通过优化gRNA设计提高CRISPR/Cas9系统中基因编辑效率的方法

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于动物、植物、真菌、细菌的新一代基因定点编辑技术,如何提高g RNA的编辑效率是该技术的关键点也是许多研究者关注的焦点。本研究利用CRISPR/Cas9技术对番茄miR167a前体序列进行基因编辑,根据番茄miR167a前体序列在线设计候选g RNA,同时结合体外编辑检测的方法筛选出能够在体外成功编辑的g RNA-G1,把其连接到含有荧光标记的pP1C.1C表达载体,转化番茄子叶,产生愈伤组织数116个,得到5个含有表达载体的材料,经测序发现,其中3个材料发生了编辑。结果表明,通过体外检测和在线软件设计相结合的方法来快速检测g RNA的编辑效率,能筛选出最优的g RNA用于载体的构建,与未采用体外编辑检测来设计g RNA的方法相比,显著提高了CRISPR/Cas9的编辑效率。本研究通过优化g RNA,创新了一种高效利用CRISPR/Cas9进行基因编辑的方法。     

基于CRISPR/Cas9技术的水稻OsARF12突变体的构建

为研究水稻生长素响应因子OsARF12在水稻生长发育中的作用,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术,设计OsARF122个不同外显子突变靶点,化学合成包括突变靶点的特异性序列,并与中间载体sgRNA连接进而与Cas9终载体重组获得OsARF122个不同突变靶点的表达载体.选取测序成功的单一克隆,利用农杆菌介导法导入粳...     

杜梨PbGID1家族基因克隆、CRISPR/Cas9载体构建及遗传转化

为明确杜梨赤霉素受体(GID1)的生物学功能,以杜梨为试材,通过同源克隆方法得到PbGID1s基因,利用生物信息学分析软件构建基因结构并设计靶位点;利用酶切-连接方法将带有靶点的sgRNA表达盒构建至CRISPR/Cas9表达载体上;通过农杆菌介导方法,将CRISPR/Cas9表达载体转化至杜梨子叶中。结果表明,在杜梨基因组中克隆得到4个PbGID1s,分别命名为PbGID1b-1、PbGID1b-2、PbGID1c-1、PbGID1c-2,基因结构分析显示该家族基因均由2个外显子和1个内含子组成;氨基酸序列比对发现,PbGID1s均具有GID1家族所特有的HGG和GXSXG保守结构域;将含有5个靶位点的sgRNA表达盒成功构建至pYLCRISPR/Cas9P_35S-N植物表达载体上,可同时对该家族4个基因进行编辑;杜梨遗传转化试验结果表明,共计浸染595粒杜梨子叶,获得抗性芽176个,阳性植株33株,转化效率达到5.55%。成功构建了可以同时靶向杜梨PbGID1s家族基因的CRISPR/Cas9载体,通过农杆菌介导,成功将该载体转化至杜梨子叶,并获得阳性植株。     

基于棉花U6启动子的海岛棉CRISPR/Cas9基因组编辑体系的建立

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是基因功能研究的一种强有力的工具, 目前已在许多生物体中成功实现内源靶向基因的突变。利用已克隆的海岛棉新海16的2个U6启动子, 分别构建带有新海16内源基因(GbGGB和GbERA1)靶位点DNA片段的CRISPR/Cas9基因编辑载体。以新海16的胚性愈伤组织为供试材料, 制备海岛棉的原生质体。通过PCR方法大量富集构建好的CRISPR/Cas9基因编辑载体的核心片段(包括GbU6::sgRNA和CAMV35S::Cas9两部分), 并利用PEG法转化海岛棉的原生质体。对原生质体基因组DNA进行酶切后PCR, 成功检测到内源靶基因的突变现象。对PCR产物进行克隆测序, 结果显示序列突变的类型主要以碱基替换为主, 少数为碱基缺失。结果表明基于海岛棉U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统能在海岛棉中实现靶向基因编辑的功能, 为棉花功能基因组学研究提供了重要的技术基础。     

基于CRISPR/Cas9系统构建拟南芥EXPA多基因编辑表达载体

CRISPR/Cas9系统是一种由sg RNA及Cas9核酸酶组成的适应性免疫系统,已被成功运用于多种植物基因组编辑。扩展蛋白(expansin, EXP)是一类可以使细胞壁伸展和松弛的细胞壁蛋白,对植物的各个组织生长发育都有着重要的作用,由EXPA、EXPB、EXLA和EXLB 4个不同的基因家族组成。本研究以拟南芥的EXPA基因为例,通过CRISPR/Cas9系统构建拟南芥EXPA多基因编辑的表达载体,并利用农杆菌介导CRISPR/Cas9表达载体的方法转化拟南芥,以创制拟南芥扩展蛋白多基因突变体,为后续的研究提供突变体材料。     

中国鹅掌楸纤维素合酶的CRISPR/Cas9基因敲除系统的gRNA表达载体构建

CRISPR/Cas系统最早发现于细菌,对入侵的病毒或噬菌体DNA具有免疫作用。基于CRISPR/Cas的免疫机制,设计开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统已经成为真核生物基因编辑的主流工具,在拟南芥、水稻等高等植物的基因组功能研究中已经广泛应用。本研究以中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)为研究对象,首次构建了具有表达中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)gRNA(guide RNA)的CRISPR/Cas9基因敲除系统,以LcCESA1基因外显子5'端的第一个外显子区域的GN19NGG序列设计gRNA引物;以p201N-Cas9为载体,Gibson Assembly誖Master Mix为连接酶,通过Gibson Assembly连接技术,将CESA1-gRNA连入p201N-Cas9中,获得p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体。根据载体中插入序列,设计了两对检测引物,经PCR鉴定,均获得了相应大小的序列;测序分析进一步证实确认gRNA已经完整准确地连入载体。p201N-Cas9-CESA1-gRNA载体能对CESA1基因进行定向编辑,对后续研究鹅掌楸纤维素合酶的基因功能具有重要意义。     

基于Cas9-Free的拟南芥ALB3基因编辑载体构建及验证

建立一种高效安全的基因定点编辑体系,为研究植物的光合作用途径以及生理代谢过程提供理想材料。针对拟南芥靶基因ALB3设计2个sgRNA,引导Cas9蛋白识别PAM位点,从而实现ALB3基因的大片段敲除;将荧光筛选标记基因mCherry组装到CRISPR/Cas9载体中,构建一种带有荧光筛选标记的CRISPR/Cas9载体;利用农杆菌转化法转化拟南芥,对其后代进行筛选验证,在倒置荧光显微镜下挑选便可获得Cas9-Free的纯合突变种子。测序结果表明,含有可视化筛选标记基因的拟南芥ALB3基因编辑载体序列与预期一致,由此证明载体构建成功;通过倒置荧光显微镜观察,发现阳性转化拟南芥T_0种子含有红色荧光标记,表观观测以及分子鉴定表明T_1植株得到纯合突变后代,条带大小小于野生型,白化突变性状明显。挑选T_1不含荧光的种子进行培育得到的T_2植株,经分子鉴定发现已成功实现Cas9-Free且植株白化。本研究成功构建了一种带有荧光筛选标记且可实现拟南芥ALB3基因敲除的CRISPR/Cas9载体,并获得Cas9-Free的纯合突变植株,为拟南芥基因高效编辑载体的构建以及Cas9-Free基因编辑后代的获得提供了借鉴与参考。     

靶向BnSVP的CRISPR/Cas9基因组编辑载体的构建

基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术是一种新兴的分子修饰工具,可实现基因组特定位点碱基的缺失、插入或替换,造成基因功能丧失,现已广泛应用于基因功能的研究。为深入探讨甘蓝型油菜中Bn SVP的生物学功能,以中双11号基因组(甘蓝型油菜参考基因组,v4.1)中的4个Bn SVP为靶标基因,并针对不同染色体上的Bn SVP基因,应用CRISPR-P 2.0软件共设计了12条特异sg RNA种子序列,以实现4个Bn SVP同源基因的全部或部分敲除;以p YLCRISPR-Cas9P35S-H为基本载体,以At U3b或At U3d为sg RNA转录启动子,采用Golden gate cloning技术分别组装构建了6个双靶点CRISPR/Cas9植物表达载体。测序结果表明,6个CRISPR/Cas9植物表达载体各sg RNA表达盒DNA序列正确,双靶点组装顺序无误。研究结果为进一步原生质体瞬时表达和农杆菌介导的油菜遗传转化奠定了基础,同时也为应用CRISPR/Cas9基因组编辑系统研究植物多拷贝同源基因的功能提供参考。     

CRISPR/Cas9系统及其在粮油作物遗传改良中的研究进展

CRISPR是细菌或古生菌对入侵到体内的病毒,通过核酸特异性识别、Cas9蛋白酶切割产生的一种天然免疫系统。基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术,通过sgRNA介导和Cas9蛋白切割实现对靶基因的定点编辑。因其操作简便、编辑效率高、适用范围广的特点,迅速成为研究植物、动物、微生物基因功能的重要手段。同时,随着大量基因组信息和相应数据库的广泛建立,CRISPR/Cas9技术利用反向遗传学,配合生物信息技术,成为遗传改良、创新特异种质的一种极有效的新手段。本文主要对CRISPR/Cas系统的基本原理、CRISPR/Cas9基因编辑技术的作用机制,以及CRISPR/Cas9技术在粮油作物遗传改良、品种选育研究中取得的进展进行了综述,为遗传育种工作者利用该技术进行遗传改良和品种优化升级育提供有效的参考。     

CRISPR/Cas9系统在作物基因组编辑中的研究进展

CRISPR/Cas9基因组编辑技术通过向导RNA的介导和Cas9蛋白的切割来实现对靶基因的定点编辑,由于该技术简便、高效的特点,在作物基因组编辑中被广泛使用。本研究主要对CRISPR/Cas9系统的组成与分类,工作原理以及g RNA构建方法进行了系统的介绍,并针对该系统存在的脱靶效应,总结了相应策略。同时,总结了在作物基因组编辑中CRISPR/Cas9系统的应用及研究进展情况,并对CRISPR/Cas9系统在作物基因编辑研究的方向做了展望,为作物的基因功能研究和分子设计育种提供参考。     

基于SNP标记的大麦遗传多样性与群体遗传结构分析

为了评价大麦种质组合的配制,本研究对384份不同来源大麦种质资源的农艺性状和遗传背景进行分析,并选取了分布于大麦7条染色体上具有多态性的6 454个SNP标记进行群体遗传结构分析,结果表明:(1) 384份参试大麦种质资源的6个农艺性状中,除分蘖数外,其他性状表现基本接近正态分布。6个参试农艺性状统计量指标在环境、基因型、基因型与环境互作效应方面均达到极显著水平(p<0.01)。(2) SNP标记基因分型共分为8种类型。其中A/G类型的最多为2 386个;T/A类型的最少,为104个。平均各条染色体上分布922个,其中4H染色体上最多,为1 288个;1H染色体最少,为642个。(3)遗传结构分析结果显示,384份参试材料分为3个亚群,第1亚群有48份材料,第2亚群有149份材料,第3亚群有187份材料。本研究结果为分子标记辅助育种提供科学依据。     

小黑麦花药培养效果研讨

为完善小黑麦花药培养技术体系,本研究在项目组前期研究基础上,研究了低温(4℃)预处理时间(15 d, 20 d, 25 d, 30 d, 35 d, 40 d)和高温(32℃)培养时间(0 d, 1 d, 2 d, 3 d)对小黑麦花药培养的影响,以及小黑麦不同基因型(石大1号小黑麦品种,甘农1号小黑麦品种,小黑麦品系P4, TZ3, TZ10, TZ12, TZ23, TZ25, TZ26)的花药培养效果。结果显示:小黑麦幼穗低温4℃预处理25 d时,花药的出愈率最高达17.27%。花药高温32℃培养2 d时,石大1号出愈率最高(56%),而P4不进行预处理时最高;小黑麦基因型间花药出愈率及绿苗分化率有显著差异,TZ26、TZ25和P4的出愈率及绿苗分化率显著高于其余材料,石大1号的出愈率较高,但绿苗分化率低。本研究结果为小黑麦单倍体育种提供科学依据。     

安康市城区绿地芳香植物多样性分析

通过调查安康市主城区不同类型城市绿地中芳香植物的树种资源应用情况,分析其种类构成、重要值、多样性、乔灌比等指标,得出安康市适应种植的芳香植物品种,为安康市资源优化配置提供理论参考。采用野外调查和资料查阅相结合的方法,对研究区内各样地芳香植物的种类构成、物种多样性等进行实地调查。安康市主城区共有芳香树种60种22科42属,乡土树种51种,主要优势种为香樟、桂花、红叶石楠等;乔灌比值为1.45;常绿与落叶比值为0.93;芳香乔木中Margalef、Shannon-Wiener、Simpson、pielou指数分别为2.793、2.314、0.841、0.733,芳香灌木各指数分别为1.960、1.703、0.711、0.635;芳香程度以芳香48种为主,香味来源以花香51种为主。通过调查和数据分析,不同的城市绿地所含芳香植物品种多样性均存在不同。结合安康市未来宜居环境建设的发展趋势,对安康市园林城市建设中芳香植物的应用提出改善策略。     

干旱胁迫对不同品系藜麦内黄酮和抗氧化性的影响

利用不同浓度的PEG溶液模拟干旱胁迫,分析了干旱胁迫下不同品系藜麦叶片中黄酮类化合物合成上游的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羟基化酶(C4H)及4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)此3个关键酶的活性以及种子内黄酮含量和清除DPPH·能力,探究干旱胁迫对不同藜麦种子内黄酮合成以及体外抗氧化活性的影响。结果表明:(1)随着干旱胁迫增加,三种酶活性均成先增后降趋势,但不同酶之间存在差异,PAL和4CL在5%PEG胁迫下达到最大,藜麦品系NK1、NK2和NK5的C4H活性在10%PEG时达到最大,但NK3和NK4在5%PEG胁迫下达到最大;在CK和5%PEG胁迫下藜麦品系NK3的3种酶活性较高,但在10%PEG和15%PEG胁迫下酶活性迅速降低。(2)随着干旱胁迫加剧,各品系藜麦种子内黄酮含量呈先上升后下降的趋势,在CK和5%PEG胁迫下,藜麦品系NK3种子黄酮含量最高分别为2.94 mg/g和3.61 mg/g,在10%PEG和15%PEG胁迫下,NK5种子黄酮含量最高分别是2.92 mg/g和2.66 mg/g。(3)抗氧化试验表明,各品系藜麦种子内黄酮对DPPH·的清除率在5%PEG胁迫处理时达到最大,NK1、NK2、NK3、NK4和NK5清除率分别是88.52%、87.65%、90.36%、86.53%和89.38%,其中NK3 IC50(半抑制浓度)最大为9.871μg/mL。本研究结果为理解藜麦体内黄酮合成体系和抗氧化剂资源的筛选提供理论依据。     

玉米苗期在盐胁迫下耐盐相关QTL分析

通过对玉米耐盐性状基因的QTL定位,找到耐盐性状控制位点在染色体上的位置,来帮助耐盐玉米品种的选育和基因的克隆。本研究选用耐盐自交系8723和盐敏感自交系P138为材料构建的F2群体,通过Jionmap 4.0软件对F2群体构建分子遗传连锁图谱。构建了一个包含有174个SSR标记位点的分子遗传连锁图谱,平均分布在玉米的10条染色体上共2 764.3 cM,标记区间平均间距为15.88 cM。通过对表型数据的分析,对玉米的4个植株性状进行了QTL定位。结果共检测到8个与玉米苗期耐盐性状相关的QTLs,分别位于2号、4号、6号、9号染色体上。本研究结果为幼苗在盐碱地正常生长提供科学依据。     

外源NO对PEG胁迫下苜蓿幼苗抗氧化酶及同工酶的影响

为研究外源NO对聚乙二醇-6000(PEG)拟干旱胁迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性及其同工酶的影响。本试验用一氧化氮供体硝普钠(SNP)或一氧化氮清除剂c-PTIO对干旱胁迫下紫花苜蓿幼苗进行处理,并采用分光光度法和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对抗氧化酶及其同工酶研究。结果表明:SNP+PEG处理能显著提高紫花苜蓿幼苗的地上部干重和根干重,分别增加了100.00%、61.54%;而不同处理的SOD、POD、CAT活性都随着处理时间的延长呈现先升高后降低的趋势,在处理的第4天,SOD、CAT活性达到最大值,在处理的第6天,SOD活性达到最高。在处理的第4天,SNP+NO处理POD活性降低了32.18%,而POD、CAT活性升高了9.81%、43.37%,说明SNP能够通过不同程度影响抗氧化酶活性而缓解PEG对紫花苜蓿的氧化损伤。PEG+c-PTIO则抑制了紫花苜蓿幼苗的抗氧化酶活性。不同时间各处理紫花苜蓿幼苗POD同工酶都呈现9条酶带,其中P1、P5、P6酶带不同处理之间酶活性明显不同;SOD同工酶在处理过程中产生相对迁移率分别为0.610、0.470和0.345的3条酶带。PEG+SNP处理酶带颜色较深。而CAT同工酶形成了两条相对迁移率分别为0.322、0.259的酶带,各处理之间无明显的变化。说明外源SNP能有效的缓解PEG对紫花苜蓿幼苗造成的氧化损伤,促进植物的生长。本研究结果为紫花苜蓿的耐旱生理机制研究提供了一定的科学依据。     

PEG干旱胁迫对秦巴山区核桃‘清香’光合日变化的影响

本研究通过人工喷施PEG6000模拟水分条件(CK, 5%, 10%, 15%, 20%),测定核桃苗木‘清香’叶片蒸腾速率(Tr)、胞间二氧化碳浓度(Ci)、气孔导度(Cond)、净光合速率(Pn)、水分利用效率(WUE)日变化进程。结果显示:不同水分条件下‘清香’Pn、Tr、和Cond的日变化均呈现先升后降的单峰曲线;Ci和WUE日变化呈现先降后升的单峰曲线;不同水分条件下‘清香’的Pn、Tr、Cond、Ci和WUE是随着PEG胁迫浓度的递增而降低;‘清香’在受到水分胁迫时,叶片PSⅡ原初光能转换效率下降,光合速率受到气孔和非气孔限制因子影响,并且发生"光合午休"现象。但轻度干旱的水分条件即PEG胁迫浓度为5%利于光合作用。本研究为揭示核桃苗木‘清香’响应水分变化时的光合日变化及丰富其水分调控机制资料方面提供了参考依据。     

四倍体棉花GAE基因家族的鉴定及其在棉纤维发育中的表达分析

【目的】通过对陆地棉及海岛棉GAE基因家族进行全基因组分析,为深入研究GAE基因家族在棉纤维发育中的功能提供理论依据。【方法】利用生物信息学分析软件,对GAE基因家族进行全基因组鉴定,根据转录组数据分析在纤维发育过程中的表达规律。【结果】陆地棉GhGAE家族包含21个成员,海岛棉GbGAE家族有22个成员,分为3个亚组,多数Gh GAEs和Gb GAEs基因没有内含子,共分布在12条染色体上。GAE氨基酸序列保守基序有4个,保守性较强,且GAE蛋白均定位于高尔基体膜。根据GAEs在陆地棉、海岛棉纤维发育不同时期的表达变化,将其分为纤维起始期高表达、纤维伸长期高表达、次生壁增厚期高表达、全时期低表达4类模式。其中GhGAE01、GhGAE02、Gh GAE11、Gh GAE12在陆地棉中高水平表达,GbGAE01、Gb GAE02、GbGAE11、Gb GAE12在海岛棉中高水平表达,推测这些基因可能在纤维发育过程中发挥着重要作用。【结论】上述结果为研究GAE基因家族在棉纤维发育中的功能提供了参考依据。     

3个品种紫斑牡丹胚培养及幼苗生长的探究

为了探讨出适用于不同栽培环境的紫斑牡丹快繁体系,满足紫斑牡丹日益增长的市场化与商业化需求。本研究以3种不同栽培环境下的紫斑牡丹(Paeonia rockii)-‘雪莲’、‘蓝荷’和‘粉荷’的种子为试验材料,以正交试验的极差分析和方差分析研究在不同浓度激素配比下3个品种紫斑牡丹离体种胚萌发及生根状况,筛选出最佳激素配比的培养基。结果表明:(1)在胚培养的启动阶段,6-BA的最适浓度为0.5 mg/L,水解乳蛋白(LH)比水解酪蛋白(CH)更适合于离体胚的萌发,得出最适3种不同栽培环境紫斑牡丹启动培养的最佳激素配比组合的培养基为B5+0.5 mg/L 6-BA+0.5 g/L LH;(2)在无菌苗生根阶段,影响紫斑牡丹生根的各因素主次顺序为:AC>6-BA>IBA>IAA,各因素的优水平为:AC为0.5 g/L,6-BA为0.5 mg/L,IBA为2.0 mg/L,IAA为2.0 mg/L,适合于紫斑牡丹3个品种无菌苗生根的最佳外源激素浓度配比的培养基是1/2 MS+0.5 mg/L6-BA+2.0 mg/L IAA+2.0 mg/L IBA+0.5 g/L AC;(3)紫斑牡丹3个品种之间离体胚的萌发及生根均差异性不显著(p>0.05),但总体来看的表现情况为雪莲>蓝荷>粉荷,这可能与栽培环境有关。     

MAS育种改良籼稻恢复系R747及其杂交种稻瘟病抗性

为了改良籼稻恢复系R747及其杂交种的稻瘟病抗性,以携带广谱抗稻瘟病基因Pi9的籼稻品系75-1-127为供体亲本,以R747为受体及轮回亲本,利用Pi9基因内功能标记,开展分子标记辅助选择育种实践。获得了如下主要结果:室内接种试验表明,75-1-127与R747对来自国内外不同稻区的24份稻瘟菌菌株的抗菌谱差异显著,抗性频率分别为91.7%和41.7%,两亲本在田间自然病圃苗瘟抗性表现分别为高抗和高感;根据Pi9基因序列信息开发了一个共显性多态标记SPL-1,该标记在75-1-127和R747基因组中分别扩增出一条745 bp和一条850 bp的条带,标记基因型对稻瘟病抗感表型的选择效率为100%;从BC6F3株系中遴选出一个高抗苗瘟的改良恢复系R747-Pi9,并用它与不育系培矮64S、P88S和桃1A分别配制出高抗稻瘟病的杂交种;利用分布于水稻全基因组不同位点的220个SSR标记,分析了改良抗病恢复系R747-Pi9与受体亲本R747的遗传背景差异,结果表明R747-Pi9对R747的背景回复率为0.94。本研究通过分子标记辅助选择和连续回交育种,成功定向改良了恢复系R747及其杂交种的稻瘟病抗性。