促卵泡素对鸡等级前卵泡细胞发育的影响

实验研究了鸡等级前卵泡颗粒细胞和膜细胞的发育及促卵泡素(FSH)对其增殖的调控作用。形态学观察显示小白卵泡只有1层颗粒细胞,大白卵泡出现2层颗粒细胞,而小黄卵泡和大黄卵泡中则有多层颗粒细胞。结果表明:卵泡颗粒细胞和膜细胞的密度和细胞层厚度随着卵泡发育的等级而增加。卵泡体外悬浮培养表明,FSH显著刺激小黄卵泡和大黄卵泡中颗粒细胞的增殖,但对膜细胞无显著促增殖作用。由此推测,FSH通过刺激颗粒细胞的增殖促使等级前卵泡进入等级发育。     

氯前列烯醇对鸡等级前卵泡颗粒细胞增殖的促进作用

探讨了前列腺素PGF2α类似物氯前列烯醇（Cloprostenol,CLO）对鸡等级前小黄卵泡颗粒细胞增殖的作用及其信号转导途径。颗粒细胞经16 h预培养后用CLO处理24 h,测定细胞的增殖情况。结果显示：0.1～10μg/L的CLO促进了颗粒细胞的增殖,10μg/L时刺激效果最为明显。蛋白激酶A（PKA）激活后颗粒细胞数量增加,PKA抑制剂H89抑制了CLO的促增殖作用。PKC的激活或抑制对CLO的促增殖作用无显著影响。这表明,CLO可通过PKA途径促进鸡等级前小黄卵泡颗粒细胞的增殖。     

血清浓度对共培养条件下牛原代肌肉卫星细胞及前体脂肪细胞活性影响

为探索添加血清浓度对共培养条件下细胞活性的影响,本研究采集新生秦川犊牛背最长肌和肾周脂肪,分离提取前体脂肪细胞和肌卫星细胞,建立以DMEM/F12培养基,不同细胞混合比例(肌肉细胞:脂肪细胞=10:1、5:1、2:1)的多种共培养体系,通过调整各共培养体系培养基中的胎牛血清比例(5%、10%、15%、20%的胎牛血清,FBS),来研究血清浓度对各共培养体系中细胞活性的影响。共培养14d,每两天更换对应培养基,并采用MTT染色法测定共培养细胞的细胞活性。统计分析后发现:共培养细胞活性随着血清浓度的上升而增加;15%FBS和20%FBS浓度下细胞活性均显著高于5%FBS组和10%FBS组(P<0.05);虽20%FBS组细胞活性高于15%组,但差异不显著(P>0.05)。综上,为了获得最好的牛肌卫星细胞和前体脂肪细胞共培养效果,达到较高的细胞培养活性,建议采用15%(v/v)以上的FBS进行共培养。     

西藏林芝地区牦牛卵泡颗粒细胞体外分离培养和形态观察

旨在建立牦牛卵泡颗粒细胞模型以研究牦牛生殖生理机制。从林芝市牛屠宰场采集牦牛卵巢,并采用口吸管法在体视显微镜下分离卵巢表面直径为2~5 mm卵泡内的颗粒细胞,用于体外培养。结果表明:原代颗粒细胞培养12~48 h时处于潜伏期,此时细胞刚刚贴壁并且黏附不牢固,增殖分化速度较慢;培养72~96 h时,细胞进入指数增殖期,此时细胞多呈放射状,增殖分化速度最快;培养144 h时形成颗粒细胞单层;然而传代颗粒细胞生长速度较快,48 h后细胞进入指数增殖期,72 h后颗粒细胞生长至培养皿的90%左右,形成颗粒细胞单层。     

牛骨髓间充质干细胞体外培养体系的优化

结合红细胞裂解法和全骨髓细胞贴壁培养法分离获得胎牛骨髓MSCs(bBMSCs),经贴壁培养、传代纯化后对其生物学特性进行检测,进而设定不同浓度胎牛血清-血清替代物(FBS-KSR)组合培养基(10%FBS、5%FBS+5%KSR、2.5%FBS+7.5%KSR、10%KSR),对第5代bBMSCs进行体外培养,并对其增殖、多能性及凋亡情况进行检测。结果显示:原代bBMSCs具有贴壁特性,呈成纤维样细胞形态,表达MSCs相关标记分子CD73、CD90、CD105,不表达相关阴性分子标记CD45、CD34;体外具有成脂及成骨分化潜能,生长曲线呈典型的"S"型。CCK8检测显示,5%和7.5%的KSR可作为FBS的替代品,对bBMSCs体外增殖有显著促进作用。荧光定量PCR结果显示:添加不同浓度KSR后增殖相关基因bFGF mRNA水平显著升高(P0.01),进一步证明KSR可以提高bBMSCs的增殖能力;多能性相关基因检测显示,添加KSR组中Oct4、Sox2mRNA表达水平也显著上调;凋亡相关基因检测显示,5%FBS+5%KSR组中抗凋亡基因Bcl2mRNA水平显著上调,而2.5%FBS+7.5%KSR组中Bcl2表达显著下降而促凋亡基因Bax mRNA水平显著提高。推测这是由于细胞传代培养1周时,各组中细胞可能处于生长周期的不同时期,5%FBS+5%KSR和2.5%FBS+7.5%KSR组中细胞已到达平台期,发生生长抑制,需及时传代,而10%FBS组中细胞仍处于对数生长期,未发生细胞凋亡。这也进一步说明,适当浓度KSR缩短了bBMSCs体外增殖周期,提高了细胞的增殖效率。结果表明:培养基中适当添加KSR有利于bBMSCs的体外扩增和多能性维持,同时需注意根据增殖周期变化调整传代时间,这对进一步优化牛及其他动物BMSCs的体外培养条件具有借鉴意义。     

猪卵巢颗粒细胞的体外培养

颗粒细胞是猪卵泡的重要组成,其生长及形态功能变化伴随着卵泡的整个发育过程,同时也是研究细胞增殖、分化、信号转导等重要的细胞模型。本试验旨在筛选和摸索原代培养颗粒细胞的理想培养基及培养过程,分别使用DMEM高糖、DMEM/F12、M199、1640完全培养基(86%培养基+12%胎牛血清+1%双抗+1%庆大霉素两性霉素混合液)接种猪卵巢颗粒细胞,置于37℃、体积分数5%的CO2、饱和湿度的细胞培养箱中进行培养,每12 h观察细胞生长状态及形态特征,建立体外培养体系。结果显示,DMEM高糖培养基中,细胞增殖速度快,细胞状态好,细胞形态清晰,培养效果最佳,同时,经FSHR免疫荧光鉴定,分离的细胞为猪卵巢颗粒细胞,且纯度大于98%,说明DMEM高糖培养基在建立体外原代细胞培养体系中效果明显。     

体外无血清培养的鸡卵泡细胞GnRH样肽分泌的研究

本实验通过^125I标记的鸡GnRH与同源血清（抗体）反应,建立了鸡GnRH放射免疫分析法（ＲＩＡ）,并用以检测体外无血清培养的鸡卵泡细胞,证明卵泡膜细胞（ＴＣ）和颗粒细胞（ＧＣ）培养液中均存在GnRH-Ⅱ样肽样肽物质,并发现ＴＣ细胞培养液中的GnRH-Ⅱ样肽含量在７２h内随培养时间加长而增多,而ＧＣ细胞培养液中GnRH样肽含量变化不明显。实验结果表明卵泡细胞能产生GnRH-Ⅱ肽样物质。     

美洲大蠊小肽对鸡小黄卵泡外膜细胞增殖和血管生成的影响

为了探讨美洲大蠊小肽对鸡小黄卵泡外膜细胞增殖和血管生成的影响,试验用不同浓度的美洲大蠊小肽(400,800,1 200μg/mL)处理体外培养的鸡小黄卵泡外膜细胞,以正常细胞作为空白对照,采用CCK-8法分别在0,12,24,48小时检测细胞活力,筛选最佳药物浓度和作用时间;用EdU法检测细胞增殖能力;用实时荧光定量PCR法和Western-blot法分别检测各组细胞中ANXA2、VEGF的mRNA及其蛋白质的表达量;通过鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)试验检测不同浓度美洲大蠊小肽对血管生成的作用。结果表明：与对照相比,美洲大蠊小肽能够提高鸡小黄卵泡外膜细胞的细胞活力,显著促进细胞增殖(P<0.05),最佳药物浓度及作用时间为800μg/mL、24 h。800μg/mL美洲大蠊小肽能够显著上调鸡小黄卵泡外膜细胞中ANXA2和VEGF的mRNA和蛋白质表达量(P<0.05)。不同浓度美洲大蠊小肽均具有显著的促血管生成作用,800μg/mL组效果最明显(P<0.05)。说明美洲大蠊小肽能显著促进鸡小黄卵泡外膜细胞增殖和血管生成,其可能是通过ANXA2和VEGF发挥调控作用的。     

鸡胚盲肠上皮细胞的传代培养

本研究旨在探讨鸡胚盲肠上皮细胞传代培养条件及其特性,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型。分别用胰酶-EDTA联合消化和分步消化2种方法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定贴壁细胞覆盖率选择细胞传代的适宜消化方式;筛选了传代细胞培养液中L-GLN和胰岛素的最佳浓度,通过贴壁差进一步纯化盲肠上皮细胞,探索其合适的培养条件。通过形态学观察、透射电镜、免疫组织化学技术、组织化学技术、糖原染色、流式细胞术的方法对传代细胞特性进行了鉴定。结果表明:胰酶-EDTA联合消化、15min贴壁差纯化除去成纤维细胞,72.5mg.L-1 L-GLN、0.05mg.L-1胰岛素和5%FBS的传代细胞培养液更有利于盲肠上皮细胞的生长;经形态学和透射电镜观察,AKP、Vimentin及PAS染色,所培养的传代细胞具有典型的上皮细胞特征,在传代后24～72h盲肠上皮细胞纯度达95%以上,贴壁细胞覆盖率达85%以上;细胞凋亡测定表明,细胞连传5代,活性较好,第6代细胞凋亡率显著增加,贴壁细胞覆盖率降低。本研究提示用该法传代可获得稳定、数量大、活性高、纯度高的鸡胚盲肠上皮细胞。     

昆明小鼠胚胎成纤维细胞体外培养条件初步研究

本研究旨在探索影响小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast,MEF)分离培养的因素,建立有效的胚胎成纤维细胞培养体系,为构建饲养层细胞与体细胞核移植技术的细胞核供体建立平台。本研究用组织细胞培养液DMEM作为基础培养液,观察了不同胎龄、不同血清浓度及不同胰蛋白酶作用时间等因素对MEF分离培养的影响。结果显示,在所进行的4个胎龄8.5、10.5、12.5、14.5 d的比较试验中,原代成纤维细胞分离培养的最适胎龄为12.5 d,细胞贴壁迅速,12 h已完全贴壁,增殖速度快;在所进行的不同时间5、10、15、30 min的胰蛋白酶消化中,最佳时间为5~10 min;在所进行的5个血清浓度7%、9%、10%、11%、13%的比较试验中,添加11%胎牛血清浓度培养效果最佳,从3~5代增殖倍数稳定在1.35左右,传代时间也相对较长。以上结果表明,采用12.5 d胎鼠,胰蛋白酶消化5~10 min,在含有11%血清的DMEM培养液中培养MEF细胞时,原代和传代效果最好,传代至第3~5代时细胞生长增殖最旺盛,处于对数分裂期,适宜作为饲养层细胞与体细胞核移植细胞核供体。     

鸡卵泡细胞GnRH受体定位和定量分析

本实验采用免疫组织化学ＰＡＰ法对体外培养的鸡卵泡细胞ＧｎＲＨ受体定位检查,证明了卵泡颗粒细胞和膜细胞上均存在能与鸡ＧｎＲＨ结合的阳性物质。     

FSH、LH对体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞凋亡及E_2、P分泌功能的影响

为了探明促卵泡素(Follicle stimulating hormone,FSH)和促黄体素(Luteinizing hormone,LH)对体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞凋亡及甾体激素分泌的影响,揭示促性腺激素调控卵泡发育的机理,采用细胞培养和显微观察技术,建立了牦牛卵泡颗粒细胞体外培养体系,观察分析牦牛卵泡颗粒细胞体外培养的生长特征和凋亡的形态特征;采用流式细胞技术(Flow cytometry,FCM)和放射免疫测定技术(Radioimmunoassay,RIA),分析了添加不同浓度的FSH和LH对牦牛卵泡颗粒细胞凋亡和雌二醇(Estradiol,E2)、孕酮(Progesterone,P)分泌的影响。结果显示,体外培养的牦牛卵泡颗粒细胞呈现出典型的上皮样细胞生长特性,具有典型的"S"形生长曲线,体外培养的牦牛颗粒细胞偶尔可见细胞核浓缩、边集化、染色质固缩、内质网疏松等凋亡的形态特征。在添加0.050~5.000IU·mL-1FSH,随着浓度的增加,凋亡细胞比例逐渐降低,E2和P水平呈上升趋势;在添加浓度达到5.000IU·mL-1时,凋亡细胞比例最低降到7.3%,与对照组差异极显著(P0.01)。低浓度的LH(0.050~0.500IU·mL-1),可以抑制颗粒细胞凋亡,促使E2和P分泌增加;高浓度的LH(5.000IU·mL-1)则促使颗粒细胞凋亡,对颗粒细胞分泌E2和P的影响不明显。这一结果表明,FSH和LH可通过调节牦牛颗粒细胞的凋亡及分泌功能,在调控卵泡发育及排卵的过程中发挥重要作用。     

牦牛输卵管上皮细胞和卵泡颗粒细胞的培养

从牦牛输卵管壶腹部获取上皮细胞,用抽吸法从牦牛卵泡中获取颗粒细胞,对牦牛输卵管上皮细胞和卵泡颗粒细胞进行体外培养和传代的培养,观察培养过程中2种细胞原代和传代培养的生长方式及形态特点。两者培养144~216 h可形成融合的单层细胞,其传代密度保持105~106/mL为宜。     

褪黑素对体外培养绵羊卵泡颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮的影响

采集绵羊卵泡颗粒细胞进行体外培养,根据试验设计加入褪黑素(MLT)和HCG,分别于不同培养时间收集细胞培养液,用放射免疫测定法(RIA)测定细胞培养液中雌二醇(17β-E2)和孕酮(P4)含量。结果表明:卵泡颗粒细胞在无血清培养体系中可体外培养,并能够分泌相应17β-E2;用MLT或MLT与HCG共同处理卵泡颗粒细胞,能促进细胞分泌17β-E2,并呈时间和剂量的依赖性,但对P4的分泌没有影响。     

添加外源激素FSH对绵羊卵丘颗粒细胞增殖的影响

为了分析外源激素促卵泡激素(FSH)对绵羊卵丘颗粒细胞增殖的影响,试验分离并体外培养了绵羊卵丘颗粒细胞,然后使用促卵泡激素受体(FSHR)免疫组织化学法鉴定了分离培养的细胞,进而分析了添加不同浓度FSH对细胞增殖速度的影响。结果表明:将卵丘颗粒细胞从卵丘颗粒细胞-卵母细胞复合体(COCs)上分离24 h之后,能够观察到部分卵丘颗粒细胞开始贴壁,传代之后细胞形态未发生明显变化。FSHR免疫组织化学法鉴定结果证明分离培养的绵羊卵丘颗粒细胞能够特异性地表达FSHR。培养基中添加FSH后,在培养前4 d,高浓度(100 ng/mL)和低浓度(10 ng/mL)的FSH均能促进卵丘颗粒细胞的增殖,但在培养6 d之后,高浓度的FSH对卵丘颗粒细胞的增殖存在抑制作用。说明外源激素FSH在不同浓度下对卵母颗粒细胞的增殖具有不同的影响。     

褪黑素对体外培养绵羊卵泡颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮的影响

采集绵羊卵泡颗粒细胞进行体外培养,根据试验设计加入褪黑素(MLT)和HCG,分别于不同培养时间收集细胞培养液,用放射免疫测定法(RIA)测定细胞培养液中雌二醇(17β-E2)和孕酮(P4)含量。结果表明：卵泡颗粒细胞在无血清培养体系中可体外培养,并能够分泌相应17β-E2;用MLT或MLT与HCG共同处理卵泡颗粒细胞,能促进细胞分泌17β-E2,并呈时间和剂量的依赖性,但对P4的分泌没有影响。     

猪卵巢颗粒细胞分离培养及鉴定

为构建猪卵巢颗粒细胞的体外培养体系,研究毒素的生殖毒性奠定基础,采用机械分离法从1～5 mm的卵泡中提取猪卵巢颗粒细胞,苔盼蓝染色计算细胞存活率,Giemsa染色和结晶紫染色观察细胞形态,免疫细胞化学染色方法检测促卵泡刺激素受体(FSHR)表达来鉴定颗粒细胞,MTT方法测定细胞生长曲线.结果显示分离提取的猪卵巢颗粒细胞存活率为65%左右,细胞纯度＞97%,细胞结构完整,边缘分明,胞核呈卵圆形位于靠近胞质的中央.另外细胞生长曲线表明,细胞从24 h开始进入对数生长期,并于96 h达到最高密度,之后进入平台期.分离培养的颗粒细胞生长状态良好,且细胞纯度＞97%,是理想的适合进行毒素生殖毒理学的细胞培养体系.     

从小鼠类ES细胞分化群中分离培养一类衍生细胞及其培养特性

将小鼠囊胚在饲养层、无类LIF因子的培养基中培养出类ES细胞团,将该类ES细胞团传至第三代,暂停传代,继续培养,则4～5 d后该细胞团会向周围分化出一种圆而发亮的衍生细胞,该衍生细胞会不断地向周围生长,约20 d后该衍生细胞铺满培养皿底.将该衍生细胞传至铺有饲养层的培养瓶中继续传代至第七代,再将其传代至无饲养层的培养瓶中,约12 d后,其在无饲养层的培养瓶中长满瓶底.以后随着传代数的增加,该细胞长满瓶底所需时间越来越短,最后稳定在2～3 d.对传代至第30代的细胞进行生长曲线测定,并以不同的基础培养基、不同的血清浓度、不同的胰岛素浓度等条件培养该细胞,结果发现：该衍生细胞分别在DMEM高糖、DMEM低糖、DMEM-F12、PRMI1640等为基础的培养基中都能生长,但以DMEM-F12为最优.在血清浓度分别为10%、14%、18%的DMEM高糖培养基中培养显示：该细胞在高浓度血清的培养基中具有生长更好的趋势.在胰岛素浓度分别为0、0.25、0.5、1 μg/ml的DMEM高糖培养基中培养显示：该细胞在无胰岛素的培养基中无法正常生长,在0.5 μg/ml胰岛素浓度的培养基中生长最佳.     

Ghrelin对鸡等级前卵泡发育的影响

旨在研究Ghrelin对产蛋鸡等级前卵泡发育的调节作用.通过RT-PCR方法检测卵泡Ghrelin受体(GH-SR)的表达情况,采用组织学和免疫组化方法探讨Ghrelin和促卵泡素(FSH)单独或联合处理对鸡等级前卵泡形态学的变化以及层粘连蛋白(LN)和缝隙连接蛋白43(Cx43)的标记率.结果表明,GHSR在颗粒层和膜层上均有表达,其表达量随着卵泡的发育分别至大白卵泡(LWF)和小黄卵泡(SYF)达到最高,随后逐渐降低.悬浮培养的卵泡经Ghrelin和FSH处理24 h后,LWF和SYF的颗粒层和膜层厚度及颗粒细胞密度均显著增加(P＜0.05).同时,颗粒细胞中LN和Cx43的标记率显著提高(P＜0.05),且以Ghrelin与FSH联合处理组最为显著.结果提示,Ghrelin可通过提高LN和Cx43的表达以增强颗粒细胞的连接功能,促进鸡等级前卵泡颗粒细胞的增殖,并可协同FSH调节卵泡的发育.     

促卵泡激素和胰岛素对牛卵泡颗粒细胞长期培养的影响

以McCoy’s5a为基础培养液添加硒、转铁蛋白、雄烯二酮、谷氨酰胺，对牛卵巢上大（直径〉8mm）、中（4mm〈直径〈8mm）、小（直径〈4mm）非闭锁卵泡的颗粒细胞进行无血清培养，研究添加不同浓度的促卵泡激素（FSH）和胰岛素对颗粒细胞增生、分化和激素分泌的影响。结果，FSH能诱导颗粒细胞增生及提高其雌二醇合成能力，颗粒细胞雌二醇的合成能力与生理浓度的FSH存在剂量依赖关系。胰岛素对大、中、小卵泡颗粒细胞增生和雌激素分泌有促进作用。