稻瘟病菌温度敏感型突变体的筛选

通过紫外诱变,筛选获得了274个稻瘟病菌的温度敏感型突变体,这些突变体在25℃下可以生长,而在33℃下不能生长。致病性测定结果表明,有32个突变体的致病性显著降低; 在33℃条件下,不萌发的有7个;有12个萌发后停止生长,不能形成附着胞;有9个可以形成附着胞,以后停止生长;有4个形成膨大透明且成串生长的附着胞,随后停止生长。有些温度敏感型突变体形成子囊壳的能力也发生了改变。     

稻瘟病菌MoRho2基因功能初步分析

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)是研究病原真菌生长发育及致病机理的重要模式生物。Rho家族蛋白是一类具有GTP酶活性的GTP结合蛋白,在多种细胞信号转导通路中起着分子开关的作用。通过生物信息学方法分析Mo Rho2的理化性质、蛋白结构域等信息,并推测其潜在功能。为进一步明确Mo Rho2蛋白的功能,利用基因敲除技术获得Mo Rho2基因的敲除突变体。表型分析结果表明,与野生型菌株相比,Mo Rho2敲除突变体的菌丝生长速度、分生孢子形态、附着胞形态、产孢量、对植物的毒力等方面均无明显的差异,但分生孢子萌发和附着胞形成略滞后于野生型菌株。突变体能够产生正常的侵入栓并侵入洋葱表皮。综上所述,Mo Rho2基因可能参与稻瘟病菌分生孢子的萌发和附着胞的形成,结果为进一步揭示基因Mo Rho2的生物学功能奠定基础。     

香蕉黑星病菌侵入前发育的Ca2+/CaM依赖信号研究

测定Phyllosticta musarum 在不同疏水性的人工表面上的孢子萌发率和附着胞形成率,以及Ca2+,CaM依赖信号系统是否参与了P.musarum侵入前阶段的发育调控.结果表明,P.musarum在侵染寄主时形成一种专门的附着胞作为侵染结构,刚性的疏水表面有利于诱导P musarum分生孢子的萌发.刚性表面则有利于附着胞的形成,而对这种与侵染相关的特化结构即附着胞的发育影响不显著.加入外源Ca2+,不论浓度如何都能促进分生孢子萌发,而附着胞形成率在高浓度外源Ca2+存在时则明显下降.Ca2+敖合剂EGTA有抑制孢子萌发和附着胞形成的作用,但在EGTA中加入Ca2+载体A23187和CaCl2可部分缓解EGTA的这种抑制作用.磷酸酯酶C(PLC)抑制剂Neomycin可以抑制附着胞形成.Ca2+通道阻断剂TMB-8和Nicaldipine,CaM拈抗剂Chloropromazine在微摩尔剂量水平上均可抑制附着胞形成.证明由Caz+/CaM信号系统控制的生化过程参与了P.musarum在寄主香蕉表面侵入前的形态建成.     

稻瘟病菌丝氨酸/苏氨酸磷酸酶MoPpz1的功能研究分析

稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）是一种在水稻不同生育期均能引起病害的真菌。在真核生物中,蛋白激酶CK2高度保守,包含2个调节亚基和2个催化亚基。稻瘟病菌中MoCKb1和MoCKb2分别编码MoCK2的2个调节亚基,MoCKa编码稻瘟病菌MoCK2的催化亚基。运用反向遗传学策略和同源重组原理,对MoCKa-GFP的pull-down实验结果中获得的一个丝氨酸/苏氨酸磷酸酶MoPpz1进行功能分析。经过生物信息学研究分析发现Ppz1在不同的真菌中具有不同的功能,同时与其他模式真菌的Ppz1蛋白序列具有较高同源性。在获得基因敲除突变体后,通过表型分析发现,与野生型Ku80相比,ΔMoppz1突变体菌落的营养生长和产孢量等方面均无明显差异,但分生孢子的萌发和附着胞的形成滞后于野生型菌株,且对水稻的致病能力减弱。激光共聚焦显微分析表明,MoPpz1定位在菌丝、分生孢子和附着胞的细胞质中。综上所述,蛋白磷酸酶MoPpz1可能参与稻瘟病菌分生孢子萌发、附着胞形成以及对水稻致病性的调控。     

稻瘟病菌分生孢子发芽和附着胞形成的影响因素研究

在8种培养基膜,多种cAMP、IBMX浓度梯度的琼脂表面膜,不同营养液及pH值条件下,研究了稻瘟病分子孢子发芽和附着胞形成的状况,并对稻瘟病拮抗细菌培养液的作用进行了研究。稻瘟病菌(Magnaporthe grisea) 91-11B1的分生孢子悬浮液浓度在10000~1000个/mL 和pH值在7.0为最适孢子萌发条件,但不影响附着胞的形成。疏水基物表面、营养饥饿或洋葱表皮细胞表面可以刺激附着胞形成。2.5 mmol/L cAMP和8.0 mmol/L磷酸二酯酶抑制剂IBMX显著地促进附着胞的形成。与去离子水和水洗法相比,自来水和振落法获得的分生孢子更有利于附着胞的形成。筛选到3株对孢子发芽及附着胞形成有强烈抑制作用的拮抗细菌     

ATP硫酸化酶基因MoMET3在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的功能分析

【目的】真菌对硫元素的利用始于ATP硫酸化酶对硫酸根离子的活化。对稻瘟病菌ATP硫酸化酶在病菌生长发育和致病过程中的功能进行分析,可为稻瘟病的防治提供药物靶标。【方法】采用同源重组方法构建基因敲除载体,并对突变体的表型进行分析。【结果】Mo MET3基因是病菌营养生长和分生孢子形成所必需的,但不是毒力因子。稻瘟病菌ATP硫酸化酶编码基因Mo MET3缺失后,突变体营养生长速率减慢,产孢量降低,但是突变体对寄主的毒力不受影响;虽然基因缺失不影响突变体分生孢子萌发和附着胞成熟,但突变体在硫营养限制时孢子萌发后次生菌丝的生长明显受抑。Mo MET3基因互补后,突变体恢复正常生长,能利用硫酸盐。【结论】无机硫的还原对分生孢子的萌发和附着胞的成熟并不是必需的,分生孢子内储存的还原态硫化合物可以满足这一过程中硫营养的需求,但病菌侵入寄主组织后需要吸收利用寄主源还原态硫以利于侵染菌丝的扩展。     

三环唑影响玉米大斑病菌致病力的机制

玉米大斑病菌主要通过附着胞的机械穿透力侵染寄主,三环唑能够降低玉米大斑病菌对寄主的致病力。对三环唑培养下玉米大斑病菌附着胞形成、膨压变化过程以及病菌的侵染效能等进行分析,探讨三环唑抑制玉米大斑病菌侵染的机制。结果表明,5μg/m L三环唑药剂培养下的玉米大斑病菌在附着胞发育时期和附着胞成熟期的膨压较不加药剂处理分别下降了0.22 MPa和1.72 MPa,接菌后72 h对寄主的侵染效率也明显下降,三环唑主要通过影响成熟期附着胞形成高膨压降低病菌的侵染能力。     

水稻蜡质稀少突变体wax1的鉴定及基因定位

【目的】蜡质是植物表面的一种重要保护物质,筛选和鉴定水稻蜡质相关突变体有助于解析水稻蜡质形成的遗传机制。【方法】利用EMS诱变籼稻品种湘早籼6号,从突变体库中筛选出一个蜡质稀少的突变体wax1,考查突变体的形态特征和农艺性状,利用突变体与02428杂交的F_2群体定位目标基因,并通过荧光定量PCR分析相关基因的表达情况。【结果】与野生型相比,wax1突变体具有叶片短小皱褶、叶表面蜡质晶体减少、穗长变短等形态特征;在农艺性状方面,突变体的株高、每穗总粒数和千粒重显著降低,但有效穗数显著高于野生型;遗传分析表明,wax1的突变表型受一对隐性核基因控制,将WAX1基因定位在第10染色体上SSR标记RM5806与InDel标记P1之间,物理距离约为49.8 kb;定位区间内的测序结果表明,突变体中β-酮脂酰-CoA合酶的编码基因发生单碱基突变,导致催化活性中心的一个氨基酸发生改变。WAX1基因的突变显著提高了同源异型盒基因OSH6的表达,同时引起部分IAA基因的差异表达。【结论】WAX1基因突变引起叶表面蜡质晶体的减少,同时通过影响茎尖分生组织和生长素的信号转导引起植株生长发育等多方面的异常。     

水稻蜡质稀少突变体wax1的鉴定及基因定位

【目的】蜡质是植物表面的一种重要保护物质，筛选和鉴定水稻蜡质相关突变体有助于解析水稻蜡质形成的遗传机制。【方法】利用EMS诱变籼稻品种湘早籼6号，从突变体库中筛选出一个蜡质稀少的突变体wax1，考查突变体的形态特征和农艺性状，利用突变体与02428杂交的F2群体定位目标基因，并通过荧光定量PCR分析相关基因的表达情况。【结果】与野生型相比，wax1突变体具有叶片短小皱褶、叶表面蜡质晶体减少、穗长变短等形态特征；在农艺性状方面，突变体的株高、每穗总粒数和千粒重显著降低，但有效穗数显著高于野生型；遗传分析表明，wax1的突变表型受一对隐性核基因控制，将WAX1基因定位在第10染色体上SSR标记RM5806与InDel标记P1之间，物理距离约为49.8 kb；定位区间内的测序结果表明，突变体中β-酮脂酰-CoA合酶的编码基因发生单碱基突变，导致催化活性中心的一个氨基酸发生改变。WAX1基因的突变显著提高了同源异型盒基因OSH6的表达，同时引起部分IAA基因的差异表达。【结论】WAX1基因突变引起叶表面蜡质晶体的减少，同时通过影响茎尖分生组织和生长素的信号转导引起植株生长发育等多方面的异常。     

三唑酮种衣剂对小麦幼苗上白粉病菌萌发和侵染影响的组织学观察

采用组织病理学染色技术 ,观察和测定了三唑酮种衣剂包衣处理的小麦幼苗上白粉病菌孢子萌发、侵染的发展过程。结果表明 ,药剂处理对白粉病菌初生芽管、附着胞芽管的萌发及成熟附着胞的形成无抑制作用 ,但明显提高附着胞的畸形率 ;抑制初生吸器原体的形成和指状体的发育 ,降低入侵率 ;抑制初生菌丝的发育、次生菌丝和次生吸器的形成。分析认为 ,三唑酮种衣剂包衣处理在降低小麦白粉病菌的初始菌源数量和控制白粉病的流行危害中具有重要作用     

胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子分析

利用根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化体系转化杞果炭疽菌SC2菌株,共获得抗潮霉素B突变体4 680个,平均每转化1.0×106个炭疽菌分生孢子可得到300～980个突变体,且潮霉素抗性在多次传代实验中得到稳定遗传.随机挑取38个突变体进行PCR检测,均可扩增出1条约1.2 kb的目标谱带,说明突变体为T-DNA插入引起:进一步的Southern blot杂交分析结果表明,在随机挑选的20个突变体中,有1个(5%)为三拷贝T-DNA插入,4个(20%)为双拷贝插入,剩余的15个(75%)为单拷贝插入.     

CRISPR/Cas9系统编辑水稻Wx基因

【目的】 直链淀粉含量与稻米品质密切相关。Wx基因是控制水稻直链淀粉合成的主效基因,通过对Wx基因定点编辑以获得稳定遗传、直链淀粉含量适宜的突变体。【方法】 构建CRISPR/Cas9表达载体pGK03-Wx-gRNA (靶点1和2分别在Wx基因第1和第2外显子),利用工程菌EHA105遗传转化超级稻楚粳27,潮霉素筛选获得转化株系,对转化株系及其后代进行分子检测、测序、基因表达和遗传稳定性分析以及直链淀粉含量测定。【结果】 获得9个独立的T₀代转化株系,靶点1(L1~L5) 5个株系,突变频率100%,靶点2(L6~L9) 4个株系,突变频率75%。由T₀代突变体衍生出T₁和T₂代株系,测序发现T₀、T₁和T₂代株系出现缺失(单、双、多碱基缺失)和单碱基插入两种突变类型;T₀至T₁代部分株系(L1、L2、L3和L6)发生再编辑,T₁至T₂代遗传稳定。与野生型相比,突变株系RNA水平Wx基因表达量显著下降(P<0.01),稻米直链淀粉含量显著降低(P<0.01),从17.5%降到1.93%。【结论】 利用CRISPR/Cas9系统成功编辑水稻Wx基因,获得了稳定遗传、低直链淀粉含量的突变体,为稻米品质改良提供了材料。     

油菜黑胫病菌T-DNA插入诱变因素优化及突变体筛选

油菜黑胫病是由Leptosphaeria biglobosa引起的一种真菌病害。这种病害在我国油菜产区广泛发生,并造成一定的经济损失。为通过获取突变体来研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制,本文优化了影响农杆菌介导转化（ATMT）油菜黑胫病菌L. biglobosa菌株Lb731的因素,评估转化子质量,并筛选相关突变体。结果明确了农杆菌介导转化菌株Lb731的最佳因素：潮霉素B浓度为50 μg/mL,转化受体（分生孢子）培养时间为15 d (20℃),浓度为2 × 10^7~8孢子/mL,农杆菌-受体共培养温度为25℃,共培养时间为72 h。在最适条件下的转化效率达到80个转化子/百万分生孢子。T-DNA插入基因组的频率为100%,单拷贝插入频率为72.7%,转化子抗潮霉素性状能稳定遗传。从2136个转化子中获得了11个菌丝生长减缓突变体,7个色素产生缺陷突变体和14个分生孢子产生缺陷突变体,并从这些突变体中鉴定出7个致病力丧失突变体。采用hiTAIL-PCR技术,从3个突变体中获得了T-DNA插入位点侧翼序列。上述结果为深入研究L. biglobosa的生态适应性机制及致病机制提供了材料和线索。     

农杆菌介导的芒果胶孢炭疽菌遗传转化及致病性缺陷突变体的筛选

构建含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体pCAMBgfp,以其为转化载体用农杆菌EHA105介导的方法对芒果胶孢炭疽菌Cg-8菌株进行遗传转化,以潮霉素抗性和GFP荧光来筛选阳性转化子。然后,通过离体接种芒果叶片和果实观察病斑大小筛选致病性缺陷转化子。结果获得500个阳性转化子,转化效率为平均106个孢子可获得400个左右同时具有潮霉素抗性和GFP荧光的阳性转化子,且其经多次在无潮霉素的培养基上传代后能得到稳定遗传。随机挑选其中13个突变体进行PCR检测,均可扩增出潮霉素基因目的条带,致病性分析从中筛选得到8个致病性减弱或缺失突变体。     

稻瘟病菌中小G蛋白Rho3的假定互作蛋白MoKin1的功能分析

小G蛋白MoRho3在稻瘟病菌生命活动中具有重要的生物学功能。前期研究表明,MoRho3的缺失对于稻瘟病菌分生孢子的形态建设、附着胞萌发和侵入能力以及对宿主的致病性等表型都存在严重缺陷。为了进一步解析MoRho3在稻瘟病菌中的网络调控途径,通过生物信息学的方法预测了MoRho3的互作蛋白。在众多假定互作蛋白中,蛋白激酶MoKin1与酿酒酵母中KIN1和KIN2是同源蛋白。在酵母细胞中,KIN1和KIN2可以抑制△rho3的表型缺陷。为了验证在稻瘟病菌中MoKin1与MoRho3之间是否存在着相似的调控途径,本研究通过分析MoKin1与同源蛋白的进化关系,序列结构,定位状态以及相关的互作蛋白,揭示了MoKin1的功能特点,为后续病原菌中MoKin1与MoRho3互作机制的研究,以及病原菌致病机制的解析提供了新的思路和方向。     

香蕉枯萎病菌内源报告基因细胞周期蛋白C1基因FocFCC1的鉴定及分析

本研究克隆鉴定了香蕉枯萎病菌4号生理小种（Foc4）的细胞周期蛋白C1（Fusarium Cyclin C1,FCC1）基因FocFCC1,采用Split-marker同源重组技术获得基因敲除突变体ΔFocFCC1,通过比较突变体和野生菌株在生长速度、产孢量和致病力等方面的差异,探索了FocFCC1基因缺失对香蕉枯萎病菌生物学功能的影响,并评估了FocFCC1作为枯萎菌内源报告基因的可行性。结果表明：与Foc4野生型菌株相比,ΔFocFCC1菌丝生长缓慢、菌丝畸形及产孢量减少,对巴西蕉苗的致病力明显减弱,推测FocFCC1基因在Foc4的生长发育、产孢及致病力等方面具有重要作用。以FocFCC1为靶标基因,评估了两种基因敲除重组方法介导的基因敲除效率,利用红色表型作为判断依据,挑取再生板上有红色表型的转化子进行PCR检测,Split-marker重组方法获得阳性转化子比例为91.7%,而多片段装配融合方法获得阳性转化子的比例为64%。ΔFocFCC1出现典型红色菌落,红色表型与PCR检测的FocFCC1阳性敲除转化子一一对应,FocFCC1基因敲除后红色表型肉眼容易分辨,可作为香蕉枯萎病菌内源报告基因探索新的遗传操作技术在该菌上应用的可行性。     

利用显性选择标记基因转化稻瘟病菌（英文）

 利用抗药性标记基因(Hygromycin B, hygB)建立稻瘟病菌的转化系统。结果表明， Aspergillus的TrpC转录信号与细菌的hygB抗性结构基因重组的质粒pCSN43可取在稻瘟病菌中表达，该质粒与受体菌无同源顺序，因而有利于对转化菌株进行筛选和分析。 电激法和PEG/Ca^2＋ 法均适用于转化稻瘟病菌，但后者的转化效率比前者高。     

农杆菌介导的稻瘟病菌转化及致病缺陷突变体筛选

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子。通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传。Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T DNA插入是单拷贝的。用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体：A1 412。该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1 412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断。进一步的表型分析发现A1 412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟。Southern 杂交显示A1 412基因组中T DNA插入是单拷贝的。上述结果表明,A1 412突变体表型的改变可能是由于T DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致。