盘鲍原肌球蛋白基因的克隆、表达及其免疫原性鉴定

为获得具有过敏原活性的重组盘鲍TM进行了试验。克隆盘鲍原肌球蛋白(tropomyosin,TM)基因并表达纯化出重组蛋白,对其免疫学特性进行了鉴定。从盘鲍肌肉中提取总RNA,RT-PCR克隆盘鲍中原肌球蛋白基因,根据序列设计带有酶切位点的特异性引物,扩增盘鲍TM的开放阅读框,与pET-28a载体连接并转化入大肠杆菌Escherichia.coli BL21(DE3),诱导表达后,Ni2+亲和层析柱纯化重组蛋白,West-ern-blot检测其免疫学活性。经序列测定,该基因由855个碱基组成,编码284个氨基酸。SDS-PAGE检测该重组蛋白在大肠杆菌中高效表达38 kD的目的蛋白,且重组蛋白具有良好的IgE结合活性。     

凡纳滨对虾原肌球蛋白基因表达模式与重组表达

根据相近物种的同类基因设计引物,从凡纳滨对虾Litopenaeus vannamei肌肉组织中克隆获得原肌球蛋白基因（TPMS）,长度为901bp,其中包含长度为852bp的完整开放阅读框,编码原肌球蛋白分子量为32．8kDa;RT—PCR结果显示,原肌球蛋白在心、肝胰腺、胃、鳃、肠和肌肉组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在鳃中表达量最低;将原肌球蛋白基因构建原核重组表达载体TPMS—pET30a,转化受体菌株BL21（DE3）并利用IPTG诱导后能够大量表达,蛋白分子量为38．2kDa;经优化,IPTG的最适诱导浓度为0．05mmol／L,最适诱导时间为4h;经过亲和纯化后,能够得到纯度90％以上的重组表达蛋白。     

蟹类原肌球蛋白基因的克隆与表达

原肌球蛋白是甲壳类动物的主要过敏原之一。本文通过分子生物学技术方法,分别克隆得到锯缘青蟹(Scylla serrata)、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的原肌球蛋白基因序列。测序结果表明,三个基因的序列长度均为855 bp,编码284个氨基酸残基,三者氨基酸序列同源性为99.3%。三种蟹的原肌球蛋白基因序列与GenBank中其他甲壳类动物的原肌球蛋白具有很高的同源性。将锯缘青蟹的原肌球蛋白基因与pGEX-4T-3载体连接后,经IPTG诱导得到分子量约为61 kDa的融合表达蛋白。通过与甲壳类过敏患者血清的免疫印迹反应,证实融合表达的原肌球蛋白具有过敏原性,表明原肌球蛋白是蟹类的主要过敏原之一。该融合蛋白有望用于甲壳类食物过敏诊断试剂的开发与应用。     

甲壳类水产品主要过敏原原肌球蛋白胶体金免疫层析快速检测方法的建立及应用

为实现甲壳类水产品主要过敏原的快速检测,实验使用凡纳滨对虾原肌球蛋白(TM)作为检测靶标,构建了胶体金免疫层析检测方法。使用天然TM分别免疫SD大鼠和新西兰大白兔制备多克隆抗体,以40 nm胶体金标记的鼠多抗作为检测抗体,以兔多抗为捕获抗体,基于双抗体夹心原理组装免疫层析试纸条,并应用于市售食物样品的检测。结果显示,组建的免疫层析试纸条可在5 min之内显示结果,视觉检出限为10 ng/mL,对虾、蟹、克氏原螯虾及美洲螯龙虾等甲壳类水产品的特异性高,但与蛤蜊、扇贝存在微弱的交叉反应;在不含甲壳类水产品的市售食品中的加标回收率为81%～126%,准确性良好;试纸条的批内、批间变异系数低于15%,市售实际食物样品的检测结果与食物过敏原标签一致。研究表明,该方法具有高灵敏度与检测特异性,可在多种基质与商业化食品中实现甲壳类过敏原的有效检测,具有较强的实际应用价值。     

日本囊对虾原肌球蛋白的原核表达、抗体制备以及组织表达分析

食物过敏是人类常见的一种过敏性疾病,主要由食物中的蛋白质引起。原肌球蛋白(tropomyosin,TPM)是食用虾蟹等甲壳动物引起过敏反应的主要致敏物质。研究从日本囊对虾肌肉组织中克隆了TPM基因,进行了原核表达和蛋白质纯化,并进一步制备了相应的抗体。Western-blotting分析表明原肌球蛋白在日本囊对虾组织中普遍表达,并且肌肉组织中表达量最高而鳃和皮肤组织中表达量最低。研究结果为对虾过敏性疾病的诊断和治疗以及脱敏食品开发等奠定了理论基础。     

口虾蛄主要过敏原原肌球蛋白的免疫活性

原肌球蛋白(TM)是甲壳类动物的主要过敏原,其氨基酸序列具有很高的保守性。本研究以口虾蛄为研究对象,旨在探明TM是否是其主要过敏原并对其相关性质进行研究。利用过敏患者血清通过免疫印迹法确定口虾蛄的主要过敏原分子量约为36ku。通过制备丙酮粉、等电点沉淀、硫酸铵盐析及加热等方法纯化了该主要过敏原。采用抗中华绒螯蟹TM多克隆抗体进行免疫学性质分析表明该蛋白为TM。抑制性免疫印迹和抑制性ELISA实验表明口虾蛄TM与凡纳滨对虾和锯缘青蟹等甲壳类动物的TM具有较强的免疫交叉反应,但与贝类动物杂色蛤的免疫交叉性较低。通过ELISA方法对甲壳类动物的TM进行定量测定,结果表明,口虾蛄肌肉中TM的含量约只有凡纳滨对虾TM含量的1/45,但仍具有一定的致敏性。     

肌球蛋白及肌原纤维蛋白凝胶形成能的比较

<正> 前言近年来,鱼糜制品的生产在我国得到了很大的发展。上海、大连、舟山、青岛等地都在生产鱼糜制品。随着我国渔业捕获量的逐年增长,特别是中上层鱼类和小杂鱼产量的增长。进一步开发鱼糜制品,越来越引起水产加工界人士的重视。按照传统的经典理论,鱼糜制品弹性的强弱是基于鱼肉中的肌动球白蛋(Aetomyo-sin)在加热后形成三元网状结构的程度,但其中某些结构原理至今未能得到有力的实验     

不同烹饪方式及体外模拟消化对凡纳滨对虾主要过敏原原肌球蛋白免疫活性的影响

本研究选用水煮、油炸和红烧3种烹饪方式分别处理凡纳滨对虾,并且对烹饪后的虾肉进行体外模拟唾—胃—肠液连续消化,以调查烹饪处理后过敏原原肌球蛋白的免疫活性变化状况。采用电泳、免疫印迹和间接ELISA方法评价样品中主要过敏原原肌球蛋白的变化情况。SDS-PAGE结果显示,3种烹饪处理虾肉样品中TM条带无明显变化,表明TM在烹饪处理时基本不发生降解;免疫印迹和间接ELISA结果显示,水煮、油炸和红烧3种烹饪处理虾肉中TM免疫活性分别降低2.08%、11.33%、15.56%;而烹饪后虾肉的体外模拟消化产物的免疫活性丢失显著,水煮、油炸和红烧处理的免疫活性分别下降86.90%、88.94%、97.39%。研究表明,虾类TM免疫活性的降低主要发生在肠液消化阶段,3种方式烹饪处理能够使TM免疫活性降低,并且红烧处理可明显降低TM的免疫活性。本实验为过敏原消减机制的研究和低致敏性水产品的开发提供了理论依据。     

斑马鱼Mylz2启动子的克隆与转绿色荧光蛋白基因鱼的构建

为获得能在肌肉表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼(Brachydaniorerio),采用PCR方法,从斑马鱼基因组DNA中分离了肌球蛋白轻链2启动子,序列分析表明,该启动子与国外文献报道的斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子序列的相似性为98.6%。将改造后的启动子插入绿色荧光蛋白基因载体,构建成肌肉特异性表达载体。通过显微注射,将线性化的表达载体注入斑马鱼的受精卵,获得了转绿色荧光蛋白基因的斑马鱼。绿色荧光蛋白在胚胎期开始表达,随着鱼体的生长表达量有增加的趋势,成鱼在紫外灯下用肉眼即可观察到绿色荧光。转基因鱼绿色荧光蛋白的表达具有明显的肌肉特异性。本研究为下一步特定基因的表达研究和获得有特色的转基因观赏鱼奠定了基础。     

中国明对虾主要过敏原基因分子克隆与序列分析

就中国明对虾主要过敏原原肌球蛋白基因进行了分子克隆与序列分析.从中国明对虾肌肉中提取总RNA,反转录合成第一链cDNA;根据原肌球蛋白cDNA的保守序列设计引物并进行PCR扩增,最后测序获得了中国明对虾原肌球蛋白的cDNA序列(GenBank accession:GU233303).该cDNA 序列含有长855nt的完...     

斑马鱼雄核发育技术研究

为探索人工诱导斑马鱼雄核发育二倍体克隆鱼的途径和方法,运用紫外线照射卵子使其遗传物质失活,利用斑马鱼体表花纹形态作为遗传标记,使用热休克技术阻止受精卵的第一次卵裂加倍染色体。试验结果表明总辐射剂量为120mJ cm2紫外线照射斑马鱼卵可以使雌核遗传物质完全失活;体表花纹为豹斑花纹被证实是由纯合隐性基因控制的性状,可以作为雄核发育遗传标记;遗传失活卵受精后经2min,(41 5±0 5)℃的热休克后出现两个染色体加倍的高峰期,分别为受精后的11min和23min,且后一时期效果优于前一时期,最高二倍体诱导率达46 15%;经遗传分析,共获得正常存活的雄核发育二倍体克隆鱼19尾,说明经过优化的紫外线结合热休克等染色体操作技术,可以成为诱导雄核发育二倍体克隆鱼的有效手段。     

低温驯化下斑马鱼LINE1的表达检测

长散布核元件-1(Long spread nuclear element-1,LINE1)是跳跃基因。前期比较基因组研究发现,南极鱼经历漫长的低温适应进化后,与南极圈外的同亚目鱼类相比较,在基因水平上LINE1的扩增效率高达8~300倍,但LINE1的扩增与鱼类抵御寒冷之间的关系尚未明了。本实验对斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维细胞ZF4进行了不同时间梯度的低温处理(18℃、5 d和18℃、30 d),同时对斑马鱼成鱼也进行了不同时间的低温处理(10℃,3 h、6 h、1 d、3 d、5 d)。采用RT-qPCR检测了LINE1的mRNA水平,并克隆了斑马鱼LINE1基因启动子区,利用Luciferase双荧光报告系统,在ZF4细胞中验证LINE15’UTR在低温压力下的生物活性。结果显示,短时间低温处理下,ZF4细胞中LINE1 mRNA水平有所降低,而在长时间低温处理中,LINE1的mRNA水平显著升高。在成鱼中,短时间低温处理下,LINE1 mRNA水平降低;长期低温处理下,LINE1 mRNA水平显著升高。在ZF4细胞中发现,LINE15’UTR具有生物活性。在低温处理(18℃,3 d)下,报告基因信号减弱,间接表明LINE1启动子活性减弱。研究结果表明,低温压力会影响LINE1在鱼类中的表达。本研究为进一步探究LINE1在鱼类适应低温环境中的作用机制奠定了基础。     

黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco AMH基因的克隆鉴定及表达

为研究抗缪勒氏管激素AMH对黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco性别分化及生长发育的调控作用,克隆扩增了黄颡鱼AMH基因的全长序列(GenBank检索号MK310106),研究该基因的组织表达模式。结果表明:AMH基因的全长为3588bp,其开放阅读序列为1653bp,编码550个氨基酸,位于第2号染色体上(19371164~19374761bp)。同源性分析表明,与已发布的黄颡鱼Tachysurus fulvidraco的相似性最高,可达99.6%;与低眼无齿[鱼芒]Pangasianodon hypophthalmus及斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus的相似性也很高,分别达75.8%与74.8%,而与哺乳动物相似性较低。系统进化树分析显示:黄颡鱼AMH可与斑点叉尾鮰、低眼无齿[鱼芒]等鲶形目物种聚集成簇。Real-TimePCR检测结果表明:AMH的mRNA在各组织中的表达量差异性极大,在性腺组织中表达量最高,其次是肝脏和脑;1龄精巢的表达量最高,2龄次之,而1、2龄雌鱼的表达量基本相近。AMH对黄颡鱼性腺的分化及生长发育有重要调控作用。     

Ontogeny of sexual differentiation in different strains of zebrafish (Danio rerio)

The zebrafish (ZF) undergoes juvenile hermaphroditism, where in all fish, the gonad first develops as an ovary-like structure, before the sex is fixed and the gonad then differentiates into either a testis or an ovary. Sexual differentiation is being adopted as an endpoint for assessing endocrine disrupting chemicals, yet there is only very limited information on the timing and variability in sexual differentiation process both within and between strains of ZF. In this study, using gonad histology, the ontogeny of sexual differentiation was studied in two strains of ZF, one with a high level of heterozygocity (WIK strain) and another that had been in-bred for several generations. There was a high variability in the timing of sex differentiation between individuals within a specific strain (with no obvious relationship with body mass), but there were no differences between the two strains. Transformation of the immature gonad into testes in males started in week 5 post fertilization (pf) and completion of sexual differentiation for all fish in both study populations occurred by week 11–12 pf. The size of the fish containing transforming gonads in the WIK strain and in-bred strain were similar (ranging from 12 to 23 mm, and from 13 to 22 mm total length, respectively).     

苯硫脲对斑马鱼黑色素生成及早期发育的影响

为探索苯硫脲抑制斑马鱼黑色素生成的最佳浓度及苯硫脲对斑马鱼早期发育的影响,用0.05～2.O mmol/L苯硫脲处理28-体节期斑马鱼胚胎,用1.0～15 mmol/L苯硫脲处理受精后2、10、24 h的斑马鱼胚胎.结果表明,在不同的发育时期,抑制黑色素生成的苯硫脲最佳浓度是不同的;且发育时期越早,斑马鱼对苯硫脲毒性越敏感;苯硫脲低于0.2 mmol/L时对斑马鱼孵化、存活和早期发育无显著影响;0.2 mmol/L苯硫脲导致斑马鱼孵化率降低;0.5～2.0 mmol/L苯硫脲导致斑马鱼的孵化率和存活率均降低,并引起斑马鱼畸形.     

硝基苯对斑马鱼细胞DNA的损伤

硝基苯是重要的人造化工原料,人类的生产和生活使其可能成为水体和环境的污染源。为了解硝基苯对水产动物可能的致毒作用,采用单细胞凝胶电泳（SCGE）方法检测了不同浓度硝基苯染毒后的斑马鱼肝胰脏、肾脏、鳍条表皮和精子细胞DNA的损伤情况。当硝基苯的处理剂量在国家地表水环境质量标准（GB3838-2002）时（0.017 mg/L）,对斑马鱼肝胰脏、肾脏和精子细胞DNA的损伤不明显,分别为30%、33%和44%,与对照组相比差异不显著（P>0.05）;在同样浓度下,鳍条表皮细胞DNA受损率则高达69%。当硝基苯的浓度高于国家地表水环境质量标准时,可引起斑马鱼肝胰脏、肾脏、鳍条表皮和精子细胞DNA的严重损伤。处理剂量为0.106 mg/L时,其受损率分别为48%、62%、61%、82%;0.213 mg/L时分别为42%、87%、76%、56%;在0.425 mg/L时分别为52%、87%、75%、75%;在0.850 mg/L时分别为58%、95%、93%、85%;在1.700 mg/L时分别为62%、90%、99%、83%,以上各处理组与空白对照相比差异显著（P<0.05）。实验结果表明,当水环境中硝基苯的浓度低于国家地表水环境质量标准时,对斑马鱼的体细胞及精子细胞没有明显的毒性作用;硝基苯的浓度高于国家地表水环境质量标准时,对斑马鱼体细胞和精子细胞具有较强的毒害作用,且细胞DNA的受损率随着硝基苯剂量的增加而增加,并呈现一定的剂量损伤效应。因此,渔业水质标准中硝基苯的浓度不应高于国家地表水环境质量标准。     

Limitations for prolonged chilled storage of zebrafish (Danio rerio) embryos

Chilled storage of zebrafish embryos is possible for up to 33 h at 8 °C without a loss in viability. In the present study, higher chilling temperatures in the range of 10–16 °C were tested to extend the storage periods to 65 h. It was also investigated whether prevention of microbiological growth with antibiotics and iodine, and stabilization of the quality of the storage solution by regular changes and constant aeration had an effect on the embryo and larvae viability. At incubation temperatures of 10 and 12 °C, the embryo development was completely arrested; at 14 and 16 °C, it proceeded slowly. At 10 °C, the percentage of embryos developing to the long‐pec stage was significantly lower than those at 12, 14 and 16 °C and in the control. At 10 and 12 °C, the percentage of embryos developing to the long‐pec stage decreased with increasing chilling period, while it remained constant at 14 and 16 °C. All chilling treatments resulted in low hatching rates <25% and many larvae showed malformations. Supplementation of storage solutions with antibiotics and iodine had no effect on the embryo and larvae viability, similar to regular solution changes and constant aeration.     

氧化乐果对斑马鱼的毒性作用及生物富集性研究

为研究斑马鱼(Danio rerio)作为有机磷农药指示生物的可能性,以斑马鱼为实验对象,采用半静态法,研究浓度为0、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/L的氧化乐果对斑马鱼体内蛋白质含量及乙酰胆碱酯酶(Ach E)和过氧化物酶(POD)活性的影响及其对0、2、4、6、8、10 mg/L氧化乐果7 d的富集系数(即BCF7 d),探究氧化乐果对斑马鱼的毒性作用及其生物富集性。结果显示,氧化乐果对斑马鱼的96 h半数致死浓度(LC50)为31.57 mg/L,在1~100mg/L之间,属于高毒药物;蛋白质含量总体表现为先升高、再下降的趋势;Ach E活性受到抑制,总体表现为下降趋势;POD活性表现为诱导-抑制效应;BCF7 d随浓度的增加而减小,为1.54~5.80,且BCF7 d随Ach E活性的降低而降低,毒性作用越大,斑马鱼对氧化乐果的富集作用越弱。研究表明,蛋白质含量和乙酰胆碱酯酶活性与氧化乐果浓度有显著的剂量-效应关系,斑马鱼可以作为有机磷农药污染的指示生物。