛋白发生反应.4株MAb均具有中和病毒活性,间接免疫荧光检测均呈为阳性.本研究为进一步研制CPIV特异性诊断和治疗制剂创造了条件.