白木香AsFPS2基因的克隆与表达分析

沉香(Agarwood)是一种名贵中药和天然香料,倍半萜是其主要的特征性成分之一.法呢基焦磷酸合酶FPS (Farnesyl pyrophosphate synthase)是萜类化合物生物合成的关键酶之一.本研究根据转录组数据在白木香中克隆一个新的法呢基焦磷酸合酶基因AsFPS2,该基因全长1432 bp,包含一个1287 bp的完整开放阅读框,编码428个氨基酸.AsFPS2具有典型的植物法呢基焦磷酸合酶结构特征包含5个保守的结构域和2个保守的DDXXD基序,与小果沉香(Aquilaria microcarpa)中的法呢基二磷酸合酶蛋白具有86.55％的同源性.AsFPS2基因编码区包含12个外显子和11个内含子.AsFPS2启动子区含有多个应答激素和胁迫的响应元件.表达分析显示,伤害、茉莉酸甲酯和乙烯利处理能显著诱导AsFPS2的表达.研究结果说明AsFPS2可能参与了沉香倍半萜的生物合成,为进一步揭示其在倍半萜积累和沉香形成中的作用打下基础.     

土沉香结香过程中不同部位转录组分析

为鉴定与结香相关的关键酶基因和探明土沉香结香的分子机理,本研究以无机盐与激素混合诱导处理后18个月的土沉香为试验材料,采用RNA-Seq技术分别对土沉香未变色白木部位(W样品)、深棕色变色沉香层(R样品)、沉香层与白木之间浅棕色过度部位(H样品)进行转录组分析。经过测序及相关分析共计获得功能注释的Unigene共125 329条,占全部Unigene的57.38%。KEGG数据库比对有51 592条Unigenes归属到6大类代谢途径中,沉香层形成过程中获得的各途径差异Unigene数量最多。通过KEGG数据库同源检索鉴定17条编码沉香倍半萜合成途径的8个关键酶的Unigene。通过基因表达模式分析表明,与倍半萜化合物合成代谢相关基因在沉香形成期整体上表达模式呈上调,而与倍半萜化合物分解代谢相关的基因则呈下调表达。萜类物质合成代谢途径基因表达模式,与沉香形成过程中沉香层倍半萜类物质的大量积累表型相吻合,有助于更深入地揭示土沉香倍半萜合成的分子机制。     

白木香聚酮环化酶基因AsPKC1的克隆及表达分析

聚酮环化酶是植物聚酮合成途径中的关键酶之一,可催化CoA类前体直接合成多环结构。作为聚酮合成下游产物的2-(2-苯乙基)色酮是名贵中药材沉香形成的重要标志物之一,聚酮环化酶可能在其形成过程中发挥着重要作用。本研究基于白木香结香转录组数据,首次克隆了1个白木香聚酮环化酶基因,命名为AsPKC1,该基因的编码区共含1 116个核苷酸,编码371个氨基酸残基。AsPKC1编码的蛋白序列与已报道的PKC蛋白高度相似,与锦葵科棉花、榴莲和可可树具有较近的亲缘关系,聚于进化树的同一分支;该蛋白的等电点为9.04,分子量为40.43 kD,包含3个糖基化位点和28个磷酸化位点,为非分泌型蛋白,α螺旋和无规则卷曲组成其主要二级结构。实时荧光定量PCR验证实验表明AsPKC1的表达具有组织特异性,并且在结香茎干中持续上调表达,其第9天在白木香茎干中的表达量为对照组的6.52倍。本研究为进一步解析聚酮环化酶基因在沉香标志物2-(2-苯乙基)色酮合成及白木香结香过程中的作用提供了数据支持。     

植物花香物质合成与调控研究进展

花香是观赏植物重要的观赏性状之一,深受消费者的欢迎。花香物质主要是萜类和苯环型化合物。萜类化合物中的单萜和倍半萜是观赏植物主要的花香成分,它们分别是通过MVA和MEP途径,在萜类合酶的催化作用下合成。萜类合酶的种类和功能决定了萜类物质的多样性,随着大量有价值的萜类被发现,萜类合酶已成为萜类化合物生物合成及调控的研究焦点。苯环型/苯丙烷类是花香成分的第二大类物质。目前从观赏植物中已经分离出大量的花香物质合成基因,并对它们的结构、功能及表达模式进行了分析研究;同时发现一些转录因子调控萜类和苯丙烷代谢途径基因表达,这些为人们了解花香释放规律,使用基因工程定向改变花香物质成分和含量提供理论基础。本综述对观赏植物的花香成分、测定和分析方法,编码花香物质合成的关键酶基因及迄今发现的调控花香物质合成的转录因子等方面进行了综述。     

罗马洋甘菊HMGR基因的克隆与表达分析

3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)是植物萜类化合物甲羟戊酸合成途径中的关键限速酶。为研究HMGR基因在洋甘菊萜类化合物合成代谢中的功能,根据前期罗马洋甘菊转录组注释HMGR的Unigene序列设计引物,以罗马洋甘菊c DNA为模板,采用RT-PCR方法,从罗马洋甘菊中克隆得到一个长为1 856 bp的HMGR基因,命名为CnHMGR(Gen Bank登录号为KU589282)。CnHMGR基因序列包含1个1 746 bp长的开放阅读框,编码582个氨基酸,生物信息学软件预测蛋白质分子量和等电点分别为62.5 k Da和6.80。氨基酸序列多重比对结果显示,CnHMGR蛋白质与其他植物的HMGR蛋白具有高度相似性,并包含HMGR蛋白质家族中的2个HMG-CoA结合基序:TTEGCLUA、EMPVGYVQIP以及2个NADP(H)结合基序:TVGGGT、DAMGMNM,表明CnHMGR属千罗马洋甘菊HMGR家族成员。组织表达分析显示CnHMGR在罗马洋甘菊的不同组织均有表达,在花中表达量最高,在茎中表达量最低。通过对CnHMGR基因的克隆及表达特性分析,为后续深入研究其在洋甘菊倍半萜合成途径中的功能奠定了理论基础。     

甜菜蔗糖磷酸合酶基因(BvSPS1)的克隆、表达及酶活性分析

蔗糖磷酸合酶是植物中控制蔗糖合成过程中催化6-磷酸果糖转化为蔗糖的关键酶。为了研究该基因的表达特性,本实验采用RT-PCR方法从甜菜中克隆甜菜蔗糖磷酸合酶基因(BvSPS1)。BvSPS1开放阅读框为3138bp,编码1045个氨基酸。推测BvSPS1氨基酸序列跨膜区域位于第561～593位,与酿酒葡萄(Vitis vinifera)和烟草(Nicotiana tabacum)的序列同源性分别为75.45%和74.59%。利用半定量RT-PCR对BvSPS1进行组织特异性表达检测,结果表明该基因主要在主根及侧根表达,在叶和叶柄中表达较弱,酶活性分析结果与之相同。离体叶片在10%葡萄糖溶液中培养6～12h后,BvSPS1基因表达水平提高,在10%蔗糖中培养相同时间则无变化。     

北柴胡环阿屯醇合酶基因的全长克隆与表达分析

环阿屯醇合酶(CAS)是柴胡中植物甾醇类物质合成途径的关键酶,与柴胡皂苷合成途径的关键酶基因β-香树酯醇合酶(β-AS)竞争共同的前体物质,影响柴胡皂苷的积累。为探究柴胡中环阿屯醇合酶的作用,本研究以北柴胡cDNA为模板,克隆获得北柴胡环阿屯醇合酶基因BcCAS的全长序列,对BcCAS全长cDNA序列及其编码氨基酸序列进行了生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)方法检测该基因在北柴胡不同组织中的表达差异。结果表明:该基因全长2 314 bp (GenBank登录号:MT349674),包含2 271 bp的开放阅读框,编码756个氨基酸。预测该基因的编码蛋白含有氧化鲨烯环化酶(OSC)超基因家族的DCTAE和QW结构域,与高氏柴胡、人参、光果甘草、白桦等植物的CAS蛋白具有较高同源性。BcCAS基因在北柴胡根、茎、叶、花等组织中均有表达,在茎中表达量最高。本研究为柴胡皂苷生物合成途径的调控研究提供帮助。     

家蚕黄酮合酶I基因BmFNS I的克隆与干涉载体的构建

黄酮类化合物广泛存在于动植物中,具有多种生理活性,黄酮合酶I基因可以催化多种黄酮类化合物的生物合成.根据NCBI已登录的其他物种黄酮合酶I基因的氨基酸序列,与家蚕基因组和EST数据库进行电子克隆获得家蚕的同源基因BmFNS I.克隆测序结果表明该基因长1 451 bp,7个外显子.根据基因序列推测其编码蛋白由345个氨基酸构成,179～295间氨基酸为一2-氧戊二酸和Fe(II)依赖性的加氧酶家族成员的结构域.RT-PCR检测该基因在本试验所调查的家蚕中肠有高表达.最后将该基因片段亚克隆至具有2个反向T7启动子可以用于体外诱导合成dsRNA的L4440载体.     

冬凌草HMGS基因的克隆与表达分析

羟甲基戊二酰辅酶A合酶（3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A synthase,HMGS）是甲羟戊酸途径（MVA）中的第一个催化酶。根据冬凌草转录组数据库中HMGS基因序列设计特异引物,采用RT-PCR技术克隆冬凌草IrHMGS基因cDNA全长,并对其序列进行生物信息学分析,通过荧光定量PCR的方法分析其组织表达特性。IrHMGS基因cDNA全长1 382bp,编码460个氨基酸,序列分析结果表明该基因编码的氨基酸序列含有羟甲基戊二酰辅酶A合成酶N末端、C末端等保守结构域。荧光定量PCR表明,IrHMGS在冬凌草组培苗叶和根中的表达量显著高于在组培苗花、茎和愈伤组织中的表达量。本研究为后续深入研究IrHMGS在冬凌草二萜类物质合成途径中的功能奠定了基础。     

植物萜类生物合成相关酶类及其编码基因的研究进展

萜类化合物是植物界广泛存在的一种次生代谢物质,其种类繁多,不仅在植物的生命活动中扮演重要的作用,而且还被广泛的应用于工业、医药卫生等方面。萜类化合物的合成包括甲羟戊酸和丙酮酸两条途径,二者都是以异戊烯基焦磷酸为主要的代谢中间产物。萜类化合物的合成较为复杂,其过程受多种酶协调控制,根据各种酶在萜类合成不同阶段的作用,可将其分为Ⅰ、Ⅱ、和Ⅲ类酶。当前人们对其研究主要是Ⅰ类和Ⅱ类酶,试图弄清其合成机理以生产更多有用的萜类化合物。本文综述了植物次生代谢物质萜类的生物合成途径,催化主要中间产物形成相关酶的研究进展,并对其研究前景作简要展望。     

菠萝蜜锈病分级标准及田间病害调查

海南省是菠萝蜜的重要产区之一。自2016年起对海南省11个菠萝蜜规模化种植地区的果园进行了菠萝蜜锈病普查,对发病较严重的5个市县进行了连续两年的固定点监测。结果表明:万宁、定安、澄迈、琼海等地的菠萝蜜锈病发病率极显著高于其他地区;除琼海外,其它市县菠萝蜜果锈病发病率4～6月的均高于9～11月;发病率最高的是2017年五指山,达20.00%,最低的是2018年澄迈,为9.33%;病情指数方面五个监测点2017年均大于2018年。单苞和单果锈病严重度均为5级。综上,4～6月是菠萝蜜锈病发病的高峰期;综合两年比较,各地区的平均发病率与平均病情指数均有所下降,病果数量也在下降。通过提出锈病分级标准,为明确锈病害发生规律,提高防治水平提供参考依据。     

卵形家族蛋白对植物生长发育的调控作用

卵形家族蛋白(ovate family proteins, OFPs)是仅存在于植物且具有保守OVATE结构域的一类转录抑制因子。Ovate最早在番茄中克隆并定位于2号染色体上。GTA496-TTA493的单核苷酸突变使得终止密码子提早出现而导致果实由圆形变为梨形。后来在拟南芥、水稻、辣椒、香蕉等植物中陆续开展了其功能研究。发现它是通过直接调控靶基因的表达或者与其它转录因子的相互作用来调控植物生长发育过程的。本文综述了其对果实形状、果实成熟及品质形成、胚珠发育、维管束发育、次生细胞壁的形成等方面的研究进展及可能的调控作用机制,以期为采用生物技术手段利用该蛋白调控植物生长发育提供理论依据。     

剑麻悬浮细胞体系的建立

为了获取良好的剑麻悬浮细胞体系,以剑麻无菌幼苗嫩叶为诱导材料,对剑麻胚性愈伤组织的获得,建立细胞悬浮系和影响悬浮细胞增殖的主要影响因子进行了探讨。结果表明:幼叶在培养基为MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA上诱导的愈伤组织,经1～2次继代培养后获得了颗粒状、浅黄色的胚性愈伤组织;接种于液体培养基接种量为2 g (鲜重),继代周期为7 d,经4～5次继代震荡培养建立了细胞悬浮系,细胞生长符合"S"型曲线,细胞浓度可达6.1×105～4.6×106个/m L以上;在悬浮细胞生长前期,pH值明显下降,在细胞对数生长期,pH值略有升高,并趋于平缓;最适宜的细胞悬浮培养基为(MS+1.5 mg/L 2,4-D+4.0 mg/L6-BA+350 mg/L水解酪蛋白, 30 g/L蔗糖, pH值为5.8)。通过建立剑麻悬浮细胞培养体系的方法,为进一步应用于剑麻悬浮细胞转化体系和多倍体育种等研究。     

木薯MeHXK1酵母功能互补鉴定

已糖激酶是植物催化已糖磷酸化生成磷酸已糖的一类重要的酶,参与植物生长发育及信号转导的过程。在前期研究中已从木薯基因组克隆获得7个已糖激酶基因,其中木薯已糖激酶基因MeHXK1主要在叶片、块根韧皮部、雄花和雌花中表达。本研究利用已糖激酶酵母突变菌株YSH7.4-3C鉴定酵母功能,研究已糖激酶是否具有催化已糖磷酸化的作用。结果发现:转pDR195-MeHXK1载体的YSH7.4-3C酵母在以葡萄糖或果糖为唯一碳源的培养基中能生长,说明木薯已糖激酶MeHXK1可通过催化己糖磷酸化为酵母的生长提供碳水化合物和能量。这些结果为进一步研究MeHXK1蛋白的酶学特性及生理功能提供参考。     

菠萝AcSAP转录因子对非生物胁迫和生物胁迫的应答响应

STERILE APETALA (SAP)是调节花序、花和胚珠发育,调控分生组织细胞的增殖和器官大小的多功能基因。本研究利用生物信息学的方法对菠萝SAP转录因子进行序列分析,并通过qRT-PCR技术研究了非生物胁迫和生物胁迫对菠萝SAP基因表达的影响。结果表明,菠萝SAP蛋白为稳定疏水酸性蛋白且含有3个WD40重复区域,蛋白质二级结构显示,菠萝SAP蛋白主要结构元件为延伸链和无规则卷曲;qRT-PCR分析显示,逆境胁迫下,AcSAP的表达量与对照差异显著。在H2O2、NaCl、SA、ABA、Eth、低温(4℃)和病菌侵染胁迫下,AcSAP的表达量显著升高。研究表明,逆境胁迫能使AcSAP基因的表达受到影响,进而直接或间接影响植物生长发育,为今后菠萝的抗逆研究和分子育种提供了理论依据。     

胶孢炭疽菌泛素结合酶基因CgUBC2的RNAi突变体获得与功能分析

为了研究胶孢炭疽菌泛素结合酶基因CgUBC2的功能以及与致病相关基因间的关联性。利用RNAi技术构建沉默载体pSilent-1:CgUBC2,通过PEG介导法获得突变体菌株,实时荧光定量PCR法分析其侵染寄主过程中的差异表达,以及与PG、ECH、LIP、PKS、HMT、Sin3P、NRPS 7个致病相关基因的关联性。通过特异性引物检测鉴定、表达量分析,获得CgUBC2的RNAi突变体为pSilent-1:CgUBC2-1和pSilent-1:CgUBC2-2,侵染过程中突变体菌株CgUBC2基因表达量、7个致病相关基因的表达量显著低于野生型菌株。成功获得胶孢炭疽菌泛素结合酶基因CgUBC2的RNAi沉默突变体,CgUBC2参与侵染寄主的过程、正向调控7个致病相关基因和致病力。     

芒果种质对炭疽病、蒂腐病、疮痂病的抗性评价

芒果炭疽病、蒂腐病和疮痂病是芒果种质的重要病害,给中国各芒果产区造成严重的危害,而抗病品种选育是防治芒果病害最经济有效的途径。为评价新引进的芒果种质对炭疽病、蒂腐病、疮痂病的抗性水平,采用田间抗病性鉴定方法对56份芒果种质果实的3种病害进行抗性评价。结果表明,56份种质资源中,高抗炭疽病种质5份、中抗炭疽病19份、高感炭疽病4份,高抗蒂腐病16份、中抗蒂腐病26份、高感蒂腐病1份,高抗疮痂病1份、中抗疮痂病17份、高感疮痂病4份,对3种病害均有抗性的种质资源7份。本研究结果初步揭示新引进的一些种质资源对芒果炭疽病、蒂腐病、疮痂病的抗性情况,为进一步地依托供试种质开展抗病性育种提供参考。     

牛大力漆酶基因CsLAC17的克隆与载体构建

为研究漆酶在牛大力生长发育过程中的生物学功能,本实验以牛大力叶片为材料,从反转录PCR获得的cDNA中扩增出漆酶基因CsLAC17全长。序列分析表明,CsLAC17 c DNA全长为2 010 bp,开放阅读框大小为1 755 bp,编码一个由584个氨基酸组成的蛋白质。结构域分析表明,Cs LAC17蛋白的保守结构域具有漆酶典型结构域的特征——铜离子结合域(Cu-oxidase和Cu-oxidase-2)。同源序列分析表明,Cs LAC17蛋白序列与绿豆(Vigna radiata var. radiata)和野生大豆(Glycine soja)同源性为88%、藜豆(Mucuna pruriens)87%、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) 85%。组织特异性表达分析显示,CsLAC17在茎中表达量最高,叶中表达量次之,根中较少。此外,进一步构建了pBI121-CsLAC17过表达载体并转入农杆菌。本研究为日后CsLAC17基因的功能验证以及为牛大力开展分子生物学研究提供帮助。     

芒果MinSPS1基因的克隆及表达载体的构建

蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)既是调控蔗糖合成的关键酶又是限速酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机理,本研究从芒果果肉中克隆得到一个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPS1,其cDNA全长序列为3 344 bp,开放阅读框为3 168 bp,编码1 055个氨基酸,蛋白质分子量为118.13 k D,等电点为6.08,对MinSPS1基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与柑橘具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示在完熟期贵妃芒果肉中表达量较高,而在青熟期表达量较低。本研究为深入了解芒果蔗糖合成的分子机理,进一步构建了p CAMBIA1301-MiSPS1过表达载体,为MinSPS1的功能鉴定提供理论依据。     

橡胶树中碱性转化酶基因HbNIN7的克隆与表达分析

蔗糖主要由植物光合作用产生,其水解依赖于转化酶和蔗糖合成酶。其中,转化酶催化蔗糖不可逆分解为葡萄糖与果糖。本研究基于橡胶树的基因组和转录组数据库,采用RT-PCR技术克隆得到一个中碱性转化酶基因HbNIN7基因,预测编码683个氨基酸。同源与亚细胞定位分析表明HbNIN7属于α类中碱性转化酶,定位于线粒体。通过原核表达获得其重组蛋白,酶活性分析表明,HbNIN7重组蛋白最适酶活pH值7.2;最适酶活温度45℃;最大反应速率32.69 mmol hexose·mg^-1protein·h^-1;Km值25.04 mmol/L。利用荧光定量方法分析基因的表达特征,结果显示:HbNIN7基因在雄花中表达水平最高,且在雄花发育的不同阶段差异显著,说明Hb NIN7很可能参与橡胶树花组织中糖利用及糖信号调控。