含异位表达花生AhNCED1基因的拟南芥提高耐渗透胁迫能力

AhNCED1是干旱胁迫下调控花生ABA生物合成的关键基因。以pCAMBIA1301为基本双元表达载体,分别构建CaMV35S启动子和拟南芥AtNCED3基因启动子(AtNCED3p)驱动花生AhNCED1基因的2个植物双元表达载体p35S::ORF和pAtNCED3p::ORF,通过根癌农杆菌介导法将上述两个表达载体分别转化野生型和129B08/nced3突变体拟南芥,经潮霉素筛选和PCR鉴定分别获得35S::ORF-WT和A3p::ORF-B08转基因植株,RT-PCR证实花生AhNCED1基因已在转基因植株中稳定表达,并对野生型、129B08/nced3突变体和转基因拟南芥进行外源ABA敏感性和耐渗透胁迫能力分析。结果表明,129B08/nced3突变体对外源ABA的敏感性下降,而花生AhNCED1基因在拟南芥中的异位表达提高了对外源ABA的敏感性。在山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体种子的相对萌发率明显低于野生型的,而A3p::ORF-B08转基因拟南芥种子的相对萌发率与野生型的相当,显著高于129B08/nced3突变体的,且300mmolL–1山梨醇胁迫下,35S::ORF-WT转基因拟南芥种子的相对萌发率明显高于野生型的。在300mmolL–1山梨醇胁迫下,129B08/nced3突变体幼苗叶片高度黄化,根的形成和幼苗生长受到严重抑制,而A3p::ORF-B08转基因突变体与野生型相似,叶片仅轻度黄化,幼苗生长势良好;35S::ORF-WT转基因植株幼苗生长未受明显影响。这些结果说明,拟南芥129B08/nced3突变体对山梨醇诱导的非离子渗透胁迫有超敏性,异位表达花生AhNCED1基因能恢复该突变体对山梨醇的超敏性,提高拟南芥的耐渗透胁迫能力。     

转PvP5CS1基因拟南芥植株对干旱和盐胁迫的反应

为探索普通菜豆脯氨酸合成酶基因P5CS1在植物渗透胁迫中的作用,本研究应用农杆菌介导法,将PvP5CS1基因转入拟南芥,获得6株阳性转基因株系;通过检测转基因植株与野生型植株在干旱和盐胁迫下种子发芽率,幼苗脯氨酸含量、株系电导率、相对根长和成株死亡率,分析了PvP5CS1基因的表达对改善拟南芥抗渗透胁迫的效应。结果表明,在150 mmol L^-1 NaCl和150 mmol L^-1甘露醇渗透胁迫下,转基因植株平均相对发芽率分别是野生型的1.6倍和1.62倍;150、250 mmol L^-1甘露醇和150 mmol L^-1 NaCl处理下,转基因拟南芥植株平均脯氨酸含量分别是野生型的2.68、1.30和1.30倍;平均相对电导率分别是野生型植株的85%、77%和85%;平均相对根长分别是野生型植株的1.2、1.3和1.2倍;300 mmol L^-1 NaCl处理下,转基因植株的平均死亡率为42%,显著低于野生型(90%)(P<0.05);干旱胁迫下,转基因植株的平均死亡率为56%,显著低于野生型(70%)(P<0.05),说明PvP5CS1基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的抗旱性和耐盐性。     

CRISPR/Cas9技术在获取双突变体材料中的应用

为了研究含双MATH结构域基因sb3 与sb6 的功能,需要创制这2 个紧密连锁基因的双突变体。利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对拟南芥Col-0 中的sb3、sb6 基因进行特异性定点双敲除。通过PCR和Singer 测序验证,共获得10 株T0代转基因植株,其中5 株在目标片段上没有发生编辑;另5 株在sb3 基因上的目标序列都发生了编辑,在sb6 基因的目标序列上只有2 株发生了编辑。至此成功获得了sb3 与sb6 基因双敲除的突变体,且获得该突变的类型为核苷酸缺失突变体。这个双突变体的获得为进一步研究双MATH结构域基因在拟南芥中的功能奠定了良好的基础     

CRISPR/Cas9技术在获取拟南芥双突变体材料中的应用

为了研究含双MATH结构域基因sb3与sb6的功能,需要创制这2个紧密连锁基因的双突变体。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对拟南芥Col-0中的sb3、sb6基因进行特异性定点双敲除。通过PCR和Singer测序验证,共获得10株T0代转基因植株,其中5株在目标片段上没有发生编辑;另5株在sb3基因上的目标序列都发生了编辑,在sb6基因的目标序列上只有2株发生了编辑。至此成功获得了sb3与sb6基因双敲除的突变体,且获得该突变的类型为核苷酸缺失突变体。这个双突变体的获得为进一步研究双MATH结构域基因在拟南芥中的功能奠定了良好的基础。     

玉米ZmMGT0基因过表达载体的构建及拟南芥遗传转化研究

CorA/MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白在维持植物镁离子平衡中具有重要作用。为探讨一个表达受缺镁胁迫诱导的玉米MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白基因ZmMGT10在缺镁胁迫中的功能,构建了ZmMGT10的过表达载体并遗传转化拟南芥,获得了转基因拟南芥株系。同野生型拟南芥植株相比,过表达ZmMGT10增加了低镁胁迫生长下转基因植株的生物量、根长和叶绿素浓度。进一步研究表明,在低镁生长条件下,转基因植株的根和叶中积累的镁离子含量均明显高于野生型植株。此外,在低镁生长条件下,转基因植株根对镁离子的吸收能力明显强于野生型植株。结果表明,过表达ZmMGT10基因可以增强转基因拟南芥植株对低镁胁迫的抵抗。     

野生大豆碳酸盐胁迫应答基因GsMIPS2的克隆及功能分析

为挖掘野生大豆(Glycine soja L.G07256)耐碳酸盐关键功能基因,利用前期高通量转录组测序数据,从构建的碳酸盐胁迫基因表达谱中,选取了一个碳酸盐胁迫下显著上调表达的肌醇-1-磷酸合酶类基因。采用同源克隆的方法,获得该基因的全长cDNA,命名为GsMIPS2。实时荧光定量PCR结果显示该基因受碳酸盐胁迫诱导表达,并且其表达量具有组织特异性。将GsMIPS2基因转化拟南芥,并结合拟南芥中T-DNA插入突变体atmips2来验证其耐碳酸盐功能。结果表明,碳酸盐胁迫条件下,GsMIPS2超量表达拟南芥种子萌发率显著高于野生型,而拟南芥突变体atmips2种子萌发率显著低于野生型。上述结果表明,GsMIPS2基因在植物应答碳酸盐胁迫过程中起重要作用。     

OsRPK1基因过表达和RNA干涉对水稻苗期耐盐性的影响

水稻OsRPK1基因属于富含亮氨酸重复序列的类受体蛋白激酶,在盐胁迫下其表达量暂时升高后出现明显下降。前期研究表明, OsRPK1基因过表达会造成拟南芥非生物胁迫耐受性明显降低。本研究对OsRPK1基因在水稻中实现过表达和RNA干涉,进而对OsRPK1的抗逆性功能加以探究。结果表明, OsRPK1基因表达量增加时,水稻幼苗表现为耐盐性下降;RNA干涉则使水稻幼苗表现为耐盐性增加。盐胁迫后OsRPK1过表达植株脯氨酸含量低于野生型、MDA含量和相对电导率显著高于野生型,而OsRPK1-RNAi水稻植株的脯氨酸含量显著高于野生型、MDA含量和相对电导率显著低于野生型。因此, OsRPK1基因的表达量对水稻耐盐性具有明显影响,脯氨酸含量及细胞质膜受破损程度的改变可能是造成转基因水稻耐盐性变化的内在原因。本研究为进一步阐明OsRPK1基因的抗逆作用机制奠定了基础,对于通过调整该基因表达改良水稻的耐盐性具有重要意义。     

拟南芥AT2G14260基因功能及其表达特异性分析

拟南芥AT2G14260基因编码脯氨酸亚氨基肽酶，基因芯片表达谱数据显示该基因响应高盐、低温等非生物胁迫。为研究其功能和表达特性，本研究采用野生型和突变体植株pip-1进行低温、干旱和盐胁迫处理，结果显示在正常培养基中野生型与pip-1植株表型没有区别。而在逆境处理下pip-1植株的根比野生型明显短，且在干旱胁迫下，突变体的叶子比野生型植株明显变黄萎蔫。在正常环境、冷、干旱、盐胁迫下，野生型植株脯氨酸含量的平均值分别是突变体的1.11、1.23、1.10和1.34倍，这说明AT2G14260基因对提高非生物胁迫的耐性具有一定的作用。同时分离了该基因的启动子，构建了表达GUS基因的载体并转化拟南芥，结果表明该启动子在正常环境中不表达。胁迫处理时从两叶期开始在根、叶、茎中表达，到达花期后，干旱处理下的花瓣、花枝和冷处理下的花柱头中也有表达。GUS相对活性试验也证明对胁迫的响应能力。可见AT2G14260基因启动子是逆境胁迫诱导表达启动子，同时具有组织表达特异性，因此，AT2G14260基因及其启动子在转基因工程育种中具有潜在的应用价值。     

拟南芥swn突变体耐盐性的初步分析

SWN (Swinger)蛋白是多梳抑制复合体2 (polycomb repressive complex2, PRC2)结构的核心成分之一,为了研究SWN在拟南芥中耐盐胁迫方面的作用,我们分析了拟南芥突变体swn与野生型之间转录组水平的基因表达差异,高盐胁迫下的萌发实验,以及与盐胁迫响应基因RD20 (Responsive to desiccation 20)、SOS1 (Salt overly sensitive)和MAPK6 (Mitogen-activated protein kinase)的表达。结果显示,GO富集分析表达上调的基因,共富集到20个GO通路,其中响应盐胁迫通路(Respond to salt stress)富集程度较高;在高盐胁迫下,swn表现出比野生型更高的萌发率,幼苗生长情况也优于野生型;盐胁迫响应基因RD20、SOS1和MAPK6表达量也更高。本研究表明,swn突变体对盐的耐受性强于野生型,SWN基因在拟南芥抗盐过程中发挥负调控作用。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除OsEIL1和OsEIL2基因改良水稻耐盐性

为了培育耐盐水稻品种,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在水稻品种东农427的耐盐负调控基因OsEIL1和OsEIL2设计1个敲除靶点对其进行同时敲除。通过PCR和测序的方法,在T_0共检测出了5个突变单株,其中有1株为双基因同时突变的植株。在该植株的T_1株系中,获得了4株双基因纯合突变且不含T-DNA元件插入的植株。在T_2进行苗期耐盐性鉴定,成熟期考察农艺性状指标。结果表明,在苗期200 mmol/L NaCl溶液处理5 d后,突变体植株的鲜质量和干质量显著高于野生型植株,地上部及地下部钠离子含量均显著低于野生型植株,钾离子含量与野生型植株无明显差异。恢复7 d后,突变体植株幼苗存活率(75.0%)显著高于野生型植株(8.3%)。在成熟期,突变体的主要农艺性状未发生明显变化。综上,利用CRISPR/Cas9技术对水稻品种东农427进行了耐盐改良,为耐盐水稻品种的培育提供了理论和材料基础。     

温度对小果博落回种子萌发的影响与血根碱合成基因表达分析

博落回属植物属于罂粟科,包括两个种:博落回Macleaya cordata (Willd.) R. Br.与小果博落回Macleaya microcarpa (Maxim.) Fedde.。博落回属植物中含有一些重要的药用活性成分。一些包含博落回提取物的产品广泛用于饲料添加剂和其他领域。当前对于博落回属植物资源的研究主要集中于博落回,而对小果博落回资源的研究较少。主要是由于小果博落回无菌苗较难获取,使得遗传转化等方面的研究很难进行。本研究在5个不同温度下筛选出小果博落回最优的萌发温度,并且分析了3个不同时期的小果博落回无菌苗中血根碱合成相关基因的表达情况。除此以外,还比较了同一时期的小果博落回与博落回的根、茎、叶组织中的血根碱合成相关基因的表达情况,为下一步小果博落回的资源开发提供了前期研究基础。     

光合作用信号途径调控陆地棉矮化的机理研究

【目的】了解光合作用信号途径基因调控陆地棉矮化的机理。【方法】以现蕾期陆地棉矮化突变体LA-1及其近等基因系LH-1茎尖为材料,通过同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, i TRAQ)结合液相质谱串联(LC-MS/MS)的定量蛋白质组学技术及定量反转录-聚合酶链式反应(Quantitative reverse-polymerase chain reaction, qRT-PCR)技术,分析两种材料中蛋白水平及m RNA水平基因表达情况,并通过生理生化方法检测两种材料光合能力差异。【结果】光合作用信号途径差异表达蛋白PsbO、PsaE、PsaH、PetF-1、PetF-2在LA-1中表达量下调,PetC和delta表达量上调。m RNA水平,除delta基因在两种材料中表达量无显著差别外,其它基因与蛋白水平具有同样的表达趋势。现蕾后,LA-1的净光合速率(P_n)、气孔导度(Cond)显著小于LH-1,蒸腾速率(Tr)极显著小于LH-1,而胞间CO2浓度(Ci)无显著差异。与LH-1相比,LA-1的实际光化学效率(Y_Ⅱ)、光系统Ⅱ(PS Ⅱ)的潜在活性(F_v/F_0)显著减少,叶绿素荧光非光化学猝灭(NPQ)显著增大。【结论】陆地棉矮化突变体LA-1的矮化与光合作用信号途径存在相关性,为进一步研究LA-1矮化的分子机理及棉花的矮化育种提供基础。     

马铃薯晚疫病菌应答WRKY基因的结构功能预测与植物表达载体构建

WRKY是一类广泛参与高等植物各种抗逆调控活动的转录因子,可以通过激活下游相关信号转导途径调节自身的应激反应,进而增强植物抗逆性。本研究通过RNA-Seq从马铃薯(Solanum tuberosum)中筛选出一个晚疫病菌诱导WRKY转录因子基因StWRKY。采用RT-PCR技术获得该基因CDS全长,并对其进行序列分析及结构功能预测。根据StWRKY蛋白序列进行同源性搜索,得到与其蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列,使用MEGA7软件对St WRKY蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建了系统进化树。利用在线工具ProtParam对StWRKY进行氨基酸理化性质分析;利用SMART在线工具进行蛋白序列分析;利用SWISS-MODEL在线工具和PredictProtein在线平台分别对StWRKY蛋白二级结构和三级结构进行分析。结果表明,StWRKY核苷酸序列CDS全长为957 bp,编码含318个氨基酸的蛋白质,预测蛋白分子量为36.17 k D,等电点为6.49。既不是分泌蛋白也不是膜蛋白,未发现跨膜区、信号肽和复合螺旋区。StWRKY三维空间结构主要由无规卷曲以及β-折叠组成。通过XcmⅠ酶切、连接将StWRKY装载到pCXSN载体上,构建了该基因的超表达载体pCXSN-StWRKY。StWRKY基因的克隆,为进一步从分子水平上验证其抗晚疫病的生物学功能以及揭示马铃薯生物胁迫抗逆机制奠定基础,并为马铃薯抗病育种提供新的基因资源。     

MAS育种改良籼稻恢复系R747及其杂交种稻瘟病抗性

为了改良籼稻恢复系R747及其杂交种的稻瘟病抗性,以携带广谱抗稻瘟病基因Pi9的籼稻品系75-1-127为供体亲本,以R747为受体及轮回亲本,利用Pi9基因内功能标记,开展分子标记辅助选择育种实践。获得了如下主要结果:室内接种试验表明,75-1-127与R747对来自国内外不同稻区的24份稻瘟菌菌株的抗菌谱差异显著,抗性频率分别为91.7%和41.7%,两亲本在田间自然病圃苗瘟抗性表现分别为高抗和高感;根据Pi9基因序列信息开发了一个共显性多态标记SPL-1,该标记在75-1-127和R747基因组中分别扩增出一条745 bp和一条850 bp的条带,标记基因型对稻瘟病抗感表型的选择效率为100%;从BC6F3株系中遴选出一个高抗苗瘟的改良恢复系R747-Pi9,并用它与不育系培矮64S、P88S和桃1A分别配制出高抗稻瘟病的杂交种;利用分布于水稻全基因组不同位点的220个SSR标记,分析了改良抗病恢复系R747-Pi9与受体亲本R747的遗传背景差异,结果表明R747-Pi9对R747的背景回复率为0.94。本研究通过分子标记辅助选择和连续回交育种,成功定向改良了恢复系R747及其杂交种的稻瘟病抗性。     

黄金茶CsDAM2基因克隆及其功能分析

休眠是通过植物体内相应基因的表达调控机制,使植物芽停止生长,以适应外界低温、短日照等不良环境条件的结果。茶芽打破休眠的早晚,密切关系到茶树经济生产的效益。为进一步掌握茶树芽休眠与解除的分子机理>本研究克隆了可能与黄金茶发芽早相关的转录因子(dormancy associated MADS-box CsDAM2),并在烟草中过表达CsDAM2,对CsDAM2转基因烟草和野生型烟草进行低温处理。结果表明,在相同处理条件下,随着温度的降低,同野生型烟草比较,转基因烟草电导率增加幅度小,并且叶绿素荧光值降低率低,说明在抗寒性能上,转基因烟草具有显著优势,进而一定程度上证实了 CsDAM2具有提髙茶树抗寒性的作用。本研究结果为进一步揭示茶树芽休眠与解除的分子机理提供了科学依据。     

转录组学技术在茶树抗逆性的研究进展

茶树(Camellia sinensis)属山茶科山茶属,是一种重要的木本经济作物,其叶片富含多种活性物质,其中尤以儿茶素、咖啡因、茶氨酸及其他游离氨基酸等活性成分对茶叶品质有重要影响。逆境胁迫是影响茶树生长发育、产量及品质的重要因素,人们对茶树应答逆境胁迫的分子机理越来越关注。转录组学作为功能基因组学的重要组成部分,它从RNA水平上全面研究物种的基因表达情况。利用该技术研究逆境胁迫下茶树基因表达的情况,有利于阐明茶树对逆境胁迫的应答机理。本综述主要介绍应用转录组学技术研究茶树应答生物胁迫和非生物胁迫(干旱,温度,盐碱,重金属等)的进展,以期为茶树抗逆性分子机理的研究提供理论参考。     

植物串联CCCH锌指蛋白RR-TZF家族研究进展及生物信息学分析

典型的串联CCCH型锌指结构蛋白(tandem CCCH zinc finger proteins, TZFs)含有由18个氨基酸分隔的二个串联CCCH motifs (C-X7-8-C-X5-C-X3-H、C-X5-C-X4-C-X3-H)。富含精氨酸的RR-TZF蛋白是植物特有,研究表明RR-TZF蛋白通过介导RNA的降解来调节基因的表达水平,影响植物的生长发育以及胁迫反应。本研究主要综述了植物RR-TZF蛋白在生长发育及胁迫反应中的功能及作用机制等;同时利用生物信息学手段对RR-TZF蛋白进行聚类分析,系统地分析了RR-TZF蛋白从低等植物到高等植物中的进化与保守性,并展望了未来可能的研究方向。为探究CCCH型锌指结构蛋白家族基因在作物中的具体功能及其应对非生物胁迫的分子机制研究提供了重要的理论依据。     

中国南瓜（C.Moschata）F2群体分子标记偏分离的遗传分析

本研究以中国南瓜A-3与B-5构建的F2群体为材料,对果实长棒型Is和果皮全黄yf形态标记及具有多态性的87对引物进行分析。研究结果显示:89个标记中,在p<0.01显著水平上,有5个标记发生偏分离,频率为5.6%,在p<0.05水平上,有12个标记发生偏分离,频率为13.5%;偏分离标记成簇或者单个分布在9个遗传连锁群上,成簇分布的热点区域分布主要分布在LGp2、LGp6、LGplO连锁群上,其中11个标记偏向父本B-5,2个标记偏向杂合体,3个标记偏向双亲,分别占总偏离标记的64.70%, 17.65%和17.65%。本研究分析了偏分离产生的原因,推测配子体选择可能是多态性位点产生偏分离的重要因素。     

外源物质调控芥蓝幼苗MAM3基因表达及其生物信息学分析

萝卜硫苷的水解产物(萝卜硫素)对人体具有很强的抗氧化和防癌抗癌功效。本研究利用亚硒酸钠和茉莉酸甲酯处理芥蓝7 d幼苗,探究其对萝卜硫素含量及MAM3基因表达量的影响,并对MAM3蛋白进行生物信息学分析,以探寻萝卜硫素合成代谢过程的分子机理。结果显示,硒和茉莉酸甲酯处理都能提高芥蓝幼苗萝卜硫素水平,茉莉酸甲酯使萝卜硫素水平极大提高,且MAM3基因在茉莉酸甲酯的刺激下表达量与萝卜硫素水平一致。通过克隆所得MAM3基因测序发现,其开放阅读框序列1 518 bp,可编码505个氨基酸。通过一系列在线软件对MAM3蛋白进行生物信息学分析,预测MAM3蛋白为稳定的亲水蛋白,隶属于HMGL-Like大家族,是一种叶绿体蛋白,MAM3蛋白有58个磷酸化位点,且预测其蛋白结构元件中30.50%为α-螺旋、47.52%为随机卷曲、21.98%为延伸链;通过氨基酸序列多重比对发现,其与欧洲油菜、甘蓝有高度同源性。该结果证明,MAM3基因在萝卜硫素合成过程中起着重要作用。本研究结果为高萝卜硫素芥蓝品种的选育提供实践依据;对MAM3蛋白的生物信息学分析,为进一步深入研究MAM3基因功能打下理论基础。     

马铃薯块茎发育期主要植物激素的动态变化

为了明晰几种主要的植物激素在马铃薯块茎形成中的作用,本研究采用LC-MS/MS法测定了马铃品种‘PB06’及品种‘会-2’块茎发育不同时期叶片、匍匐茎/块茎组织中植物激素ABA、GA3、JA和IAA含量的动态变化。结果显示,随着块茎的发育,匍匐茎/块茎中ABA及JA含量增加;叶片中ABA含量逐渐增加,JA含量先上升后下降,两个品种变化趋势相同。GA3的积累随着匍匐茎的膨大而下降;IAA含量峰值出现在匍匐茎膨大时,并且在之后匍匐茎的膨大中仍然维持高含量水平。表明,IAA及GA3对匍匐茎的伸长是必要的,ABA、JA是诱导块茎形成的正调控因子,GA3为负调控因子。该研究结果对开展植物激素调控块茎形成机理的研究具有重要的支撑作用。