血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的原核表达及鉴定

通过原核表达的方法得到血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白;根据GenBank中血清4型禽腺病毒六邻体蛋白的基因序列,设计一对特异性引物,利用普通PCR方法扩增得到hexon基因的全长序列。将PCR扩增得到的血清4型禽腺病毒六邻体基因片段,在其两端插入酶切位点后克隆至载体pMD18T中,经PCR鉴定和测序分析正确后,与原核表达载体pET-32 a进行连接,构建pET-32 a-hexon原核表达载体,并对其进行双酶切和测序鉴定。将构建成功的表达载体转化至BL21(DE3)中,用1 mmol/L的IPTG进行诱导表达,对得到的重组蛋白进行SDS-PAGE分析和Western Blot鉴定;经双酶切鉴定和测序鉴定,pET-32a-hexon原核表达载体构建成功,插入的六邻体蛋白基因片段大小为2 814 bp,在1 mmol/L浓度IPTG诱导3 h时重组蛋白表达量最高,且重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白分子量为118 ku。免疫印迹分析结果显示,融合蛋白可被抗FAdV-4的血清和HIS标签抗体特异性识别;成功表达了血清4型禽腺病毒的主要结构蛋白六邻体蛋白,且得到的重组蛋白具有良好的反应原性,可用于血清4型禽腺病毒的进一步研究中,为血清4型禽腺病毒病的预防和治疗奠定了良好的基础。     

棉花GhCOMT3基因的原核表达、纯化及鉴定

为了深入研究GhCOMT3基因的功能,将GhCOMT3基因构建到原核表达载体pET-28a中,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。用0.2mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,结果发现,16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达;30℃诱导的蛋白表达量最大,之后对包涵体进行变性溶解,进行SDS-PAGE检测,再经过蛋白标记亲和层析柱(His TrapTMHP)纯化得到变性的pET-28a-GhCOMT3融合蛋白,用SDS-PAGE和Western blotting检测纯化效果,鉴定表达产物,目的蛋白相对分子量约为39.119kDa,检测结果与预期一致。结果表明,pET-28a-GhCOMT3蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达产物,为在蛋白水平上研究GhCOMT3基因功能奠定了基础。     

C型口蹄疫病毒衣壳蛋白前体P1基因的原核表达及其生物活性的初步分析

将口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白基因P1的完整cDNA序列插入原核表达性载体pET-28α(+)中,获得融合表达质粒pET-P1,转化E.coli.BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,pET-P1获得融合表达, Western Blot 检测证实表达的融合蛋白具有免疫活性,表达产物主要以包涵体的形式存在,进一步采用纯化试剂盒纯化P1蛋白做为诊断抗原.     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础.     

一种高效、稳定的可溶性原核表达载体的构建及应用

以O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-OVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有PelB信号肽编码序列的VP1 C端编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建了可溶性原核表达载体pET-30a-PelB-VP1C.将VP1全长编码区替换VP1C,获得重组原核表达载体pET-30a-PelB-VP1.将两种重组质粒分别转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,实现了VP1全长及其C端的可溶性表达,以金属离子螯合层析法分别对表达的VP1及其C端融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白分别在32 ku和20 ku处有单一目的条带,具有较高的纯度.Western blot 分析,VP1蛋白及其C端均可与牛O型口蹄疫病毒阳性血清反应.对重组菌株的连续传代实验证实了该可溶性表达载体的遗传稳定性,显示了该可溶性原核表达载体在蛋白可溶性表达中的应用价值.     

藏猪IGF-1成熟肽基因的克隆及原核表达

旨在克隆藏猪胰岛素样生长因子1(IGF-1)的成熟肽基因,并进行原核表达的研究。提取藏猪肝脏组织RNA,通过RT-PCR扩增出藏猪IGF-1全长基因,构建重组质粒p MD19-T-IGF-1,以p MD19-T-IGF-1质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽序列并构建成熟肽p ET-32α-IGF-1表达质粒,转入大肠杆菌BL21(DE3),对IPTG诱导剂浓度和诱导时间进行优化,Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白后采用Western Blot对其鉴定。结果显示,IGF-1成熟肽基因(315 bp),成功构建了成熟肽p ET-32α-IGF-1原核表达质粒;重组大肠杆菌BL21-IGF-1以包涵体形式表达出分子量约31 k Da融合蛋白,最优IPTG浓度为0.5 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为10 h;纯化获得了高纯度的融合蛋白,经鉴定IPTG诱导表达和纯化的蛋白为IGF-1融合蛋白。结果表明,成功构建了表达质粒p ET32α-IGF-1及获得重组大肠杆菌BL21-IGF-1,表达了藏猪IGF-1成熟肽融合蛋白及该蛋白具有抗原抗体反应活性。     

猪源Viperin基因的克隆、原核表达以及抗体的制备

为研究猪Viperin蛋白在猪体内的抗病毒活性,用IFN-α刺激PK-15细胞24 h,收集细胞提取RNA后,采用RT-PCR方法扩增猪Viperin基因,并连接至p EASY-blunt simple平末端连接测序载体,PCR鉴定后送公司测序正确。采用DNAStar分析猪Viperin蛋白的免疫原性和疏水性,选取抗原性较好的一段基因,采用PCR扩增后,插入pET-28a+大肠杆菌表达载体,在37℃条件下用IPTG诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21,SDS-PAGE分析证明,Viperin重组蛋白以包涵体的形式表达,包涵体蛋白经过纯化后得到目的蛋白,将纯化蛋白与弗式佐剂进行乳化后颈背部皮下注射9日龄的BALB/c小鼠,14 d后加强免疫一次,收集小鼠血清。采用Western Blot、IFA鉴定制备多克隆抗体的特异性,该多克隆抗体可以和阳性sViperin真核表达载体pCI-sVIP等表达的猪源Viperin蛋白进行特异性反应。试验成功克隆了猪Viperin基因,并制备了良好Viperin蛋白的多克隆抗体。     

鸡α干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒活性测定

通过PCR技术从罗曼鸡肝脏基因组中扩增鸡α干扰素(ChIFN-α)全基因,并克隆和测序.序列分析表明,ChIFN-α基因全长为582 bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因489 bp,利用基因重组技术构建了重组质粒,使ChIFN-α置于原核表达载体pQE30的T5启动子下并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag 融合.经酶切和PCR鉴定,DNA测序证实重组质粒pQEChIFN-α构建正确;将pQEChIFN-α转化大肠杆菌M15感受态细胞,用IPTG诱导表达.SDS-PAGE和Western blot证实表达出分子质量为19.80 kDa的融合蛋白.表达的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性处理后,在Vero细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1.16×103 U/mg.本研究成功表达了ChIFN-α,表达的重组蛋白具有一定的生物活性.     

番木瓜畸形花叶病毒HC-Pro蛋白的原核表达与纯化

番木瓜畸形花叶病毒(papaya leaf distortion mosaic virus, PLDMV, Potyvirus属)是目前威胁中国番木瓜种植的主要病原之一。辅助成分-蛋白酶(helper component-proteinase, HC-Pro)是PLDMV编码参与病毒运动、复制、媒介传播、基因沉默抑制的多功能蛋白。为了获得HC-Pro基因的纯化蛋白,本研究通过密码子优化HC-Pro基因序列,成功构建原核表达质粒p ET-30a-HCPro,经IPTG诱导后实现HC-Pro在大肠杆菌中的原核表达,在0.5 mmol/L IPTG,20℃条件下诱导过夜时其表达量最高;破碎菌体后,SDS分析全菌、破碎上清以及沉淀中目标蛋白的表达量,结果显示重组HC-Pro蛋白主要以不可溶的包涵体形式在沉淀中表达;进一步溶解包涵体通过Ni-NTA层析柱进行纯化,在500 mmol/L浓度咪唑下可以获得分子量大小约为54 kD的HC-Pro重组蛋白;Western Blot分析纯化后的目标蛋白,结果显示54 kD处有明显的条带,与预期的HC-Pro重组蛋白大小一致。本研究成功表达并纯化获得了PL...     

兔出血症病毒VP60基因的表达及其免疫原性研究

为研究兔出血症病毒VP60基因原核表达蛋白的免疫原性。采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60基因。PCR产物纯化后连接T载体,提取质粒后进行序列测定,将测序正确的纯化产物经双酶切,克隆入原核表达载体PET28b中,构建原核表达载体。将鉴定正确的重组质粒转化表达宿主菌E. coli RosettaTM中,用IPTG诱导培养重组表达菌。结果表明：经SDS-PAGE分析,在相对分子量62.0 KD处可见明显的表达带,经Western blot鉴定,在62.0 KD处出现明显的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。说明RHDVVP60基因原核表达蛋白具有较好的免疫原性。     

抗草甘膦水稻突变体osgr-1 EPSPS基因克隆及生物信息学分析

为深入研究抗草甘膦水稻突变体osgr-1中编码5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因EPSPS的结构与功能,利用生物信息学分析方法对EPSPS基因结构进行分析,对其编码产物功能进行预测。对克隆的EPSPS基因序列分析表明,osgr-1突变体EPSPS基因中CDS序列发生了3个位点的突变,分别为第226位核苷酸残基C变为G,引起编码蛋白226位脯氨酸(Pro)变成丙氨酸(Ala);第301位核苷酸残基G变为T,导致编码产物311位丙氨酸(Ala)变为丝氨酸(Ser);第311位核苷酸残基A变为C,导致编码蛋白中多少位的谷氨酸(Glu)变为丙氨酸(Ala)。该突变基因编码蛋白含511个aa,Mr为53,823kDa,分子式为C₂₃₇₃H₃₈₆₇N₆₅₉O₇₂₁S₂₃,等电点为8.33,为疏水性蛋白,定位于叶绿体上且不存在信号肽;其二级结构中β-转角、α螺旋和无规则卷曲分别占31.6%、17.7%和0.7%;三级结构呈单聚体,由2个亚基组成,有4个氯离子、3个镁离子、1个磷酸根离子的结合位点和2个结构域。     

国外棉花抗性及纤维改良育种的研究进展

棉花(Anemone vitifolia)是重要的经济作物,棉花纤维是纺织原料的重要来源,棉花生产在世界经济中占有重要的地位,但随着全球气候的不断恶化,世界棉花生产一直受到病害、虫害、干旱、盐碱环境等生物和非生物的胁迫和制约,对全球棉花的产量和纤维质量都造成持续性的危害,国外研究人员通过常规育种技术结合转基因技术,分子标记辅助育种技术等手段创制和培育了一系列的抗性种质资源和品种,改良了棉花的纤维质量,在生产中大面积推广和应用,本研究对国外棉花抗病、耐旱、耐盐、抗虫及纤维改良育种的研究进展进行综述,希望能对中国棉花抗性及纤维改良育种有所帮助。     

陆海高代回交群体抗黄萎病QTL定位

【目的】定位棉花抗黄萎病数量性状位点(Quantitative trait loci, QTL)。【方法】以海7124和TM-1配制抗感组合F1,再以鲁棉研28为轮回亲本构建的137个BC4F1家系为作图群体,筛选出多态性重复序列(Simple sequence repeat, SSR)标记,并与已发表的整合高密度遗传连锁图谱相比对,构建遗传图谱。采用复合区间作图法(Composite interval mapping,CIM)进行大田和病圃两个环境下抗黄萎病QTL定位。【结果】216个多态性SSR位点分布在26条染色体上,可覆盖棉花基因组3 380 cM(centi Morgan),标记间平均距离15.77 cM。定位到6个QTLs,分布在6条染色体上,可解释表型变异8.56%~20.26%,其中5个QTLs与前人研究结果相一致,在第1染色体上新定位到一个QTL。本研究可为分子标记辅助选择抗病育种提供帮助。【结论】定位到6个黄萎病相关QTLs,其中1个是在第1染色体上新发现的QTL。     

基于RIL群体鉴定棉花抗黄萎病相关QTLs

【目的】鉴定出能够稳定表达的棉花抗黄萎病相关数量性状位点(Quantitative trait loci,QTLs)。【方法】以抗落叶型黄萎病棉花品种常抗棉和感黄萎病品种TM-1为亲本配制的111个重组自交系家系为作图群体,筛选出多态性简单序列重复(Simple sequence repeat,SSR)标记,并用于构建遗传图谱。用完备复合区间作图法对该群体在安阳大田、新疆重病地及病圃等多个环境下的黄萎病病情指数进行QTLs检测。【结果】构建了1张含有12个连锁群、40个标记、总长212.5 cM(厘摩)的遗传图谱。获得了6个与抗黄萎病基因相关的QTLs,对数优势比(Logarithm of the odd score,LOD)分布在2.51～5.55,贡献率最大为20.34%,最小为6.93%。其中,qVR-D05-1能够在安阳大田2015年7月15日和新疆南疆重病地2016年7月9日2个环境中检测到,贡献率分别为12.96%和20.34%。【结论】本研究得到的qVR-D05-1能够为定位出稳定的棉花抗黄萎病相关QTLs提供参考。     

大豆GmGLDH基因的克隆、表达及生物信息学分析

为了探究大豆L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶基因Gm GLDH-Glyma.02G166300 (以下简称GmGLDH)的功能,本研究采用同源克隆法获得大豆GmGLDH基因,开展了相关生物信息学分析,并对其非生物胁迫下表达模式进行调查。结果表明,GmGLDH基因包含一个长度为1 752 bp的ORF序列,编码584个氨基酸。GmGLDH蛋白为亲水性较强的蛋白;二级结构中以无规则卷曲和α螺旋结构为主;预测亚细胞定位GmGLDH主要分布在线粒体中,分析结果并未发现跨膜结构域和信号肽结构;该蛋白序列中存在磷酸化位点56个。进化分析表明,克隆的GmGLDH氨基酸序列与菜豆、苜蓿的同源关系较近。基因上游顺式调控元件分析表明该基因可能参与光应答、激素响应、高温响应等,但光处理下大豆子叶中Gm GLDH基因的表达变化不大,且和子叶中抗坏血酸含量无相关性;4种非生物胁迫处理下大豆叶片中Gm GLDH基因是先下调后上调表达,和抗坏血酸含量变化呈反相关。本研究为进一步研究GmGLDH基因在大豆抗逆中的作用提供了重要的帮助。     

红花文殊兰的离体培养及快速繁殖

以红花文殊兰的鳞茎为外植体,研究不同培养基对其腋芽启动、不定芽增殖及生根培养的影响。研究表明,腋芽启动的最适培养基为5.0 mg/L MS+6-BA+0.2 mg/L NAA+活性炭1 g/L,腋芽的诱导萌发率为88%;不定芽增殖的最适培养基为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA+活性炭0.5 g/L,40 d的增殖系数可达7.16;壮苗培养基为1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+10%椰子水(CW)+活性炭0.5 g/L;生根的最适培养基为MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA+活性炭0.5 g/L,生根率达100%,根系发达,植株生长健壮。生根苗经一段时间炼苗后,移栽到基质为树皮∶椰糠∶河砂=1∶1∶1的苗钵上,红花文殊兰的假植成活率达95%。该研究建立了红花文殊兰的快繁体系,为其工厂化生产提供技术支持。     

根肿菌孢子灭活方法探究

根肿病菌致病机理比较复杂,发病症状表型各异,一些抗病品种的抗性也不十分稳定,所以在根肿病的防治上具有很大的困难和挑战,找到根肿菌孢子灭活方法对于根肿病的防治具有重要意义。本研究通过对市面上几种常用的药剂和一些通用的防治方法进行了比较,得到了几种高效、快捷的根肿菌孢子灭活方法,为降低根肿病发病率提供科学依据。其结果表明,通过不同温度处理根肿菌菌液时,温度越高根肿菌孢子越容易失活,当温度达到75℃时,开始出现完全失活的现象;几种药剂处理根肿菌菌液时,高锰酸钾和酒精对根肿菌孢子的灭活作用更好;浓度梯度实验表明,0.3%高锰酸钾和50%酒精对根肿菌孢子灭活效果明显。综上所述,可以通过高温灭菌和酒精、高锰酸钾相结合的方式对根肿菌孢子进行灭活,从而进行早期的防治,降低植物的发病率。本研究对于芸薹属作物对根肿菌的防病和控病具有重要的意义。     

基于高通量测序的棉花InDel标记开发及其应用

【目的】获得可以用于棉花品种鉴定和纯度检测的二态性InDel标记,提高棉花种子的检验精确度和效率,为棉花的分子育种发挥作用。【方法】基于来源不同的121份棉花全基因组信息,根据高多态性信息含量筛选多态性高的InDel位点,开发二态性InDel标记,并在我国66个棉花品种的遗传距离分析和聚类分析中进行应用。【结果】基于121份棉花的二代测序数据获得10967个InDel位点,合成了85对InDel引物,选择其中有效引物64对,其中At亚组的特异引物35对、Dt亚组特异引物29对,At、Dt亚组染色体的平均最小等位频率分别为0.45、0.32,多态信息含量分别为0.49、0.40;所用的66个棉花品种的遗传距离范围是0.04~0.65cM(厘摩),平均为0.39cM,遗传距离最大的2个品种是泗棉3号和中棉所36,遗传距离最小的是徐棉18和徐杂3号。【结论】开发的64个棉花二态性InDel标记能有效地通过揭示品种间的遗传距离反映品种之间的亲缘关系,区分来源不同的棉花品种,具有一定的理论意义和应用价值。     

全国芝麻区试(江淮片)品种主要农艺性状和品质特性的比较

为比较全国芝麻区试(江淮片)品种主要农艺性状和品质特性,本研究以1990~2015年全国芝麻区域试验(江淮片)的历年汇总数据为资料,系统分析了中国江淮芝麻产区近30年来育成品种的农艺性状和品质特性的变化规律。结果表明,该芝麻产区的高产育种取得了较大进展,品种平均单产由1990-1999年的941.25 kg/hm^2持续增长到2011-2015年的1 235.25 kg/hm^2,增幅达31.24%;平均含油量从1990-1999年的54.58%提高到2011-2015年的55.47%,蛋白质含量从1990-1999年的20.98%提高到2011-2015的21.14%,品质有一定的提高(中间略有回落);茎点枯病病指由1990-1999年的8.82持续降低到2011-2015年的6.31,抗性提高了39.78%,枯萎病病指由1990-1999年的1.31降低到2011-2015的1.13,抗性提高了15.93%,抗病性有较大幅度提高;育成了一批高产、优质、综合性状较好的芝麻品种,如‘中芝12’、‘中芝13’、‘郑芝98N09’、‘驻芝15号’、‘鄂芝6号’等,在江淮芝麻产区发挥着重要的作用。今后需加强新品种选育力度,在充分利用现有资源的基础上,改进选择技术,进一步提高产量、品质与抗性。     

火龙果茎腐病致病菌的鉴定

为弄清火龙果茎腐病的病原和分类地位,并进一步为该病害的有效防治提供理论依据。本研究从琼海、临高、陵水等地广泛采集病样。经田间症状调查、组织纯化培养、病原形态观察、致病力测定、真菌ITS序列和系统进化分析,鉴定了该病害的病原。结果表明:病原分离物具有典型的镰刀菌形态特征,菌丝浓密,产生紫色素,小型分生孢子新月形,大型分生孢子镰刀形,有多个隔;而在ITS序列分析中,代表菌株47A4和47A5与NCBI数据库中尖孢镰刀菌的多条ITS序列(登录号分别为KJ653447.1, DQ535184.1和KM268692.1)相似性达100%;系统进化树上,47A4和47A5与尖孢镰刀菌聚在同一分支上,遗传距离最近,而与非纯培养镰刀菌克隆3.91E在不同分支上,遗传距离远。结合形态特征、序列分析和系统进化分析,将火龙果茎腐病的病原鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。研究结果对火龙果茎腐病流行规律、致灾机理的研究具有重要的指导作用。