马尾松纤维素合成酶基因PmCesA1的克隆及其分析

植物纤维素合成酶(Ces A)是林木中纤维素合成过程中的重要酶,与木材形成密切相关。本研究以马尾松嫩枝的总RNA反转录得到的c DNA为模板,利用反转录PCR和RACE技术克隆得到马尾松Ces A1基因的全长c DNA序列,命名为Pm Ces A1。序列长度为3 142 bp,包含有一个长为2 955 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码984个氨基酸。序列分析表明:Pm Ces A1序列与已报道的火炬松(Pinus taeda)Ces A1基因(AY789650.1)的相似性达99%。对Pm Ces A1所编码蛋白的氨基酸序列聚类分析,结果显示马尾松与松科植物具有较近的亲缘关系。采用实时定量PCR测定了Pm Ces A1在马尾松的嫩枝、叶和根中的表达量,发现以嫩枝中的表达量最高(2.53)。本研究获得的全长基因可以用来构建正义表达载体,再通过遗传转化得到转基因植株,可进一步分析该基因在植株内的表达情况和作用机制,为马尾松纤维素合酶的研究和获得高纤维得率的马尾松良种提供帮助。     

马尾松Aux/IAA家族相关基因克隆及初步分析

生长素信号转导途径在植物生长发育过程中起到至关重要的作用,Aux/IAA(auxin/indoleacetic acids)家族基因可以直接和生长素相连而发生作用。研究马尾松Aux/IAA家族相关基因,可为马尾松体内生长素信号转导途径提供理论支持。本研究克隆出3个Aux/IAA家族基因,分别命名为Pm IAA1、Pm IAA2和Pm IAA3。Pm IAA1基因,c DNA全长1 330 bp,包含711 bp完整的ORF,能够编码含有236个氨基酸的蛋白质,此蛋白相对分子质量为26 015.6 u,等电点为7.01;Pm IAA2基因,c DNA全长1 628 bp,包含909 bp完整的ORF,能够编码含有302个氨基酸的蛋白质,此蛋白相对分子质量为41 176.1 u,等电点为5.25;Pm IAA3基因,c DNA全长1 316 bp,包含759 bp完整的ORF,能够编码含有252个氨基酸的蛋白质,此蛋白相对分子质量为28 060.1 u,等电点为6.01。Pm IAA1蛋白与火距松IAA1蛋白同源性高达95%,Pm IAA2蛋白与火距松IAA2蛋白同源性高达97%,Pm IAA3蛋白与火距松IAA3蛋白同源性高达98%。Pm IAA1、Pm IAA2、Pm IAA3蛋白都含有Aux/IAA结构域,此结构域可以与ARFs(auxin response factors)结合而发生作用,这符合Aux/IAA家族的特点。利用实时定量技术得知,Pm IAA1、Pm IAA2和Pm IAA3在马尾松嫩根、嫩芽、嫩叶中都有表达。Pm IAA1在嫩叶中表达量最高、嫩根中次之、嫩茎中最低;Pm IAA2和Pm IAA3在嫩根中表达最高、嫩叶和嫩茎中次之。本研究可为生长素调控马尾松生长发育相关机理提供依据。     

马尾松PmTIR1基因的克隆及编码蛋白质的结构预测

TIR1(transport inhibitor response 1)基因在生长素信号转导途径中发挥重要作用。本研究采用PCR技术和RACE技术,利用Primer Premier5进行引物设计,从马尾松中克隆出TIR1基因的全长c DNA序列,命名为Pm TIR1。此c DNA全长2 446 bp,包括1 725 bp完整的ORF,能够编码含有574个氨基酸的蛋白,此蛋白相对分子质量为64 240.3 u,等电点为6.76。利用Clustal X、ANTHEPROT和DNAMAN等软件分析Pm TIR1序列及其编码的氨基酸序列,结果表明:马尾松Pm TIR1蛋白氨基酸序列与火距松TIR1蛋白同源性高达99%,Pm TIR1蛋白含有F-box结构域和多个LRR结构域;Pm TIR1蛋白的F-box结构域可能与SCFTIR1中SKP1结合,它符合F-box家族的特点。利用实时定量技术得知Pm TIR1在马尾松嫩根、嫩茎、嫩叶中都有表达,在嫩叶中表达量最高、嫩根中次之、嫩茎中最低。本研究可为生长素调控马尾松生长发育相关机理提供理论依据。     

兴安落叶松咖啡酸-O-甲基转移酶基因的克隆及特性分析

本研究利用兼并-PCR及RACE技术克隆了兴安落叶松(Larix gmelinii)的咖啡酸-O-甲基转移酶基因(命名为Lg COMT),并对其基因结构和表达模式进行了分析。所克隆的Lg COMT c DNA全长为1 173 bp,包含1 092 bp的开放阅读框,编码364个氨基酸;基因组DNA全长为1 400 bp,包含3个外显子和2个内含子。系统进化分析结果显示,Lg COMT与日本落叶松、挪威云杉和北美云杉等裸子植物COMT的亲缘关系较近。表达模式分析结果显示,Lg COMT基因主要在兴安落叶松的幼茎中表达,与其功能相一致。本研究为进一步分析兴安落叶松咖啡酸-O-甲基转移酶基因的功能,表达特性及其在木质素单体生物合成中的调控机理奠定了基础。     

马尾松PmPIN2基因的克隆及实时定量分析

PIN2基因在植物生根机理中起关键作用,对马尾松PIN2基因进行研究,可为解决马尾松无性系生根困难、促根壮苗培育提供帮助。本研究以马尾松幼苗全株为试材,利用PCR技术和RACE技术克隆了马尾松PIN2基因全长,并通过相关软件和实时荧光定量进行生物信息学和组织特异性分析。结果发现PIN2基因全长3 706 bp,包括2 103 bp完整ORF序列,编码700个氨基酸。生物信息学分析表明,PIN2蛋白为疏水性蛋白,相对分子量76.43 k D,等电点(p I)为9.06,总亲水性平均数0.023,PmPIN2编码的蛋白与PIN家族具有同样典型结构域。实时荧光定量分析结果显示,PmPIN2基因在马尾松根、茎、叶、花中均有表达,其中根中的表达量最高,花中最低。PIN2基因是参与植物生根过程的重要基因,对马尾松PmPIN2基因的研究为PIN基因家族在生根机制方面的作用探究提供帮助。     

苎麻COMT基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR法结合cDNA末端快速扩增（RACE）法从苎麻中克隆了与木质素合成相关的COMT基因的全长cDNA序列。所获得的COMT基因全长1318bp,包含一个开放阅读框1098bp,编码365个氨基酸。序列相似性检索结果表明,苎麻COMT全长cDNA与杨树COMT基因的序列同源性达82%,其编码的氨基酸序列与杏的COMT氨基酸序列同源性最高,达93%。同时还检索到该氨基酸序列包含一个O-甲基转移酶的保守结构。     

马尾松幼苗PmMADS4基因的克隆及表达分析

MADS-box家族基因编码的转录因子,在植物、动物及微生物的发育过程中起着重要调控作用,本研究从马尾松幼苗转录组测序结果中筛选到1条具有完整开放阅读框的MADS-box基因序列,设计特异性引物并克隆获得该基因,通过生物信息学方法分析该基因的序列特征、编码蛋白的理化特性、结构域以及进化关系等,并应用荧光定量PCR技术分析该基因在马尾松幼苗不同组织中的表达活性。结果表明,克隆得到的MADS-box基因开放阅读框为672 bp,命名为Pm MADS4。Pm MADS4编码223个氨基酸,含有MADS保守域和K-box次级保守域。蛋白质理论分子量为24854.15 kD,理论等电点为7.83;其蛋白质结构主要由大量的α-螺旋(58.74%)和大量随机卷曲(31.84%)构成;亚细胞预测该基因主要在细胞核(43.5%)、线粒体(17.4%)、高尔基体(13.0%)和细胞质(13.0%)中发挥生物学作用。系统进化分析显示,Pm MADS4属于MADS-box家族基因中MIKC型的GMADS分支。组织特异性表达分析发现,Pm MADS4在马尾松幼苗的顶芽和茎中高表达,表达量分别是根部的239倍和123倍;在根部、初生叶和针叶中的表达量相对较低,表明Pm MADS4可能广泛参与马尾松幼苗地上部分分生组织的发育过程。本研究结果为Pm MADS4基因在马尾松幼苗生长发育调控方面的深入研究提供了数据基础。     

马尾松PmLFY和PmNLY基因的克隆与表达分析

本研究在前期马尾松转录组测序中获得两个LFY同源基因片段的基础上,克隆获得Pm LFY和Pm NLY基因全长,分别为1 164和1 212 bp,编码387和403个氨基酸。生物信息学分析表明,2个LFY同源基因都具有典型的FLO_LFY结构域,但Pm NLY基因缺失了XEL…XTL…XEL…拉链结构。同源性和进化分析表明,LFY和NLY基因分别单独分为一类,并且与针叶植物的亲缘关系非常近。表达分析表明,2个基因都为组成型表达,均主要参与了雌球花发育过程,并且Pm LFY还参与了球果发育。本研究为今后马尾松花发育机理研究提供理论依据。     

马尾松PmMADS13基因的克隆与表达分析

SOC1/TM3是MADS-box家族一员,它能介导多条开花途径的信号整合,从而调控开花的时间和花器官的发育。为了解SOC1类基因在马尾松生殖生长中的作用,从转录组测序结果中筛选到一条SOC1类同源基因,设计特异性引物,采用c DNA末端快速克隆(RACE)技术,获得该基因的全长cDNA序列为1 147 bp,包括666 bp的开放阅读框(ORF),共编码220个氨基酸,命名为PmMADS13。氨基酸序列比对分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端具有高度保守的SOC1 motif基序;进化树分析表明马尾松PmMADS13与油松的DAL9基因、辐射松的MADS9基因、火炬松的MADS13基因的亲缘关系最近,属于SOC1/TM3亚家族;RT-PCR分析显示,PmMADS13在马尾松生殖器官雌花、雄花中均有高表达,其次是茎端和针叶,在根部组织中的表达量最低。推测PmMADS13是参与马尾松成花的重要基因。     

陆地棉质体转录活性因子基因GhPTAC的克隆及其耐盐性分析

为了挖掘新的耐盐基因及调控途径，利用基因芯片技术及抑制性差减文库技术筛选到质体转录活性因子，通过RACE及RT-PCR技术克隆到该基因的cDNA全长，命名为GhPTAC。该cDNA全长1 564 bp，其中ORF 1 038 bp，推测编码345个氨基酸残基的多肽。生物信息学分析表明GhPTAC为拟南芥PTAC13同源基因，同源性60.6%。编码蛋白为转录活跃的染色体(TAC)的一个组分，参与叶绿体基因组转录终止/抗终止调节。Real-time PCR分析结果表明，GhPTAC受盐胁迫诱导上调表达，在耐盐材料中9806中表达水平明显高于盐敏感材料中S9612，这与芯片结果一致。     

油橄榄×尖叶木樨榄种间杂交种真实性的SSR鉴定

油橄榄种间杂交可拓宽现有油橄榄种质资源的遗传基础,其杂种真实性鉴定可为种间杂交技术改良和种质利用提供技术条件。云南省林业科学院以佛奥(Olea europaea cv. Frantoio)作母本、尖叶木樨榄(O.cuspidata)作父本,成功杂交育得子代。本研究利用14个在亲本间存在差异的油橄榄SSR标记,对3个种间杂交子代和1个疑似杂交种"欧莱雅"的杂种真实性进行了鉴定。结果表明,1个SSR标记(EMO90)仅在佛奥和杂交子代中有SSR-PCR扩增产物,而在尖叶木樨榄中无产物,表现为显性标记;其余13个SSR标记(Oli23,Oli26, GAPU01, GAPU59, GAPU71, DCA05, DCA07, DCA08, DCA15, DCA18, EMO2, EMO3, UDO09)为共显性标记,其中3个SSR标记(GAPU71, EMO2和EMO3)能够将子代杂合而亲本纯合的基因型直观进行呈现,明确证实了杂交种的真实性。本研究为今后油橄榄远缘杂交育种时杂种的早期鉴定提供了技术支持。     

大薯PR1基因在炭疽菌、激素处理下的表达分析

炭疽病是大薯种植过程中所遭受的最严重病害。为了探究PR1基因家族对炭疽菌的响应情况,本研究在前期转录组的基础上筛选了6个PR1基因,设置5组处理;炭疽菌处理、MeJA处理、SA处理、MeJA+炭疽菌处理、SA+炭疽菌处理,分别在处理1 d、2 d、3 d、4 d、5 d采用荧光定量PCR进行6个基因表达量差异分析。结果显示6个不同PR1基因在炭疽菌处理下都会使得其表达量增高,炭疽菌诱导下PR1-1基因5 d时表达量为6个基因中最高,达到峰值。炭疽菌+MeJA诱导下PR1-6表达量较高,4 d时达到峰值。炭疽菌+SA诱导下PR1-9在4 d表达量达到峰值。Me JA诱下PR1-6基因表达量较高,2 d时达到峰值。SA诱导下PR1-1基因2 d时表达量达到峰值,于6个基因中最高。由此可见,不同PR1基因对炭疽菌以及不同激素处理响应不同。     

广藿香法呢基焦磷酸合成酶基因(FPS)的克隆及生物信息学分析

为进一步阐明广藿香(Pogostemon cablin (Blanco) Benth.)中百秋李醇(Patchouli alcohol)生物合成的分子调控机制,本研究采用RT-PCR技术从广藿香叶片中克隆得到法呢基焦磷酸合成酶(farnesyl diphosphate synthase) FPS基因,并通过qRT-PCR技术分析FPS基因在广藿香幼苗期(扦插后60 d)与成熟期(扦插后240 d)叶片中的相对表达量。对克隆得到的广藿香FPS基因进行生物信息学分析,序列片段长为1 177 bp,其中包含1个长度为1 050 bp的开放阅读框,编码由349个氨基酸残基构成的蛋白质,与其它已知FPS氨基酸序列的唇形科植物一致性高达93.10%,与已知的米团花(Leucosceptrum canum Smith) FPS蛋白亲缘关系最近。预测FPS蛋白质分子质量约为40.09 kD,理论等电点(pI)为5.34,推测其为亲水性蛋白,无跨膜区且不含信号肽,属于类异戊二烯生物合成家族。qRT-PCR结果表明FPS基因在成熟期叶片中表达量高于幼苗期,与转录组数据分析结果一致。本研究结果为进一步研究FPS基因在广藿香中的应用,探究广藿香中百秋李醇生物合成途径中关键酶的表达模式及通过调控百秋李醇生物合成提高广藿香挥发油中有效成分含量提供了理论依据。     

广藿香幼苗期茎和叶的转录组数据组装和分析

本研究以石牌广藿香幼苗期茎和叶为样本,对转录组测序之后,共得到66 133 450条和65 148 526条reads序列。然后使用De novo拼接后把Unigene对比到各个数据库,经过对Unigene的统计分析,在有类似功能基因的92 974条Unigene中,有65 467条Unigene可注释到Nr数据库;有71 330条的Unigene可对比到KOG数据库,依据其功能信息将这些基因分成25类;有86 716条Unigene被发现与GO数据库中的基因具有相似性并将它们分为生物过程、细胞成分和分子功能3个大类共54个小类;以KEGG作为数据库参考比对到66 055条Unigene,并根据代谢通路将转录组数据分为137类,包括内质网蛋白处理、甘油磷脂代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、硫辛酸的代谢等。本研究将为广藿香的活性物质的生物合成与代谢、功能基因的发掘、分子标记的开发应用等研究提供依据。     

玉屏油茶炭疽病病原菌鉴定及同源性分析

油茶是贵州玉屏脱贫致富的重要产业,但近年来,炭疽病危害日益严重。为了防治油茶炭疽病,本研究采用林间病情观察、科赫氏法则验证、形态学鉴定及多基因分子鉴定的方法,对分离的3株炭疽病病原菌进行了系统鉴定。在ITS-CAL-GADPH 3基因所构建的系统发育树中,3株病原菌与ICMP10643*、ICMP-10646*两炭疽属模式菌株聚为一个独立的进化枝且置信度为99%,结合其形态特征,将其鉴定为山茶炭疽菌(Colletotrichum camelliae)。依据林间观察结果与玉屏油茶的生长发育规律,提出了防治油茶炭疽病的关键时间。玉屏油茶炭疽病种类的分子鉴定可为抗病种质的分子育种及该病的防治提供科学依据。     

血叶兰可培养内生真菌多样性

为了解血叶兰内生真菌的多样性,揭示其菌群群落结构及分布特征。本研究以霸王岭自然保护区野生血叶兰为研究对象,采用组织块分离方法,对血叶兰内生真菌进行分离鉴定和多样性的研究。结果表明:从血叶兰不同组织部位中共分离出来66株内生真菌,通过r DNA-ITS序列分析将其归为4纲18属,其中以刺盘孢属(Colletotrichum)为优势类群,占菌株总数33.33%;茎中分布的菌群和菌株数量均最高,分别占61.11%和36.26%,根部与茎段菌群都以刺盘孢属最多;不同组织中叶片的内生真菌的多样性指数(H’)和均匀度指数(E)最高,分别为2.75和1.19;茎与叶部位内生真菌相似程度最高,相似性系数为0.381。因此,血叶兰内生真菌资源组成丰富,不同部位中内生真菌分布及组成存在较大差异,但又有一定组织的专一性。     

大薯ERF基因家族的挖掘与特征

大薯属于薯蓣科薯蓣属,是热带和亚热带地区的一种重要的粮食作物,但其基础研究还较为薄弱。本研究基于公布的大薯转录谱序列和基因组序列,开展了对大薯ERF家族基因的挖掘和特征分析。共找到DaERF基因41个,其中14个DaERF有一个以上的外显子,其余的均为一个外显子。进一步的blastx分析发现30个DaERF基因具有保守的AP2结构域,依据AP2序列构建系统进化树,可将其分成5个亚家族。通过对AP2结构域的两个保守motif的位置和结合位点的分析,发现相同家族的ERF蛋白具有相似的结构特征。根据大薯转录谱分析DaERF在不同组织中的表达,发现一些DaERF的表达具有组织特异性,并且属于同一亚家族基因的表达具有相似性。我们对在块茎中具有高表达的DaERF-DaERF24基因,使用RT-qPCR验证其在不同组织的表达,结果与转录谱数据一致。本研究通过对大薯ERF转录因子家族特性的初步挖掘,为以后研究ERF家族全基因分布、ERF基因功能验证和薯块生长发育机理提供依据。     

不同氮源及微生物菌剂能提高油茶壳堆肥效果

为有效利用农林废弃物,开展对油茶壳堆肥效果的腐熟剂配方筛选试验。本研究利用正交试验设计将氮源和微生物菌剂进行混配成不同的处理,分别添加到油茶壳中进行堆沤发酵,使之腐熟后成为育苗基质。观察不同时间油茶壳腐熟的颜色、气味变化,测定腐熟过程中pH值、电导率(EC)、阳离子交换量(CEC)、C/N比等指标,对比分析添加不同氮源和微生物菌剂对油茶壳的腐熟效果,筛选出对油茶壳堆沤效果较好的腐熟剂配比。结果表明,在油茶壳堆体中添加氮源和微生物菌剂能加速堆体温度的升高,提高堆肥的肥料品质,有效促进种苗的生长发育。氮源是影响油茶壳腐熟发酵的主要因素,尿素比硫酸铵腐熟效果好,EM菌比酵素菌更能有效地促进油茶壳腐熟,C/N比为25∶1,比30∶1更容易腐熟。相比其他的氮源和微生物菌剂的处理,尿素+EM菌的组合对油茶壳的堆沤腐熟效果较好,成本低廉,能满足园林的育苗要求,可作为试验材料进行田间应用技术的研究与推广。本研究为进一步探索油茶壳堆肥腐殖化技术,为农林废弃物循环再利用和降低苗木栽培成本提供理论依据和技术指导。     

一株具有抗菌和抗肿瘤活性的诺丽内生真菌的鉴定

为研究一株诺丽内生真菌M50的抗菌和抗肿瘤生物活性并鉴定此菌株,本研究对实验室保藏的诺丽内生真菌M50,采用ITS rDNA测序鉴定内生真菌M50;以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌为指示细菌,采用滤纸片扩散法对其次生代谢产物的抗菌性进行测试;以新暗色柱节孢菌、辣椒疫霉、西瓜枯萎病菌和拟盘多毛孢为指示真菌,采用平板对峙法对其抑菌性进行测试;以肝癌细胞株SMMC-7721、Lewis肺癌、前列腺癌细胞株PC-3为指示癌细胞,采用MTT法对其次生代谢产物的抗肿瘤活性进行测试。内生真菌M50鉴定为Leptoxyphium fumago;金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌和枯草芽孢杆菌抑菌圈的大小分别为(13.16±0.22) mm、(12.06±0.31) mm、(7.89±0.17) mm和(11.05±0.22) mm;新暗色柱节孢菌、辣椒疫霉、西瓜枯萎病菌和拟盘多毛孢的抑制率分别为50.00%、18.36%、12.35%和46.91%;肝癌细胞株SMMC-7721、Lewis肺癌、前列腺癌细胞株PC-3的半抑制浓度分别为45.46μg/m L、53.33μg/m L、80.48μg/m L。说明内生真菌M50具有广谱的抗菌和抗肿瘤的生物活性。本研究为解决药源问题带来新的希望和契机,为开发诺丽新产品提供理论依据和技术支撑。     

剑麻悬浮细胞体系的建立

为了获取良好的剑麻悬浮细胞体系,以剑麻无菌幼苗嫩叶为诱导材料,对剑麻胚性愈伤组织的获得,建立细胞悬浮系和影响悬浮细胞增殖的主要影响因子进行了探讨。结果表明:幼叶在培养基为MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA上诱导的愈伤组织,经1～2次继代培养后获得了颗粒状、浅黄色的胚性愈伤组织;接种于液体培养基接种量为2 g (鲜重),继代周期为7 d,经4～5次继代震荡培养建立了细胞悬浮系,细胞生长符合"S"型曲线,细胞浓度可达6.1×105～4.6×106个/m L以上;在悬浮细胞生长前期,pH值明显下降,在细胞对数生长期,pH值略有升高,并趋于平缓;最适宜的细胞悬浮培养基为(MS+1.5 mg/L 2,4-D+4.0 mg/L6-BA+350 mg/L水解酪蛋白, 30 g/L蔗糖, pH值为5.8)。通过建立剑麻悬浮细胞培养体系的方法,为进一步应用于剑麻悬浮细胞转化体系和多倍体育种等研究。