尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种fpd1基因敲除与表型分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种fpd1基因的功能,构建了该基因敲除突变体并对其表型特征进行了分析。结果表明,与野生型菌株相比,fpd1基因敲除突变体生长减慢,产孢量显著降低,对巴西蕉的致病性明显减弱;fpd1基因可能在尖孢镰刀菌古巴专化型的产孢、生长发育和致病性等方面具有重要作用。本研究结果为进一步研究fpd1基因的功能和尖孢镰刀菌的致病机理奠定了基础。     

几株尖孢镰刀菌的绿色荧光蛋白基因转化

利用PEG介导的原生质体转化方法,将绿色荧光蛋白基因转入到6株香蕉枯萎病菌和1株棉花枯萎病菌中。结果表明：转化子连续转接5代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入到菌株中,为后续研究香蕉枯萎病菌和棉花枯萎病菌的侵染、防治等提供可视化的检测和分析手段。     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种红色荧光蛋白基因转化

采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,成功地将红色荧光蛋白基因DsRed转入到尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种B2菌株中。在显微镜下观察连续转接6代的转化子,结果都可以观察到很强的红色荧光,表明DsRed基因在转化的B2菌株中能稳定遗传。通过PCR验证,也表明红色荧光蛋白基因DsRed已经转入到尖孢镰刀菌中。对香蕉的致病力测定结果表明,转化子与野生型菌株B2相比没有明显差异。     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种的磷酸化应激诱导蛋白1（FoSTIP1）基因的克隆及表达分析

本研究克隆了尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种（Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4, Foc4）转录因子FoSkn7一个候选的下游基因,结果表明该基因cDNA编码序列全长1737 nt,编码一个含578个氨基酸残基的蛋白质。对其编码的蛋白进行了结构域和进化分析,结果表明该蛋白质含有胁迫诱导蛋白（stress-in-ducible protein-1, STI1）结构域和多个三角形4肽重复序列结构域（tetratricopeptide repeat, TPR）。该蛋白质与尖孢镰刀菌番茄专化型的磷酸化应激诱导蛋白1（STIP1）亲缘关系最近,因此初步将其确定为Foc4的磷酸化应激诱导蛋白并命名为FoSTIP1。采用相对荧光定量PCR方法分析了该基因在野生型B2菌株入侵香蕉苗根部及在外源H₂O₂诱导情况下的表达变化,也分析了FoSKN7基因缺失突变体中该基因在外源H₂O₂诱导情况下的表达。结果表明在入侵香蕉苗根部及在外源H₂O₂诱导情况下,B2菌株中的FoSTIP1表达均有上调,而FoSKN7基因缺失突变体中FoSTIP1即使有H₂O₂诱导,其表达也远低于B2菌株中的FoSTIP1。推测FoSTIP1可能是FoSkn7的靶基因并参与了Foc4抗外源氧化胁迫。     

香蕉枯萎病菌假定G蛋白偶联受体基因Fogpr1的功能分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型假定G蛋白偶联受体基因fogpr1的功能,构建了fogpr1基因敲除突变体。与野生型相比,fogpr1基因敲除突变体在菌丝生长、产孢量和菌落形态等方面没有明显变化,对巴西蕉的致病性也没有降低。此外,酵母双杂交实验结果表明,Fogpr1可以与G蛋白Fga1、Fga2和Fgb1互作。这些结果表明Fogpr1可能是一个G蛋白偶联受体,但不参与调控尖孢镰刀菌的发育和致病性。     

GFP标记的尖孢镰刀菌西瓜专化型侵染西瓜过程观察

将绿色荧光蛋白基因转入西瓜尖孢镰刀菌FON中,并利用荧光共聚焦显微镜观察GFP标记菌株侵染西瓜的过程.结果显示,转化子连续转接4代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入菌株FON中;利用GFP标记菌株在荧光共聚焦显微镜下观察其侵染西瓜苗的过程,发现在1/2 MS培养的西瓜苗中,FON经过48 h侵染即可进入西瓜的根维管束,第3天便进入茎维管束,第4天进入叶维管束(包括叶柄和叶脉);在土壤盆栽条件下,侵染后2d FON进入西瓜的根维管束,第9天进入茎维管束,第11天进入叶维管束.培养基培养与土壤盆栽相比,培养基栽培FON侵染的速度更快.     

尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株的生物学特性

通过对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株[Fusariumoxysporumf.sp.niveum(E.F.Smith)SnyderetHansen.]在不同培养基、不同温度、不同光照及不同的pH梯度条件下的生长速度、产孢情况等的对比,以及菌落、孢子形态特征观察,筛选出PDA、26℃、全日光照和pH7￣11为镰刀菌菌株生长和产孢最佳的培养基、温度和光照条件。并通过该菌株对几种杀菌剂的敏感性测验,发现丙环唑、烯唑醇、百菌清、代森锌4种生产常用杀菌剂对菌株的毒力具有显著差异,其中烯唑醇对该菌株的毒力最强。     

尖孢镰刀菌致病性菌株遗传多样性的ISSR分析

致病性尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是一种世界性分布的作物土传病原真菌,为明确其不同寄主及专化型菌株遗传差异性和亲缘关系,利用ISSR分子标记技术对来源于不同寄主（专化型）及地理分布的43个菌株进行了遗传多样性分析。结果表明,供试的15条引物通过ISSR-PCR 扩增,共扩增出147条条带,其中多态性条带为144条,平均多态性条带达98.0％。43个菌株的聚类结果表明,各菌株间的遗传相似系数为0.67～0.97,且遗传多样性与其寄主和地理来源没有明显的相关性。进一步将供试菌株中葫芦科与茄科作物尖孢镰刀菌分别进行聚类分析,当遗传相似系数为0.84时,16个葫芦科的菌株可分为6个ISSR类群;当遗传相似系数为0.77时,16个茄科的菌株亦可分为6个ISSR类群;且均表现为相同寄主或专化型菌株因地理来源不同,被归属于不同的ISSR类群,说明寄主或专化型相同的菌株与地理来源存在一定的相关性。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种cat1基因敲除与表型分析

前期蛋白质组学研究发现尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)中的过氧化氢酶1(cat1)基因受到巴西蕉诱导上调表达,为研究cat1基因在Foc4侵染香蕉过程中的作用,利用同源重组方法敲除Foc4的cat1基因,并对获得的敲除突变体开展表型分析和致病性测定。结果表明:cat1基因缺失对Foc4的菌丝、孢子形态、菌落生长、抗渗透压胁迫和细胞壁选择性压力等没有影响;但引起菌株抵抗外源氧胁迫、细胞壁穿透能力、纤维素利用能力减弱和对巴西蕉的致病性减弱。显示cat1基因的产物通过清除香蕉分泌的活性氧在Foc4对香蕉的致病过程中起作用,并参与病原菌对寄主纤维素成分的代谢。此结果为进一步深入研究香蕉枯萎病菌的致病机理奠定基础。     

香蕉枯萎病菌假定分泌蛋白SP10的功能分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型假定分泌蛋白基因SP10的在致病过程的作用,构建SP10基因敲除菌株,分析SP10敲除菌株的表型特征。结果表明:SP10基因敲除菌株在菌丝生长、产孢和菌落形态等方面无明显变化,但SP10基因敲除菌株对巴西蕉的致病性减弱;在接种30 d后,采用共聚焦显微镜显微观察香蕉根系,结果显示,SP10基因敲除菌株可在根系维管束中定殖。上述结果表明,假定的分泌蛋白SP10参与调控尖孢镰刀菌对香蕉的致病性,但不参与该病原菌生长和发育的调控。此结果为进一步研究尖孢镰刀菌分泌蛋白的功能奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌菌株致病力分化及其原因研究

以田间表现出枯萎病症状的香蕉和粉蕉组织中分离获得的13株尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为试验材料,分别测定了不同菌株对香蕉(巴西蕉)和粉蕉(广粉一号)的致病力以及在不同培养液中产生的细胞壁降解酶的活性和毒素含量。结果表明:不同菌株对香蕉和粉蕉的致病力存在明显差异;相关性分析显示,不同菌株产细胞降解酶活性与相应菌株侵染引起的寄主病情指数无相关性,产镰刀菌酸的含量与寄主病情指数呈极显著正相关(r=0.9326)。认为香蕉枯萎病菌菌株间产镰刀菌酸能力的不同是导致其致病力出现分化的主要原因之一。     

香蕉枯萎菌原生质体形成与再生条件

通过对菌丝菌龄、酶液浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂的种类和浓度等因素的实验研究,得到了一种制备香蕉枯萎菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC)原生质体的有效方法,并在固体再生培养基上实现了原生质体的再生,再生率为22.5%。     

香蕉枯萎病菌esyn1基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法扩增了香蕉枯萎病菌恩镰孢菌素合成酶基因esyn1的cDNA片段,测序结果表明,esyn1基因核苷酸序列阅读框架全长546 bp。核苷酸序列分析显示该基因片段编码181个氨基酸,推测分子量为19.9 ku,等电点为5.06。氨基酸序列比对结果表明,它与半裸镰刀菌、层出镰刀菌、拟枝孢镰刀菌esyn1基因的氨基酸序列的相似性分别为96%、94%、77%。     

一种简便分离香蕉枯萎病菌的选择性培养基

为探寻在非无菌操作下能从土壤中快速且大量分离检测香蕉枯萎病菌,研制了一种用于检测香蕉枯萎病病原菌的选择性培养基-PCEA,其成分为:马铃薯200 g,CuSO_4·5H_2O 0.5 g,MgSO_4·7H_2O 0.6 g,KH_2PO_4 0.1 g,敌克松结晶粉(75%)3 g,硫酸链霉素0.75 g,95%酒精10mL,水1 000mL,pH5.8,琼脂18～20g.该培养基与其它常见分离培养基相比,无需无菌操作,且成分简单、检测率显著,抑菌效果好,病菌在其上生长快、菌落典型,是一种较为理想的选择性培养基.     

香蕉枯萎病菌fga1基因的克隆与序列分析

为了解fga1基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的fga1基因,并对扩增产物进行了测序及相似序列搜索和比对,还对基因编码的蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析.研究结果表明2个生理小种fga1基因开放阅读框均为1 062 bp,编码353个氨基酸,基因同源性为99.5%,氨基酸序列相同.推测fga1基因可能与香蕉枯萎病菌自身繁殖和附着胞的形成有关.从fga1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列看,2个生理小种致病力的差异与fga1基因并无明显对应关系,这为进一步研究fga1基因功能奠定了基础.     

香蕉枯萎病致病分子机理与防治研究进展

香蕉枯萎病是一种由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的土传毁灭性病害,一直严重危害世界香蕉生产,从而引起广泛关注和深入研究,但其致病机理到目前还不清楚。本文综述了香蕉枯萎病菌侵染寄主的过程、致病毒素的成分分析、致病相关基因、香蕉的抗病性和枯萎病防治等方面的研究进展,为全面、深入地揭示香蕉枯萎病致病的分子机理和开展新的防治途径提供研究方向和思路上的启发。     

拮抗香蕉枯萎病镰刀菌木霉菌株的分离筛选

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型引起的,目前尚缺乏有效的防治方法,木霉菌是重要的植物病害防治菌,广泛分布于自然界。木霉菌具有广泛的适应性,能杀伤多种重要的植物病原菌且作用机制多种多样。笔者从广东湛江、海南儋州等地152份土样中分离出330株木霉,通过对峙法对木霉菌进行体外拮抗作用测定及评价,选出10株对尖孢镰刀菌有较好拮抗效果的木霉菌;并测定无菌土中木霉与病原菌的种群动态变化,结果表明木霉在土壤中对病原菌有一定的抑制作用。     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种在几种培养基上的生长特性

测定10株分离自广东省不同香蕉种植区的香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种在不同培养基上的形态、生长速率和产孢能力的差异。结果显示,不同生理小种菌株在PDA、Komada改良培养基、粉蕉组织浸提液培养基和香蕉组织浸提液培养基上的形态、生长速率和产孢能力等特性差异不明显,不能依据这些特性区分1号和4号生理小种;但在康乃馨叶片琼脂(Carnation leaf agar,CLA)培养基上产生的孢子形态具有明显差异,4号生理小种的菌株产生典型的尖镰刀状大孢子,孢子多6个隔,长约(36.80±5.33)～(44.93±4.80)μm,宽约(3.40±0.20)～(4.27±0.25)μm,占总孢子数的比例较大,为(40.87±9.67)%～(62.50±7.84)%,而1号生理小种个体产生的大型孢子前端钝圆,弯曲程度低,多4个隔,孢子长约(22.31±3.89)～(25.01±6.16)μm,宽约(3.42±0.23)～(3.90±0.24)μm,占总孢子数的比例很小,为(2.55±1.95)%～(4.50±1.76)%。