木薯己糖激酶MeHXK4的功能鉴定

己糖激酶可催化葡萄糖和果糖磷酸化生成磷酸己糖,在植物的碳水化合物代谢及糖信号转导中具有重要的作用。前期我们已克隆获得木薯己糖激酶基因Me HXK4,根据生物信息学分析其编码的蛋白可能不具有催化活性。本研究主要利用己糖激酶酵母突变菌株YSH7.4-3C进行酵母功能互补实验,鉴定Me HXK4是否具有催化己糖磷酸化的功能。结果发现,转了p DR195-Me HXK4的YSH7.4-3C酵母可以在以葡萄糖或果糖为唯一碳源的培养基中生长,表明Me HXK4能催化己糖磷酸化为酵母的生长提供碳水化合物和能量。本研究结果为进一步研究Me HXK4的生理功能提供依据。     

木薯碱性/中性转化酶MeNINV4酵母功能互补

木薯(Manihot esculenta Crantz)为大戟科植物,其块根富含淀粉,主要用于食用、饲用,同时木薯淀粉还可广泛应用于工业生产中。木薯块根淀粉的合成需要蔗糖提供碳水化合物和能量,碱性/中性转化酶在木薯块根蔗糖分解利用时起关键作用。前期已从木薯基因组中克隆获得了11个碱性/中性转化酶基因,其中Me NINV4主要在茎中表达。本研究主要利用转化酶酵母突变菌株SEY2102进行酵母功能互补实验,鉴定Me NINV4是否具有催化蔗糖分解的功能。结果发现,转了p DR196-Me NINV4的SEY2102酵母可以在以蔗糖为唯一碳源的培养基中生长,表明Me NINV4能催化分解蔗糖。提取含有p DR196-Me NINV4质粒的SEY2102酵母粗酶液,进行碱性/中性转化酶活性检测,发现其能催化蔗糖分解成还原糖。这些结果为进一步研究Me NINV4的酶学特性及生理功能提供参考。     

地黄己糖激酶RgHXK2基因的电子克隆及生物信息学分析

己糖激酶(HXK)的主要功能是在糖酵解途径中催化己糖磷酸化,是植物体内调控呼吸代谢的关键酶之一。主要催化己糖磷酸化进入糖酵解途径,可在植物体的生长发育过程中为其提供大量的能量。己糖激酶属于hexokinase-2超家族,在植物生命活动中发挥着重要的作用。为了解地黄(Rehmannia glutinosa)己糖激酶基因RgHXK2在磷酸化过程中起到的作用,该研究基于转录组测序获得的地黄己糖激酶基因ORF的部分保守序列和地黄的SRA数据库,在NCBI中进行电子克隆获得地黄RgHXK2全长cDNA序列;采用在线网上工具ProtParam、TMHMM、SOPMA、SMART、MEME、Clustal Omega以及Jalview、MegaX等软件对其进行生物信息学分析,结果显示,地黄RgHXK2基因全长1 462 bp,包含1 194 bp的开放阅读框,编码一个含有397个氨基酸、相对分子质量为43.75 kD、等电点为6.34的蛋白质。在线软件预测该蛋白含有Hexokinase-1和Hexokinase-2保守结构域,无信号肽与跨膜结构,为亲水性非分泌蛋白,主要分布于线粒体和叶绿体中,参与碳...     

巨桉HEX基因家族的生物信息学分析

己糖激酶(hexokinase,HEX)是催化己糖磷酸化生成6-磷酸己糖的酶,是植物呼吸代谢的过程中的关键酶,在植物糖信号的感受与转导过程中发挥重要作用,亦对植物纤维素生物合成至关重要。为研究桉树HEX基因在纤维素生物合成过程中的生物学功能,本研究从巨桉(Eucalyptus grandis)中筛选出10个HEX基因家族成员(EgrHEX1~EgrHEX10),利用生物信息学方法对其基因特征与表达模式进行综合分析。结果显示,EgrHEX基因分布在5条染色体之上,亚细胞定位均在细胞质膜上。EgrHEX基因家族的各个基因的结构存在明显的差异,外显子数量为7~15个。EgrHEX编码的蛋白质由α-螺旋、延伸链、无规卷曲、β-转角组成。进化分析结果表明,EgrHEX蛋白同与毛果杨HEX蛋白的进化关系接近。10个EgrHEX基因在巨桉未成熟木质部、成熟叶片、韧皮部、茎尖、木质部以及幼叶组织中均检测到了表达,但表达模式存在差异。本研究为进一步深入探索巨桉HEX基因家族的生物学功能提供理论依据。     

木薯MeSAUR1互作蛋白的筛选及鉴定

木薯MeAGPS1a基因编码的小亚基是淀粉合成关键酶AGPase的催化中心,前期研究发现MeSAUR1转录因子可结合MeAGPS1a基因启动子并调控该基因表达。采用酵母双杂交技术筛选MeSAUR1转录因子的互作蛋白,可进一步解析MeAGPS1a基因表达的分子调控网络。本研究构建了MeSAUR1的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-MeSAUR1,采用酵母双杂交技术从木薯cDNA文库中筛选MeSAUR1的候选互作蛋白,结果共筛选出31个阳性克隆。通过酵母双杂交点对点实验验证了候选互作蛋白MePP2C与MeSAUR1的互作关系,本研究结果有助于揭示Me SAUR1蛋白调控木薯淀粉合成的互作网络。     

植物果糖激酶基因家族演化及其功能

在大部分植物中,糖是主要的光合产物以及主要代谢途径的碳原材料,蔗糖在被分解成果糖后主要由果糖激酶进行磷酸化催化。本综述根据近年植物果糖激酶研究新进展,及现有测序完成植物基因组数据,对果糖激酶的基因演化分析作了归纳分析,并综述了单双子叶的果糖激酶分子特征与生化性质,家族成员基因组演化分析和表达特征、亚细胞定位和基因功能,并进一步提出了果糖激酶研究领域的展望。     

植物DXR基因的系统发育和分子进化分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)是植物萜类化合物甲基赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)生物合成途径的关键酶。为了解其编码基因DXR的系统发育及和分子进化特性。本研究选取了44个代表性物种的DXR基因序列用于系统发育和分子进化分析。结果发现:DXR基因在进化过程中相对保守,受到的平均选择压大小为0.087 1;DXR基因的GC3和G+C平均含量分别为0.365和0.459,偏好以A/T编码;ENC均值为52.48,表明DXR基因的密码子偏好性较低;分枝模型下未检测到受正向选择的进化枝,位点模型下约1%的DXR基因位点受到正向选择作用,分枝-位点模型下裸子植物进化枝中检测到10个受正向选择作用的位点且后验概率大于0.95。本研究为植物DXR基因的进化分析和功能研究提供了一定的理论基础。     

家稗Pdk基因叶片特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

【研究目的】构建含家稗Pdk基因的叶片特异性表达载体;【方法】通过PstI和SalI单酶切分别从质粒pRGN及pUCm-Pdk上获得Rubisco小亚基启动子和Pdk基因,将其连入表达载体pCAMBI1301, 并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105;【结果】构建了由Rubisco小亚基启动子调控的Pdk基因植物表达载体p1301-Prbs-Pdk,选择标记基因为Hpt（潮霉素磷酸转移酶基因）,经酶切和PCR鉴定,表达载体已成功导入农杆菌EHA105中;【结论】丙酮酸磷酸双激酶（PPDK）是C4光合途径中的关键光合酶,本实验中构建了含有rbcs启动子的适于单子叶植物转化的Pdk基因表达载体,为提高转基因植物光合效率奠定了基础。     

植物光调蛋白激酶PPKs作用机制的研究进展

蛋白激酶(Protein kinases)又称蛋白质磷酸化酶,能够催化蛋白质分子中丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)及酪氨酸(Tyr)残基的磷酸化反应。Ⅰ型酪蛋白激酶(casein kinaseⅠ,CK1)是一类Ser/Thr蛋白激酶,从酵母到哺乳动物中都非常保守。近期研究发现,拟南芥中存在一类蛋白激酶能够在光下特异催化重要光受体及光信号蛋白的磷酸化,故将其命名为光调蛋白激酶(photoregulatory protein kinases,PPKs)。通过序列分析发现,PPKs与Ⅰ型酪蛋白激酶同源,但在功能和结构上都有别于Ⅰ型酪蛋白激酶。拟南芥中,PPK家族主要由4个成员组成:PPK1、PPK2、PPK3和PPK4。PPKs广泛参与多种植物生理过程,在调节植物生长发育中发挥重要作用。本研究对拟南芥蛋白激酶PPKs信号转导途径的相关研究进行探讨,旨在总结目前关于PPKs调控植物生长发育分子机制的认识。     

海藻糖的应用及其合酶基因TPS在植物转基因中的研究进展

对海藻糖的理化性质、生物学特性及其应用情况作了简要的概述;介绍了酵母中海藻糖合酶复合体基因的组成及各个组成基因的功能,并着重阐述了海藻糖-6-磷酸合酶基因在植物转基因方面（尤其在提高植物抗逆性）的研究进展。     

牛大力漆酶基因CsLAC17的克隆与载体构建

为研究漆酶在牛大力生长发育过程中的生物学功能,本实验以牛大力叶片为材料,从反转录PCR获得的cDNA中扩增出漆酶基因CsLAC17全长。序列分析表明,CsLAC17 c DNA全长为2 010 bp,开放阅读框大小为1 755 bp,编码一个由584个氨基酸组成的蛋白质。结构域分析表明,Cs LAC17蛋白的保守结构域具有漆酶典型结构域的特征——铜离子结合域(Cu-oxidase和Cu-oxidase-2)。同源序列分析表明,Cs LAC17蛋白序列与绿豆(Vigna radiata var. radiata)和野生大豆(Glycine soja)同源性为88%、藜豆(Mucuna pruriens)87%、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula) 85%。组织特异性表达分析显示,CsLAC17在茎中表达量最高,叶中表达量次之,根中较少。此外,进一步构建了pBI121-CsLAC17过表达载体并转入农杆菌。本研究为日后CsLAC17基因的功能验证以及为牛大力开展分子生物学研究提供帮助。     

白木香倍半萜合酶基因AsVS的克隆与表达分析

法尼基焦磷酸(farnesyl diphosphate, FPP)是植物萜类化合物合成途径的重要前体之一,经不同的酶催化可形成各类萜类化合物,Vetispiradiene合酶可催化FPP形成Solavetivone和Lubimin的前体Vetispiradiene。本研究利用白木香转录组数据,首次克隆了编码白木香Vetispiradiene合酶的基因(命名为As VS, Genbank登录号为MH378283),AsVS基因序列全长为1 632 bp,编码543个氨基酸,该氨基酸序列与马来沉香倍半萜合酶聚类于同一分支,具有较近的亲缘关系,该蛋白植物倍半萜的保守性结构域DDXXD,NST/DTE和R(R)X8W,相对分子量为62.73 kD,理论等电点为5.51,包含40个磷酸化位点;二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主;不含跨膜结构域。RT-qPCR分析结果表明AsVS基因在结香剂处理过程中于白木香茎干样品中持续上调表达,其第6天及第9天的表达量分别为对照处理的2.36和5.02倍。此结果为进一步研究As VS基因在白木香萜类化合物的合成及沉香致香成分富集中的功能提供了理论基础。     

菠萝AcSAP转录因子对非生物胁迫和生物胁迫的应答响应

STERILE APETALA (SAP)是调节花序、花和胚珠发育,调控分生组织细胞的增殖和器官大小的多功能基因。本研究利用生物信息学的方法对菠萝SAP转录因子进行序列分析,并通过qRT-PCR技术研究了非生物胁迫和生物胁迫对菠萝SAP基因表达的影响。结果表明,菠萝SAP蛋白为稳定疏水酸性蛋白且含有3个WD40重复区域,蛋白质二级结构显示,菠萝SAP蛋白主要结构元件为延伸链和无规则卷曲;qRT-PCR分析显示,逆境胁迫下,AcSAP的表达量与对照差异显著。在H2O2、NaCl、SA、ABA、Eth、低温(4℃)和病菌侵染胁迫下,AcSAP的表达量显著升高。研究表明,逆境胁迫能使AcSAP基因的表达受到影响,进而直接或间接影响植物生长发育,为今后菠萝的抗逆研究和分子育种提供了理论依据。     

香蕉BADH基因序列及表达特性分析

甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是植物体内甜菜碱合成过程中的关键酶,对植物抵御逆境具有重要作用。为研究香蕉BADH基因序列及表达特性,本研究利用香蕉基因数据库对香蕉BADH基因序列及蛋白序列进行生物学信息分析,采用qTR-PCR技术对香蕉幼苗中BADH基因进行表达分析。结果表明:MaBADH基因属单克隆基因,含有15个外显子,14个内含子;顺式调控元件预测显示在MaBADH启动子区域存在15种激素和逆境胁迫相关的顺式调控元件;蛋白结构域和功能分析有一个甜菜碱醛脱氢酶结构域具有氧化还原酶活性;亚细胞定位在叶绿体中,多重序列比对发现其具有N-端信号肽和C-端信号肽两种信号肽;系统进化树显示其与水稻、玉米、菠萝亲缘关系最近。基因表达分析发现MaBADH具有组织特异表达特性,在叶片中相对表达量最高,假茎次之,根最低;此外,茉莉酸甲酯能够诱导香蕉幼苗根和叶中MaBADH差异表达,其中对叶片的诱导能力更强。本研究为激素信号调控甜菜碱分子保护机制和利用基因工程提高香蕉抗逆性提供了参考依据。     

橡胶树中碱性转化酶基因HbNIN7的克隆与表达分析

蔗糖主要由植物光合作用产生,其水解依赖于转化酶和蔗糖合成酶。其中,转化酶催化蔗糖不可逆分解为葡萄糖与果糖。本研究基于橡胶树的基因组和转录组数据库,采用RT-PCR技术克隆得到一个中碱性转化酶基因HbNIN7基因,预测编码683个氨基酸。同源与亚细胞定位分析表明HbNIN7属于α类中碱性转化酶,定位于线粒体。通过原核表达获得其重组蛋白,酶活性分析表明,HbNIN7重组蛋白最适酶活pH值7.2;最适酶活温度45℃;最大反应速率32.69 mmol hexose·mg^-1protein·h^-1;Km值25.04 mmol/L。利用荧光定量方法分析基因的表达特征,结果显示:HbNIN7基因在雄花中表达水平最高,且在雄花发育的不同阶段差异显著,说明Hb NIN7很可能参与橡胶树花组织中糖利用及糖信号调控。     

菠萝蜜锈病分级标准及田间病害调查

海南省是菠萝蜜的重要产区之一。自2016年起对海南省11个菠萝蜜规模化种植地区的果园进行了菠萝蜜锈病普查,对发病较严重的5个市县进行了连续两年的固定点监测。结果表明:万宁、定安、澄迈、琼海等地的菠萝蜜锈病发病率极显著高于其他地区;除琼海外,其它市县菠萝蜜果锈病发病率4～6月的均高于9～11月;发病率最高的是2017年五指山,达20.00%,最低的是2018年澄迈,为9.33%;病情指数方面五个监测点2017年均大于2018年。单苞和单果锈病严重度均为5级。综上,4～6月是菠萝蜜锈病发病的高峰期;综合两年比较,各地区的平均发病率与平均病情指数均有所下降,病果数量也在下降。通过提出锈病分级标准,为明确锈病害发生规律,提高防治水平提供参考依据。     

剑麻悬浮细胞体系的建立

为了获取良好的剑麻悬浮细胞体系,以剑麻无菌幼苗嫩叶为诱导材料,对剑麻胚性愈伤组织的获得,建立细胞悬浮系和影响悬浮细胞增殖的主要影响因子进行了探讨。结果表明:幼叶在培养基为MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA上诱导的愈伤组织,经1～2次继代培养后获得了颗粒状、浅黄色的胚性愈伤组织;接种于液体培养基接种量为2 g (鲜重),继代周期为7 d,经4～5次继代震荡培养建立了细胞悬浮系,细胞生长符合"S"型曲线,细胞浓度可达6.1×105～4.6×106个/m L以上;在悬浮细胞生长前期,pH值明显下降,在细胞对数生长期,pH值略有升高,并趋于平缓;最适宜的细胞悬浮培养基为(MS+1.5 mg/L 2,4-D+4.0 mg/L6-BA+350 mg/L水解酪蛋白, 30 g/L蔗糖, pH值为5.8)。通过建立剑麻悬浮细胞培养体系的方法,为进一步应用于剑麻悬浮细胞转化体系和多倍体育种等研究。     

胶孢炭疽菌泛素结合酶基因CgUBC2的RNAi突变体获得与功能分析

为了研究胶孢炭疽菌泛素结合酶基因CgUBC2的功能以及与致病相关基因间的关联性。利用RNAi技术构建沉默载体pSilent-1:CgUBC2,通过PEG介导法获得突变体菌株,实时荧光定量PCR法分析其侵染寄主过程中的差异表达,以及与PG、ECH、LIP、PKS、HMT、Sin3P、NRPS 7个致病相关基因的关联性。通过特异性引物检测鉴定、表达量分析,获得CgUBC2的RNAi突变体为pSilent-1:CgUBC2-1和pSilent-1:CgUBC2-2,侵染过程中突变体菌株CgUBC2基因表达量、7个致病相关基因的表达量显著低于野生型菌株。成功获得胶孢炭疽菌泛素结合酶基因CgUBC2的RNAi沉默突变体,CgUBC2参与侵染寄主的过程、正向调控7个致病相关基因和致病力。     

卵形家族蛋白对植物生长发育的调控作用

卵形家族蛋白(ovate family proteins, OFPs)是仅存在于植物且具有保守OVATE结构域的一类转录抑制因子。Ovate最早在番茄中克隆并定位于2号染色体上。GTA496-TTA493的单核苷酸突变使得终止密码子提早出现而导致果实由圆形变为梨形。后来在拟南芥、水稻、辣椒、香蕉等植物中陆续开展了其功能研究。发现它是通过直接调控靶基因的表达或者与其它转录因子的相互作用来调控植物生长发育过程的。本文综述了其对果实形状、果实成熟及品质形成、胚珠发育、维管束发育、次生细胞壁的形成等方面的研究进展及可能的调控作用机制,以期为采用生物技术手段利用该蛋白调控植物生长发育提供理论依据。     

芒果MinSPS1基因的克隆及表达载体的构建

蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase, SPS)既是调控蔗糖合成的关键酶又是限速酶,为了研究其在芒果果实中蔗糖合成的作用机理,本研究从芒果果肉中克隆得到一个与蔗糖合成相关的基因,将其命名为MinSPS1,其cDNA全长序列为3 344 bp,开放阅读框为3 168 bp,编码1 055个氨基酸,蛋白质分子量为118.13 k D,等电点为6.08,对MinSPS1基因编码的蛋白进行系统发育分析,发现其与柑橘具有较近的亲缘关系。采用qRT-PCR对该基因在后熟处理的贵妃芒果肉中的表达量进行分析,结果显示在完熟期贵妃芒果肉中表达量较高,而在青熟期表达量较低。本研究为深入了解芒果蔗糖合成的分子机理,进一步构建了p CAMBIA1301-MiSPS1过表达载体,为MinSPS1的功能鉴定提供理论依据。