GlgC基因种子特异过表达载体的构建及对甘蓝型油菜的转化

【目的】通过表达外源GlgC基因增加甘蓝型油菜种子淀粉积累,从而可能增加含油量,为油菜高含油量育种提供一种潜在的新途径。【方法】本研究将定点突变的大肠杆菌AGPase基因GlgC分别和2个种子特异表达启动子DOF(拟南芥球形胚阶段启动子)、Cruc(油菜种子特异蛋白启动子)重组,构建2个GlgC过表达载体pMB-DOF-TG和pMB-Cruc-TG。利用农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,获得转基因植株。【结果】PCR及半定量RT-PCR检测结果显示,GlgC基因已导入油菜再生植株基因组并获得表达。【结论】获得了甘蓝型油菜转GlgC基因阳性株,为利用遗传改良技术实现上述途径在油菜育种中的应用奠定前期基础。     

转harpinXooc蛋白编码基因hrf2对油菜抗菌核病的影响

【目的】尝试利用转基因方法提高油菜抗病性。【方法】将来自水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）编码harpinXooc蛋白的hrf2基因插入植物表达载体pCAMBIA1301中,构建了植物重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2。由根癌农杆菌LBA4404介导,将重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2转化甘蓝型油菜杨油4号子叶节。【结果】获得了抗潮霉素的再生转基因油菜植株,经PCR,RT-PCR和GUS染色检测证明hrf2基因已整合到油菜基因组中。抗病性鉴定结果表明,转基因油菜对油菜菌核病有较好的抗性,在转基因植株叶片上油菜菌核病菌菌丝的生长受到明显抑制。【结论】利用农杆菌转化法可将hrf2基因导入油菜基因组中,并使转基因油菜对菌核病的抗性提高。     

大豆凝集素和脂肪氧化酶双价RNAi表达载体的构建及其遗传转化

【目的】应用RNA干扰技术,同时抑制大豆凝集素(Soybean agglutinin,SBA)和脂肪氧化酶(Lipoxygenase,Lox)基因在种子中的表达,改良大豆营养品质,为培育优质大豆材料奠定基础。【方法】根据RNAi原理,酶切获得Lox目的片段,构建以除草剂Bar基因为筛选标记、种子特异性启动子P7αP启动SBA和Lox双干扰的pCAMBIA3301-SBA-Lox(pSBA-Lox)干扰表达载体,并通过农杆菌介导法转化大豆(品种为吉农28),采用PCR、Southern杂交和实时荧光定量PCR对转基因植株进行检测。【结果】质粒PCR和酶切鉴定结果表明,双价RNAi植物表达载体pSBA-Lox构建成功。将其转入到大豆中,对转化植株进行PCR、Southern杂交检测,结果显示,外源基因以单拷贝形式整合到植物基因组中,并能遗传给后代。T1代转基因植株的实时荧光定量PCR分析显示,转基因植株中SBA基因和Lox基因在籽粒中的表达量比未转化受体植株均明显降低,SBA基因表达量降低了35.9%~47.2%,Lox基因表达量降低了32.8%~56.1%,而在幼嫩叶片中的表达量相比对照植株变化不大。【结论】获得了大豆凝集素和脂肪氧化酶表达量均明显降低的T1代转基因大豆。     

农杆菌介导的成纤维细胞生长因子-21基因转化甘蓝型油菜研究

【目的】利用基因工程技术获得FGF21转基因油菜植株,为FGF21蛋白生产体系的建立奠定基础。【方法】将人源FGF21基因的cDNA序列,根据植物偏好密码子进行改造,并通过PCR拼接技术扩增FGF21全长基因,将该基因插入油菜油体特异表达载体,通过冻融法转到根瘤农杆菌LBA4404,叶盘法转化甘蓝型油菜"沪油15",并对转基因油菜进行PCR检测和Southern blot分析,最后对FGF21蛋白在转基因油菜种子中的表达的进行了Western blot分析。【结果】合成了FGF21全长基因,成功构建了含FGF21基因的植物双元表达载体p1390yoFGF21,并建立了油菜遗传转化体系。通过油菜遗传转化获得2株转基因植株,PCR扩增和Southern blot检测证实,重组FGF21基因已整合到油菜基因组中;Western blot分析检测显示,FGF21在转基因油菜种子蛋白中具有一定水平的表达量,并具有良好的抗原性。【结论】FGF21基因被成功整合到油菜基因组中,收获的T0代种子蛋白具有良好的抗原性。     

β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体的构建

【目的】构建β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因具有功能性间隔序列的发夹结构（Intron-hairpin RNAi,ihp-RNA）的RNA干扰(ihp-RNAi)表达载体并转化大豆,为通过RNA干扰技术改良大豆的营养品质奠定基础。【方法】以大豆总RNA反转录获得的cDNA为模板,通过PCR扩增克隆了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的核心保守序列(400 bp),并将该片段的反义和正义片段插入到重组植物表达载体p3301P的种子特异性启动子7αp下游,将功能性间隔序列intron-SSR插入反义片段与正义片段之间,构建α′-亚基基因ihp-RNAi安全型表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,并进行PCR及双酶切鉴定。利用农杆菌介导法将带有p3301-PFNZ-α′-BADH 的菌株转化“吉农27”大豆植株,对转基因植株进行PCR、Southern杂交检测,并对转基因植株α′-亚基基因的表达量进行RT-PCR。【结果】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体p3301-PFNZ-α′-BADH,利用农杆菌介导法转化大豆得到7株阳性转化植株;Southern杂交结果显示,外源基因以1～2个拷贝整合于大豆基因组中;RT-PCR检测表明,β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因的表达被明显抑制。【结论】成功构建了β-伴大豆球蛋白α′-亚基基因ihp-RNAi表达载体,获得了α′-亚基基因被明显抑制的转基因大豆植株,为应用基因工程技术进行大豆品质改良奠定了基础。     

抗CMV和ToMV RNAi载体的构建及加工番茄遗传转化

【目的】利用农杆菌介导法将抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12转入红番3号加工番茄,获得抗CMV和ToMV的加工番茄植株,为加工番茄病毒病的防治奠定基础。【方法】采用RT-PCR扩增,选取新疆加工番茄CMV分离物NS0-4 1a复制酶第1 051-1 350bp序列和ToMV分离物SCS-2 130/180ku复制酶第1 920-2 200bp序列,作为干扰片段CR12和To12。通过T克隆载体将CR12和To12连接成拼接片段TC12,构建成含反向重复结构拼接片段的RNAi表达载体pBi35STC12。通过农杆菌介导法,用其转化红番3号加工番茄,经过筛选、PCR检测得到转基因植株。【结果】成功构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,并用其转化番茄植株,从转化的1 500个愈伤组织中获得33株再生植株,利用PCR对再生植株进行检测,显示从33株再生植株中获得了19株转基因植株,转化率为1.26%。【结论】构建了抗CMV和ToMV的RNAi表达载体pBi35STC12,用其转化红番3号加工番茄,获得了转基因植株。     

大豆RACK1基因RNAi载体构建及植株转化

[目的]筛选大豆RACK1基因的RNAi突变体,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程的调控作用提供依据.[方法]采用RT-PCR克隆大豆叶片RACK1基因核心保守序列片段,以植物表达载体pCAMBIA 1301为基本载体,构建抑制大豆RACK基因表达的RNAi载体.通过农杆菌介导转入大豆子叶节,经潮霉素筛选转基因植株,利用PCR、Southern blot及RT-qPCR进行转基因植株检测.[结果]克隆获得大豆RACK1基因核心保守序列片段432 bp;将该基因片段连接到pCAMBIA1301表达载体内含子两侧,通过酶切分析,RNAi载体构建正确.通过农杆菌介导,将该载体转入大豆中黄13号,获得23个转基因大豆株系;经PCR和Southern blot检测,确定大豆RACK1基因RNAi片段已融合到大豆基因组中.经定量RT-qPCR分析,不同转基因大豆株系RACK1基因mRNA的表达量具有明显差异,其在株系5的表达量最高,为对照的68.5%;株系7最低,降至对照的19.9%.[结论]成功构建了大豆RACK1 RNAi表达载体并导入大豆基因组中,获得23个农杆菌介导的RACK1 RNA干扰表达的大豆转基因植株,为研究RACK1基因在大豆生长发育过程中的功能和作用奠定了基础.     

大豆BBi基因ihpRNA种子特异性表达载体的构建

【目的】构建具有大豆蛋白酶抑制剂BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体,并将其转入根癌农杆菌中,为大豆品质改良奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆大豆蛋白酶抑制剂BBi基因的正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GFP基因片段,分别连入克隆载体pMD18-T Vector中。然后根据植物中ihpRNA原理,以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,将组成RNAi载体的4个目的片段分别连入其中,然后利用冻融法转化根癌农杆菌,并进行PCR鉴定。【结果】PCR扩增得到组成RNAi载体的4个目的片段,分别构建成重组克隆载体和ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,并转化得到含有p7αP-GFP-BBiS的农杆菌EHA101和EHA105。【结论】成功构建了具有BBi基因反向重复结构的ihpRNA种子特异性表达载体p7αP-GFP-BBiS,BBi基因的ihpRNA表达框架成功转入到农杆菌中。     

用RNA干扰技术创造高直链淀粉马铃薯材料

【目的】创造块茎高直链淀粉含量的转基因马铃薯材料。【方法】采用RT-PCR技术分别克隆了马铃薯Sbe 1基因CDS内300 bp的片段SⅠ和Sbe 2基因CDS内410 bp的片段SⅡ,并将SⅠ和SⅡ顺序连接得到融合片段SⅢ;以载体pHANNIBAL和pART27为基础,构建具有SⅢ反向重复结构的植物表达载体pRNAiⅢ;采用农杆菌介导法转化马铃薯优良品种陇薯3号、甘农薯2号和大西洋。【结果】获得了融合片段SⅢ,构建了以Sbe 1基因和Sbe 2基因为靶标的RNA干扰载体pRNAiⅢ,通过农杆菌介导法获得了24个转基因株系,其中21个转基因株系试管薯的淀粉粒形态发生明显变化,表观直链淀粉含量介于59.31%～87.14%,比受体材料平均高出3.2倍。RT-PCR分析表明,在8个直链淀粉含量超过80%的转基因株系中检测不到Sbe 1和Sbe 2基因mRNA的积累。【结论】采用RNAi技术通过沉默内源Sbe 1和Sbe 2,可获得高直链淀粉含量的马铃薯材料。     

水稻OsVDAC5基因干涉载体的构建和遗传转化

[目的]构建水稻基因Os VDAC5的RNAi表达载体,遗传转化获得Os VDAC5转基因植株以研究该基因的生物学功能。[方法]通过PCR扩增Os VDAC5特异片段并克隆到RNA干涉载体p MCG161,以水稻日本晴为受体,将Os VDAC5 RNAi表达载体进行了农杆菌介导的遗传转化,利用PCR和RT-PCR技术检测T0代转基因植株中Os VDAC5的表达水平。[结果]Os VDAC5在绝大多数RNAi转基因植株中的表达量显著降低。[结论]为进一步研究水稻Os VDAC5基因功能提供了重要材料。     

甘蓝型油菜COI1的调控功能分析

【目的】研究甘蓝型油菜中茉莉素受体复合体核心成员CORONATINE INSENSITIVE 1（COI1）蛋白的基因表达特性及生理调控功能。【方法】利用基因组数据分析甘蓝型油菜及其亲本种白菜和甘蓝基因组的COI1构成情况;使用定量和半定量RT-PCR扩增方法检测油菜COI1的组织特异性表达;克隆油菜COI1保守区片段,构建病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silenceing,VIGS）载体,以农杆菌侵染方法培育VIGS诱导COI1沉默的油菜植株,然后,用鉴定出的COI1沉默植株研究油菜COI1在育性调控及虫害抗性等方面的调控功能。【结果】基因组数据分析表明,甘蓝型油菜亲本种白菜和甘蓝共有7个高度同源的COI1,依序列同源性可分为4类：COI1a、COI1b.1、COI1b.2和COI1c;甘蓝型油菜有8个COI1,也由上述几类同源基因组成。半定量和定量RT-PCR扩增试验表明甘蓝型油菜COI1在茎中的表达水平最低。从培育的VIGS诱导COI1沉默油菜中,共鉴定出COI1表达水平被抑制超过70%的株系25个,其中抑制效果最明显的10个株系被用于育性调控及蚜虫抗性试验。育性分析结果证明,VIGS沉默COI1油菜的结实能力受到严重影响,其角果在授粉20 d以后的长度只达到对照油菜角果授粉5 d后的长度,且角果中无正常种子;沉默COI1油菜的雄蕊长度短于相同花期的对照油菜雄蕊,其花药开裂延迟;显微观察发现,沉默COI1油菜的花粉中有超过80%呈不正常形态。在相同处理条件下进行的蚜虫抗性比较试验中,沉默COI1油菜叶片上的蚜虫数量超过对照油菜1倍多,而且有很多小蚜虫围绕大蚜虫的虫落,繁殖态势比对照油菜叶片上的蚜虫旺盛。【结论】甘蓝型油菜COI1具有组织特异表达特性,沉默COI1会导致油菜雄性不育性状发生,并降低油菜植株对蚜虫的抗性。     

利用RNAi技术抑制籽粒PPO合成改良小麦面粉白度的研究

【目的】通过RNAi策略抑制小麦籽粒ppo的表达,获得籽粒PPO酶活性低、白度高的转基因小麦新种质。【方法】构建了以小麦胚乳特异表达启动子1Dx5启动子驱动的籽粒ppo的RNAi载体pBAC47P-ppoIR,利用基因枪将该载体与含bar的表达载体基因枪共转化中优9507幼胚愈伤组织,获得T0转基因植株。通过分子鉴定（PCR、Southern杂交、半定量RT-PCR、Northern杂交）、酶活筛选和白度测定等方法对转基因植株及其后代株系进行筛选。【结果】获得了27株阳性T0转基因植株。转基因植株及其后代经PCR和Southern杂交检测表明,RNAi构件已经稳定整合到T1的12个株系中。半定量RT-PCR和Northern杂交结果表明有20株T2籽粒中ppo表达水平明显低于对照。对转基因T2灌浆期籽粒进行PPO同功酶活性分析表明,有6个株系的PPO活性有所减弱。对T4籽粒的面片白度测定表明,5个株系的白度均比对照有所提高,其中2个株系效果显著。【结论】RNAi技术的表达能抑制籽粒ppo表达,降低PPO同功酶的活性,明显提高小麦面片白度,从而为小麦面粉白度的改良、品质育种提供了材料。     

用反义RNA技术创造高直链淀粉玉米材料

 【目的】利用反义RNA技术调控玉米淀粉的生物合成过程,创造高直链淀粉玉米材料。【方法】克隆玉米淀粉分支酶(sbe2a)基因片段,以载体pWGLL为基础,构建高效反义表达载体,通过花粉管通道法将其导入玉米自交系铁7922中。【结果】获得了4株转基因株系,GFP表达检测、PCR扩增和Southern杂交结果表明,目的基因已整合到基因组中,且能够遗传。对4株转基因植株进行RT-PCR和淀粉分支酶活性检测,结果表明转反义sbe2a玉米淀粉分子酶基因的转录受到了明显抑制,淀粉分支酶活性明显低于野生型,相差最多的降低79.4%;直链淀粉含量也发生明显的变化,最高的提高了84.3%,且总淀粉含量与对照之间基本没有差异。【结论】采用反义RNA技术通过沉默内源sbe2a,可获得高直链淀粉含量的玉米材料。     

苦豆子凝集素基因植物表达载体的构建及其对烟草的转化

[目的]了解苦豆子凝集素基因(SAL)的功能,将该基因构建到植物表达载体并转化烟草,获得转基因植株.[方法]利用RT-PCR技术,提取苦豆子总RNA进行反转录得到cDNA,通过PCR扩增得到苦豆子凝集素基因SAL,并将其克隆到植物表达载体pCAMBIA1301上,产生重组质粒pCAMBIA1301-SAL.采用农杆菌介导法将重组质粒转化烟草,并进行分析鉴定.[结果]构建了植物表达载体pCAMBIA1301-SAL,转化烟草后经筛选获得76株转基因植株,经抗性筛选及PCR和RT-PCR鉴定,其中27株显示为阳性植株.[结论]苦豆子凝集素基因已经在烟草中成功表达,为进一步研究验证转基因烟草的抗病效果奠定了基础.     

应用ihpRNA干扰技术创制高支链淀粉马铃薯材料

【目的】创造块茎高支链淀粉或纯支链淀粉含量的转基因马铃薯材料。【方法】以构建的由Patatin启动子驱动的pBI121g-PgABI为干扰表达载体,采用农杆菌介导法转化马铃薯优良品种甘农薯2号。用PCR、Southern blotting、半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术检测转基因植株,并对转基因植株的微型薯进行淀粉含量的测定。【结果】通过农杆菌介导法获得10个转基因株系。PCR和Southern杂交结果证明,目的基因已被整合到基因组中,通过半定量RT-PCR分析表明,转基因株系中GBSSI的表达均受到明显抑制,且在6个转基因株系中检测不到mRNA的表达。进一步通过real-time PCR分析表明,转基因株系中GBSSI的mRNA沉默效率为66.27%—93.53%;转基因株系微型薯的淀粉含量也发生明显变化,其支链淀粉含量高达90.16%—98.84%,比对照高出10.31%—20.92%。转基因株系GBSSI的mRNA沉默效率与支链淀粉含量呈显著正相关（r=0.937,P<0.01）。【结论】采用ihpRNAi技术可有效抑制马铃薯块茎中内源GBSSI表达,获得高支链或纯支链淀粉含量的马铃薯材料。     

利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量

【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein的表达,获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转基因大麦新种质,探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein核心保守序列,通过Gateway技术构建大麦B-hordein的RNAi植物表达载体pBract207-zz-gp4,利用农杆菌介导法转化大麦Golden Promise幼胚,获得转基因植株。通过PCR检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期B-hordein转录表达情况。基于近红外谷物分析仪测定蛋白质含量,并进行醇溶蛋白SDS-PAGE检测,以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关试验,检验RNAi效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein片段2条（Gp4和Gp5）,测序结果表明该片段大小为349 bp,聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达92%,与该基因已登录的mRNA序列同源性高于98%,确认所得片段为大麦B醇溶蛋白基因片段。利用Gateway技术将Gp4片段正反向插入载体pBract207,反向重复序列用i18 和 iv2 intron连接,构建了Ubi启动子驱动的大麦B-hordein RNAi植物表达载体 pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦Golden Promise幼胚,结合目标基因及筛选标记基因的PCR验证,获得含有RNAi构件及筛选标记基因的转基因大麦株系11个。Southern杂交检测表明RNAi构件已经稳定整合到T₂/T₃转基因大麦基因组。随机选取6个T₃转基因大麦株系,半定量RT-PCR结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒B-hordein表达水平明显低于非转基因对照,20 d时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低28.19%-55.19%,而且在各时期中也最低。利用随机选取的T₁和T₃籽粒进行蛋白质含量测定表明,8个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低,SDS-PAGE电泳结果显示与非转基因相比,转基因各株系B-醇溶蛋白比率有不同程度降低,其中3个株系B-醇溶蛋白比率降低明显,平均减幅为49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系RNAi-20开展氮肥运筹试验,结果表明,高氮肥水平HN₂及HN₃处理,该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照;施以等量高氮肥时,伴随氮肥后移（HN₂到HN₃）,该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS-PAGE电泳结果显示B醇溶蛋白含量降低,电泳带型发生变化。【结论】RNAi技术能抑制籽粒B-hordein表达,降低B-醇溶蛋白含量,高氮肥水平下能显著降低大麦蛋白质含量。     

茶树CsCBF1基因表达载体的构建及其转基因烟草的抗寒性分析

【目的】通过转基因烟草验证茶树CsCBF1基因抗寒性功能,为发掘、筛选茶树重要功能基因提供理论依据。【方法】 利用根癌农杆菌介导法将构建的表达载体pBI121-CsCBF1导入烟草,通过PCR、RT-PCR和GUS活性染色鉴定外源CsCBF1基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。然后将转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草分别置于25,4和0 ℃下处理48 h后,检测其膜质通透性、丙二醛（MDA）含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm,并将0 ℃处理3 d的转pBI121-CsCBF1型和野生型烟草置于25 ℃下培养1周后观测恢复表型和统计死亡率。【结果】 成功构建表达载体pBI121-CsCBF1,PCR、RT-PCR和GUS活性染色证明,CsCBF1已整合到烟草基因组中并转录表达。25 ℃处理下,转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草的膜质通透性、丙二醛含量和Fv/Fm均无显著差异,而在4和0 ℃处理下,转pBI121-CsCBF1型烟草的膜质通透性和丙二醛含量均显著低于转pBI121型和野生型烟草,但Fv/Fm显著高于转pBI121型和野生型烟草。生长恢复试验中,转pBI121-CsCBF1型的存活率为66.7％,而野生型仅为23.3％。【结论】 茶树CsCBF1基因能够显著增强非低温驯化植物烟草的抗寒性,说明茶树CsCBF1基因存在于细胞抗寒的分子调控途径中,从而提高植物细胞的低温防御能力。