橡胶树胶孢炭疽病菌致病相关基因CgATG8的功能分析

ATG8是病原真菌中细胞自噬过程中的重要基因,并参与致病过程。基于橡胶树胶孢炭疽菌HBCg01全基因组数据库,采用PCR和RT-PCR扩增得到橡胶树胶孢炭疽病菌的CgATG8基因并进行序列分析。采用Split-Marker Recombination法获得该基因的敲除转化子。表型分析结果表明,缺失该基因后,橡胶树胶孢炭疽病菌的致病力丧失,产孢能力、孢子萌发率、附着胞形成率和膨压均降低,而且孢子萌发和附着胞的形成延迟。     

橡胶树炭疽病菌rDNA-ITS区序列分析

应用核糖体rDNA-ITS区的序列分析研究18个不同地区来源的橡胶树炭疽病病原菌。结果表明:测试菌株的ITS扩增区(ITS3-ITS4)约为300bp,无太大的长度变异。ITS核酸序列聚类分析的结果表明:18个测试菌株被聚为2个类群,群与群之间差异不明显,2组之间同源率大约为99.3%,通过在NCBI网站的blast比对分析,结果显示2组均为胶孢炭疽菌(Colletrichum gloeosporioides)。     

茶炭疽病菌毒素的致病活性及理化性质初探

研究发现茶炭疽病菌Gloeosporium theae-sinensis Miyake产生有致病力的外毒素,引起茶树叶片坏死,形成枯斑,类似于病原菌侵染形成的症状。对该菌的培养毒素滤液进行了生物测定,以探讨最佳产毒条件和理化性质。得最佳产毒条件：pH=5.0、25℃且于Czapek-Dox培养液中连续振荡培养16βd。将茶梢浸入毒素滤液而感毒,而后用于茶炭疽病菌毒素生物测定的方法比较合适。     

海南省3种油茶炭疽病菌的致病力及其生物学特性研究

为了弄清海南省不同油茶炭疽病菌致病力差异及生物学特性,采用刺伤接种法对3种油茶炭疽病菌(C.fructicola、C.siamense、C.camelliae)的致病力进行测定,发现不同病原间致病力存在显著差异,其中C.fructicola致病力最强,C.siamense致病力次之,C.camelliae致病力最弱。对3种炭疽病菌生物学特性研究发现,3种病菌最适生长温度、p H值及光照条件类似,同时均可利用多种碳、氮源,但不同病菌生长的最优碳源、氮源有一定差异。C.fructicola的产孢量、分生孢子萌发率及附着胞形成率均高于C.siamense及C.camelliae。不同油茶炭疽病菌生物学特性的差异可能与其致病力分化有关。本研究结果将为进一步研究不同油茶炭疽病菌致病差异机制提供理论依据。     

橡胶树胶孢炭疽菌P型ATP酶基因CgATPase 01的敲除及表型分析

为了了解橡胶树胶孢炭疽菌的一个钙转运P型ATP酶基因Cg ATPase01的功能,本研究利用Splitmarker技术构建敲除载体,通过PEG介导原生质体转化对橡胶树胶孢炭疽菌菌株HBCg01的Cg ATPase 01基因进行敲除,根据表型变化及致病性检测对其功能进行分析。结果表明:通过Split-marker方法获得了敲除突变体△Cg ATPase01,表型分析发现该突变体与野生菌株间存在明显差异,病菌气生菌丝的颜色发生了改变,生长速率降低,产孢量下降,对橡胶树叶片的致病性减弱,推测该基因可能在橡胶树胶孢炭疽菌的产孢、生长发育和致病性等方面具有重要作用。本研究结果为进一步研究胶孢炭疽菌P型ATP酶基因功能和病原菌的致病机理奠定了基础。     

玉米矮秆突变体A2的表型鉴定及转录组分析

玉米矮秆突变体A2由PH6WC经EMS诱变获得,对该突变体进行表型鉴定、遗传分析、GA_3敏感性和转录组分析。结果表明,A2较其野生型株高显著降低10.13%,节间数减少和节间长度缩短,从而导致植株矮化;A2突变表型受单隐性基因控制;A2对赤霉素敏感,外源GA_3可恢复其表型。转录组分析发现,共有74个差异表达基因(DEGs)。KEGG分析表明,这些DEGs显著富集在类胡萝卜素合成通路、戊糖和葡萄糖酸盐相互转化等通路上。     

芒果炭疽病菌生防细菌的筛选,鉴定及生防潜能的初步研究

从热带作物,果树,蔬菜的叶,果上和根系周围土壤中分离到了１１０个芽孢杆菌分离物,以炭疽病菌－芽隐杆菌对峙培养法筛选出拮抗力较强的Ｂａ２４,Ｂａ６和Ｂａ２３。经形态特征,培养特性和生理生化性状的测定,这３株芽孢杆菌被鉴定为桔芽孢杆菌。抑菌谱的测定结果表明,这３株芽孢杆菌为广谱性的拮抗菌。经离心,过滤,除去菌体后的Ｂａ２４,Ｂａ,Ｂａ２３的培养滤液对芒果炭疽病菌的菌丝生长和分生孢子萌发均有较好的抑制作     

抗多菌灵的芒果炭疽病菌的杀菌剂筛选及其交互抗性测定

为筛选抗多菌灵的芒果炭疽病菌的杀菌剂,采用生长速率法测定23种杀菌剂对8株抗、感多菌灵的芒果炭疽病菌(Colletotrichum gtoeosporioides Penz.)的室内毒力.通过EC50值、EC90值及杀菌剂间的交互抗性测定等综合分析表明:对芒果炭疽病菌毒力最强的杀菌剂是咪鲜胺,其平均EC50值和EC90值分别为0.04、0.21μg/mL;苯醚甲环唑、丙环唑、吡唑醚菌酯、氟硅唑、氟硅唑·恶唑菌酮、戊唑醇、腈菌唑和多抗霉素对芒果炭疽病菌的毒力也较强,与多菌灵不存在交互抗性,这9种杀菌剂均可作为防治芒果炭疽病的首选杀菌剂.另外,三唑酮、异菌脲、三环唑和代森锰锌也有较好的抑菌效果,可用于芒果炭疽病的防治.通过交互抗性分析,在苯并咪唑类杀菌剂之间,苯并眯唑类杀菌剂与烯唑醇,嘧菌酯、醚菌酯与腈菌唑·醚菌酯,嘧菌酯、醚菌酯与三唑酮,苯醚甲环唑与氟硅唑·恶唑菌酮之间存在交互抗性;而百菌清与嘧菌酯、醚菌酯和腈菌唑·醚菌酯,恶霉灵与嘧菌酯、醚菌酯、腈菌唑·醚菌酯和三唑酮之间存在负交互抗性.     

水茄提取物对香蕉和芒果炭疽病菌的活性研究

前期研究发现水茄甲醇提取物有优良的抑菌活性,为明确水茄甲醇提取物的活性分布和进一步直接开发利用作技术储备,采用生长速率法研究水茄甲醇提取物不同溶剂萃取相及水茄植株不同部位提取物对香蕉炭疽病菌和芒果炭疽病菌的抑制活性。结果表明：氯仿萃取相对2种病原菌的抑制活性显著高于其它溶剂萃取相,在5 mg/mL氯仿萃取相的抑菌率分别为64.50％、73.28％,EC50分别为2.104 9、1.642 6 mg /mL;对不同部位甲醇提取物的活性研究表明,在1 mg/mL叶部提取物对香蕉炭疽病菌和芒果炭疽病菌抑制率分别82.70％和84.41％,EC50分别为0.379 8、0.195 2 mg/mL,茎部提取物对二者的抑制率分别为68.27％和71.54％,EC50分别为0.476 4、0.431 4 mg/mL,叶部提取物对二者抑制活性最好,其次为茎部,根部提取物活性最低。     

胶孢炭疽菌T-DNA插入突变体库的构建及其分子分析

利用根癌农杆菌介导的T-DNA插入遗传转化体系转化杞果炭疽菌SC2菌株,共获得抗潮霉素B突变体4 680个,平均每转化1.0×106个炭疽菌分生孢子可得到300～980个突变体,且潮霉素抗性在多次传代实验中得到稳定遗传.随机挑取38个突变体进行PCR检测,均可扩增出1条约1.2 kb的目标谱带,说明突变体为T-DNA插入引起:进一步的Southern blot杂交分析结果表明,在随机挑选的20个突变体中,有1个(5%)为三拷贝T-DNA插入,4个(20%)为双拷贝插入,剩余的15个(75%)为单拷贝插入.     

橡胶树胶孢炭疽菌T-DNA标记基因Lv1初步分析

通过对实验室已构建的胶孢炭疽菌T-DNA突变体库中各突变体致病力的测定,获得致病力丧失突变菌株T-900,利用TAIL-PCR克隆标记基因侧翼序列,进行比对和序列分析,获取假设基因Lv1的全序列,采用生物信息学方法进行Lv1基因预测及功能分析,最后通过敲除野生型菌株RC178中的基因Lv1进行功能分析。结果表明,获取的假定基因Lv1全序列共4 450 bp,基因预测显示T-DNA侧翼序列位于预测基因的1 727 bp处,正好处于预测基因的第1个外显子内;并且推测该基因为组蛋白H3基因,含有2个内含子,3个外显子;功能验证结果发现敲除突变体△T-900-16与T-900致病力表现一致,推测Lv1基因与RC178的致病力相关。     

芒果炭疽病菌多重巢式PCR检测体系建立及田间快速检测

以芒果炭疽病病原菌rDNA-ITS为靶标,建立并完善多重巢式PCR检测技术,结合常规形态学特征分析,对中国华南地区10个田间样品进行检测分析.结果表明:该技术特异性强、灵敏度达2fg/μL、重复性强、可操作性强,能同时检测、区分2种病原菌,能够应用于田间炭疽病害的检测工作,也是常规形态学鉴定的补充.利用该技术检测到田间芒果炭疽病存在胶孢、尖孢2种病原菌的复合侵染,该结果为后续开展有效防控措施提供理论指导和技术支撑.     

农杆菌介导的芒果胶孢炭疽菌遗传转化及致病性缺陷突变体的筛选

构建含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体pCAMBgfp,以其为转化载体用农杆菌EHA105介导的方法对芒果胶孢炭疽菌Cg-8菌株进行遗传转化,以潮霉素抗性和GFP荧光来筛选阳性转化子。然后,通过离体接种芒果叶片和果实观察病斑大小筛选致病性缺陷转化子。结果获得500个阳性转化子,转化效率为平均106个孢子可获得400个左右同时具有潮霉素抗性和GFP荧光的阳性转化子,且其经多次在无潮霉素的培养基上传代后能得到稳定遗传。随机挑选其中13个突变体进行PCR检测,均可扩增出潮霉素基因目的条带,致病性分析从中筛选得到8个致病性减弱或缺失突变体。     

稻瘟病菌T-DNA插入突变体库构建及致病相关突变体筛选

利用农杆菌T-DNA介导的遗传转化体系转化稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)Y34菌株,平均每转化1.0×106个稻瘟病菌分生孢子可得到约300个抗潮霉素菌株。用该转化体系转化和筛选,获得抗潮霉素菌株6855个。PCR检测结果表明,所有表现抗潮霉素菌株均含抗潮霉素基因,说明抗潮霉素特性是T-DNA携带潮霉素基因插入Y34基因组的表型效应,即抗潮霉素菌株是T-DNA插入突变体。对56个突变体DNASouthern检测结果表明,有27个突变体是单拷贝插入,突变体T-DNA插入拷贝数平均为1.43。随机取1600个突变体进行致病力测定,结果发现23个突变体完全丧失致病能力。     

胶孢炭疽菌致病性减弱突变菌株H800 T-DNA插入位点侧翼基因的克隆

对农杆菌介导转化引起的致病性减弱突变菌株H800的菌落形态、孢子形态、菌丝体生长速率、孢子萌发率和致病力等生物学特性进行研究,并利用TAIL-PCR方法克隆T-DNA插入位点基因,结合生物信息学分析该基因功能与H800表型变化及致病性减弱的关系。结果表明,突变菌株H800的致病力低于野生型菌株CH008;生长速率为0.83 cm/d,亦显著低于CH008的1.13 cm/d;产孢量和分生孢子大小与CH008无明显差异;孢子萌发率为2.58％,显著低于野生型的95.98％;序列分析显示,T-DNA已插入StCg800基因的启动子区域,基因结构分析表明,StCg800基因编码区全长774 bp,无内含子,可编码257个氨基酸多肽的StCg800蛋白。该蛋白是不稳定的水溶性蛋白,亚细胞定位于细胞质,且无信号肽,推测为生长因子类的酶,但功能尚未知。     

橡胶树尖孢炭疽菌分子检测及遗传多态性分析

根据GeneBank中Colletotrichum属的20个种的ITS序列,比较设计出1对引物CAF53/CAR356(CAF53 5’-GGG CAG GGG AAG CCT CTC G-3’;CAR356 5’-AGC GGT GCT TGA GGG TTG-3’);该引物可以扩增出1条303 bp的尖孢炭疽菌特异性DNA条带。并利用ISSR和RAPD分子标记技术对从海南、广东、广西和云南等垦区橡胶树上收集的21个尖孢炭疽菌株进行遗传多态性分析,以杧果上分离的尖孢作为参照菌株进行了聚类分析。结果表明,RAPD的平均遗传相似系数为0.8,ISSR的平均遗传相似系数为0.7,2种分子标记的平均遗传相似系数基本一致,均可揭示尖孢炭疽病菌的遗传多态性;2种分子标记产生的聚类分析结果存在一定差异;ISSR和RAPD类群与菌株的地理来源均不存在相关性。     

芒果胶孢炭疽病菌对土槿皮乙酸抗性突变菌株的诱导及其生物适合度分析

土槿皮乙酸（pseudolaric acid B, PAB）是一个结构独特的天然二萜酸,前期发现该化合物对芒果胶孢炭疽菌等多种植物病原真菌具有广谱的抑菌活性,但其杀菌作用机制未知。本研究以芒果胶孢炭疽菌菌株JB-Q为供试对象,采用药剂驯化、紫外照射和钴辐射等方法诱导产生抗PAB的突变体,并分析抗性菌株的生物适合度。结果表明,仅药剂驯化法得到了18株不同抗性水平且可稳定遗传的抗PAB的胶孢炭疽菌,抗性频率为1.69×10^-7。适合度研究表明,所有供试菌株在15~35℃范围内均能生长,且在25℃时菌丝生长速率达到最大值;而不同抗性水平的突变菌株的生长速率存在一定差异,其中低抗菌株>亲本菌株>中抗菌株>高抗菌株;渗透压测试结果表明,亲本菌株对0.02% 十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate, SDS）表现更为敏感,其抑制率高达70%;在金属离子（NaCl、KCl和CaCl₂）胁迫下,抗性突变菌株则表现更为敏感。因此,研究认为PAB不易导致胶孢炭疽菌的抗性产生,但诱导产生的抗性突变菌株的生存竞争力与敏感菌株相当。此外,交互抗性结果显示,土槿皮乙酸与吡唑醚菌酯、咪鲜胺和戊唑醇之间不存在交互抗性,但与苯并咪唑类杀菌剂多菌灵存在正交互抗性,其皮尔逊相关系数为0.7729（P<0.01）,这表明PAB可能与微管抑制剂多菌灵有相似的作用机制,但仍需开展进一步的研究验证。