结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的二重PCR快速检测试剂盒的研究

根据已发表的结核分枝杆菌23S rRNA和牛分枝杆菌特殊基因序列,设计并合成了2对可扩增结核分枝杆菌和牛分枝杆菌特异性基因片段的引物,建立二重PCR快速检测结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的方法,并研制出检测试剂盒。结果表明,该检测试剂盒对结核分枝杆菌能特异性地扩增出838 bp条带而扩增不出631 bp条带,牛分枝杆菌能特异地扩增出838 bp和631 bp条带,而对其他牛菌株的DNA扩增结果均为阴性;敏感性试验表明最低能检测出50 pg的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌DNA模板;保存期测定结果表明,在-20℃条件下保存至1、3、6、9个月时,试剂盒的敏感性无明显变化,仍能检测到50 pg的DNA模板,保存至12个月时其敏感度仍能100%检出阳性样品。     

应用双重PCR技术快速鉴定结核与非结核分枝杆菌

本研究建立1种双重PCR技术,用于区分鉴定结核与非结核分枝杆菌.在最佳扩增反应条件下.检测引物P1、P2和P3、P4扩增结核分枝杆菌的特异性及敏感性,并对19株结核分枝杆菌和9株非结核分枝杆菌临床分离株进行扩增鉴定.结果表明,引物P1、P2能扩增所试13株结核和非结核分枝杆菌,P3、P4仅扩增结核分枝杆菌复合群菌种,两对引物同时扩增3种非分枝杆菌均为阴性.两对引物双重PCR检测结核分枝杆菌DNA的敏感性分别为100pg/μl和10pg/μl.检测28株临床分离株,结核分枝杆菌可扩增出368bp和225bp 2条带,非结核分枝杆菌仅扩增出一条361bp～383bp带.因此,该双重PCR技术的建立为结核及非结核分枝杆菌的快速鉴定提供了1个可供选择的手段.     

结核分枝杆菌巢式PCR诊断技术的建立和初步评价

以结核分枝杆菌特有的插入序列IS6110设计巢式PCR引物,对痰样本结核分枝杆菌的基因组DNA进行扩增,建立了检测结核病病原的巢式PCR诊断方法,试验验证有较好的特异性和敏感性,采用此方法扩增结核分枝杆菌可以获得244 bp的目的片段,对常见病原菌金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、李氏杆菌、布鲁氏菌等以及无结核病史的痰样本检测阴性,通过扩增不同浓度梯度稀释的模拟阳性痰样本确定了其敏感性为4个拷贝/反应.对送检的41份痰样本采用本方法进行检测,阳性率为60.98;.     

副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆及序列分析

以副结核分枝杆菌C-2株基因组DNA为模板,以hsp65基因特异性引物进行PCR扩增,获得了1 626 bp的DNA片段.通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体.经鉴定,成功地构建出了重组质粒pGEM-T-hsp65.序列分析结果表明:该序列与GenBank中副结核分枝杆菌K～10株的同源性为99.2%.     

牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌三重PCR快速检测方法的建立

为建立快速、准确的检测牛呼吸道主要病原菌牛支原体(Mycoplasma bovis)、牛多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)及牛结核分枝杆菌(M.tuberculosis)的方法,对牛支原体oppD基因序列、牛多杀性巴氏杆菌Pm-kmt基因序列、牛结核分枝杆菌IS6110基因序列分别设计特异性引物,对单一PCR检测方法进行优化后建立三重PCR检测方法。结果表明:三重PCR的最佳扩增条件为94℃预变性10min;94℃1min,60℃50s,72℃1min,循环30次;72℃延伸10min。建立的三重PCR方法能对同一样本中的3种病原菌进行扩增,特异性强。牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌和牛结核分枝杆菌的最低检测DNA浓度分别为5.306×10~(-3)ng/μL、3.075×10~(-2)ng/μL和1.605×10~(-4)ng/μL。建立的三重PCR方法临床检测牛支原体肺炎鼻拭子、牛结核分枝杆菌、结核菌素与单一PCR检测方法的阳性符合率为100%。三重PCR检测方法可用于牛支原体、牛多杀性巴氏杆菌、牛结核分枝杆菌的单一和混合感染鉴别诊断,具有快速、准确、简便的特点。     

禽结核分枝杆菌在11种培养基上生长特性的研究

本文对禽结核分枝杆菌在１１种培养基上的生长特性进行了观察，结果表明在鸡蛋为基础的培养基中以Ｌｏｗｅｎｓｔａｉｎ－Ｊｅｎｓｅｎ培养基为佳；琼脂培养基适于禽结核分枝杆菌的生长，但易干裂，不利于长期培养和保存；禽结核分枝杆菌在液体培养基中生长迅速，以苏通氏培养基中生长较为理想，但易污染。本文还测定了培养基中不同浓度甘油对禽结核分枝杆菌的生长的影响，发现甘油能刺激禽结核分枝杆菌的生长，培养基中的甘油浓度在４％～１０％时生长最为旺盛，超过１０％时生长受到抑制，不能生长；不含甘油时，禽结核分枝杆菌生长较贫瘠。     

光镜观察液体培养基中结核与非结核分枝杆菌生长形态的比较

目的比较光镜下结核杆菌与非结核分枝杆菌液体培养物的生长形态。方法回顾性分析1317例BACTEC TB-460和BACTEC TB-960培养系统阳性培养基抗酸染色菌体的形态资料,并与菌种鉴定结果进行比较。结果在菌种鉴定为结核分枝杆菌的1160例菌株中,细菌呈索状生长者1149例(占99.05%),非索状(分散状、短杆状、点粒状)生长者11例(占0.95%);在菌种鉴定为非结核分枝杆菌的157例菌株中,细菌呈索状生长者26例(占16.56%),非索状生长者131例(占83.44%),两者比较有统计学意义(P<0.01)。结论根据光学显微镜下分枝杆菌在液体培养基中的生长形态,可快速将分枝杆菌初步分为结核分杆菌与非结核分枝杆菌。     

结核性腹膜炎的诊断现状和进展

结核性腹膜炎（TBP）I临床表现多样而无特异。尽管各种标本中结核分枝杆菌的培养阳性是TBP诊断的“金标准”．但阳性率极低。TBP时腹水中细胞分类多以淋巴细胞为主．血清腹水蛋白梯度（SAAG）均〈llg／L．腹水腺苷脱氨酶（ADA）升高对诊断TBP有极高的敏感性和特异性。BACTEC放射方法能快速分离出结核分枝杆菌。TBP时B超和CT检查引导下腹膜活检有很高的诊断价值。TBP腹腔镜镜下具有特征性改变．无论是否联合腹膜活检加组织学检测．都是诊断TBP最好的方法。利用基因扩增检测结核杆菌的DNA或RNA，以及利用免疫学检查检测结核杆菌特异性抗原等方法有待进一步研究。多项检测的联合应用是早期诊断TBP的有效途径。     

一种快速提取野生稻总DNA的方法

在常规CTAB的基础上建立一种快速提取纯化野生稻总DNA的方法，这种快速提取法能在短时间内处理大批量的材料，具有简便、快速、经济、稳定等优点。用这种方法提取的DNA作为模板进行PCR扩增，和用常规的CTAB法提取的DNA作为模板结果一致。因此，用这种方法提取的DNA质量完全可以满足植物分子标记分析的需要。