RT-PCR方法检测烟草环斑病毒的研究

 根据烟草环斑病毒（TRSV）外壳蛋白基因非编序列设计的引物P1,P2,用感病及健康组织总RNA为模板,进行cDNA 合成和PCR试验,感病组织中扩增出了600 bp的目的片段,而健康组织中无此扩增带。摸索各项实验条件,建立了RT-PCR检测烟草环斑病毒（TRSV）的方法。     

应用复合RT-PCR同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒

将烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus)和番茄环斑病毒(Tom ato ringspot virus)的CP基因及RNA2基因序列引物,合成特异性RT-PCR检测引物,对烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应,结果显示,感染了烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的植物组织的PCR产物均出现600 bp和470 bp特异性扩增条带,而其他病毒均未出现扩增条带,证明这两对引物具有烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒和番茄环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果显示,此体系最低可检出烟草环斑病毒和番茄环斑病毒提取的RNA模板浓度为234 pg/μl和264 pg/μl。表明,复合RT-PCR是一种可同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的快速检测方法。     

烟草环斑病毒RT-PCR检测体系的优化

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)的代表种,是我国公布的二类进境检疫有害生物.建立特异性强、灵敏性高的检测体系是有效控制TRSV传播的技术保障.本研究在分析引物的特异性、优化退火温度及dNTPs、引物、...     

一步法RT-PCR检测烟草环斑病毒试剂盒的研制与应用

根据烟草环斑病毒基因组序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术研制成一步法检测该病毒的试剂盒,并建立了操作程序。对试剂盒扩增到的预期产物进行测序验证,产物序列与目的序列间的同源性为97.8%,表明该试剂盒的准确性较高。试验结果还表明,该试剂盒在常温、4℃和-20℃下可分别保存2d、7d和60d;灵敏度是DAS-ELISA的100倍;质量控制试验结果一致,具有较高的重复性。     

烟草环斑病毒外壳蛋白基因片段原核表达载体的构建及表达

根据烟草环斑病毒外壳蛋白(TRSV-CP)基因的保守序列设计引物,采用RT-PCR方法,获得烟草环斑病毒基因组中编码外壳蛋白部分基因片段,将其插入原核表达载体pET28a中,获得重组表达质粒pET-CP,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,利用IPTG诱导蛋白大量表达.重组蛋白经过Ni -NTA纯化后,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,TRSV-CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,产生的融合蛋白分子质量约为34ku,并具有免疫学活性.以纯化的表达蛋白免疫新西兰大白兔,多抗血清效价达1:409600,可以与重组蛋白发生抗原抗体反应.     

应用分子生物学方法快速检测烟草环斑病毒

根据烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus)CP基因序列,设计并合成了特异性RT-PCR扩增引物,对烟草环斑病毒和非烟草环斑病毒的感病植物组织样本进行了PCR扩增反应。结果,烟草环斑病毒的感病植物组织样本的PCR产物均出现1 760 bp的特异性扩增条带,而非感病植株组织样本均未出现扩增条带,证明该合成引物具有烟草环斑病毒鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果可检出烟草环斑病毒RNA模板最低浓度为234 pg/μl。研究表明,分子生物学测定具有特异性强、灵敏度高、快速准确的特点,可应用于烟草环斑病毒检疫的快速检测。     

烟草环斑病毒研究进展

烟草环斑病毒是豇豆花叶病毒科线虫传多面体病毒属的代表种,是豆类、瓜类、花卉、果树和烟草等重要经济作物病害的病原,分布于美国、加拿大、英国、日本等欧、亚、美、澳和非洲的50多个国家,在我国局部分布,是我国公布的二类进境检疫有害生物。从生物学特性、血清学与株系、检测方法、防治等方面对该病毒的最新研究进展作了综述。     

番茄环斑病毒的普通RT-PCR和巢式PCR检测方法

根据番茄环斑病毒（ToRSV）外壳蛋白（CP）基因的保守序列设计了2对引物（引物对Ⅰ和Ⅱ）,利用RT—PCR分别扩增出预期大小的800bp和580bp的条带,其中引物对Ⅱ扩增效率较高、特异性较好。以引物对Ⅰ和Ⅱ进行2轮PCR扩增,建立了巢式PCR检测方法,其灵敏度比普通RT-PCR提高100～200倍。序列测定和分析表明所测定的序列为ToRSVCP基因的部分序列,在系统关系树上与ToRSV的其他分离物形成一簇,亲缘关系很近。     

RT-PCR检测齿兰环斑病毒技术的建立

根据已报道的齿兰环斑病毒(ORSV)外壳蛋白(CP)基因序列,进行同源性比较,设计了一对各为20bp的引物.通过优化试验条件,建立了稳定的RT-PCR检测ORSV体系,其检测灵敏度可达0.01ng·mL-1.将此方法与ELISA进行比较,结果表明,RT-PCR检测灵敏度比ELISA高1000倍.应用这两种方法同时检测了138瓶兰花组培苗样品,其中RT-PCR检测出32瓶兰花组培苗感染病毒,而ELISA只能检测其中的18瓶.     

胶体金免疫层析试纸结合RT-PCR法快速检测烟草环斑病毒

利用烟草环斑病毒胶体金免疫层析检测试纸条,对烟草环斑病毒3个分离物进行了快速检测。结果表明,试纸条在10min内,可特异性检出烟草环斑病毒的3个分离物,对番茄环斑病毒、南芥菜花叶病毒、番茄黑环病毒和健康叶片无反应。剪下试纸条上显示的检测带,进行RT—PCR,能扩增到与预期大小相同的DNA条带。试纸条检测烟草环斑病毒粗提纯液,检测灵敏度在1μg·mL^-1,试纸条检测烟草环斑病毒的病汁液,检测灵敏度在10^-3（W／V）,试纸条检测灵敏度与DAS—ELISA方法灵敏度基本相同。     

I型鸭肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank 发表的DHV I的基因序列,设计了1对针对DHV I保守区的特异性引物。通过对反应条件的优化,建立了鸭病毒性肝炎病毒快速鉴别诊断的RT-PCR方法,扩增片段大小为632 bp。试验表明,RT-PCR法具有很强的特异性,且该方法的敏感性明显高于常规的检测方法。对鸭病毒性肝炎的病料检测证明,该方法能有效鉴别DHV,特异性良好。     

DNA分子标记技术在环境污染物检测中的应用

DNA分子标记是DNA分子碱基序列变异的直接反映,利用分子标记物对污染物造成的生物体DNA损伤的检测和定量分析研究是可行的方法。文章主要综述了DNA加合物技术、随机扩增DNA多态性技术(RAPD)、扩增片段长度多态性技术(AFLP)、单细胞凝胶电泳技术(SCGE)及反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的原理及其在环境污染物检测中的应用。该方法具有快速、简便、特异性强的特点,在环境污染物早期诊断和评价方面具有重要意义,已广泛应用于遗传毒理学研究。     

二色补血草凝集素（Lectin）序列分析及表达

从二色补血草cDNA文库中分离出一个凝集素(Lectin)基因全长cDNA序列.该基因全长977 bp.其中:5′非翻译区(UTR)103 bp,3′非翻译区(UTR)208 bp,开放阅读框(ORF)全长663 bp,编码由221个氨基酸组成的蛋白质,该蛋白的相对分子质量为25 kD,理论等电点为8.82.利用实时定量RT-PCT方法进一步研究了二色补血草在植物病原菌(尖孢镰刀菌)侵染条件下不同时间点该基因的表达情况.结果表明,在尖孢镰刀菌胁迫处理的条件下,能诱导Lectin基因在二色补血草的根、叶中表达,说明该基因与植物抗病相关.     

利用RT-PCR技术检测吊瓜病毒种类的研究

小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaicvirus,WMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、南瓜花叶病毒(Squash mosaic virus,SqMV)和番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)是危害葫芦科作物最严重、最广泛的5种病毒。根据已知的5种病毒序列设计特异性引物,对感染病毒的吊瓜总RNA进行RT-PCR扩增。结果表明长兴吊瓜的病毒种类主要为PRSV,感染率为100%,无复合病毒感染。吊瓜植株不同取样部位(茎尖、卷须、嫩叶、茎、花、子房、老叶等)的RT-PCR表明老叶是较好的病毒检测取样部位,而嫩叶是吊瓜脱毒最佳的外植体取样部位。对茎尖的PRSV表达量高过幼叶的原因也进行了分析,认为可能是病毒的表达量与植株的代谢强度有关。     

泌乳晚期大鼠乳腺生长抑素基因的表达

利用大鼠生长抑素基因设计引物,对泌乳晚期SD大鼠的乳腺组织生长抑素基因进行RT-PCR检测,PCR产物与pMD-19T载体连接后转化JM109感受态细胞,筛选阳性克隆、测序.结果发现在泌乳晚期大鼠乳腺中有生长抑素基因的表达.     

桃树苹果花叶病(APMV)的RT-PCR检测

本试验比较了4种桃叶片RNA提取方法,建立了RT-PCR桃苹果花叶病检测体系.结果表明:凯基TRIzol试剂法简便快捷,提取的RNA质量较好,可用于RT-PCR.RT-PCR最适反应体系为MgCl2 1.5 mmol/L,引物0.5 μmol/L,模板1.0 μg/50 μl,退火温度为43.5 ℃.采集桃主产区北京、陕西、山东、河北、河南、新疆以及江苏的徐州、无锡、南京等地带叶芽的桃枝样品作为试材,利用RT-CR进行苹果花叶病检测.结果显示,在河北重阳红、山东春雪、无锡朝晖、新疆2号、新疆3号、新疆5号、徐州朝晖发现苹果花叶病毒(APMV).     

番木瓜果肉RNA提取方法的比较

为了从成熟末期的番木瓜果肉中提取纯净完整的RNA,本试验采用了TRIzol试剂盒、改良TRIzol、SDS法、CTAB法等4种方法从番木瓜果实中提取总RNA。从RNA的完整性、产率和纯度等方面对这几种方法进行比较和评价,结果表明,采用改良TRIzol所得RNA完整性较其他方法好,条带清晰无明显降解,28S和18S RNA的亮度比约为2∶1,D260/D280达1.9且得率较高,为380.5μg.g-1,经RT-PCR后得到一特异条带表明该RNA可用于后续分子生物学操作。     

青海省马铃薯卷叶病毒的RT-PCR法检测

根据马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白基因的保守序列设计了一对寡聚核苷酸引物,从田间自然感染PLRV的马铃薯病株中提取病毒总RNA,用反转录-聚合酶链式反应扩增出符合设计大小240bp的特异性产物,而对照没有任何扩增产物。建立了快速、准确检验PLRV的分子检测方法,为青海省马铃薯生产中卷叶病毒的检测和防治提供了有效手段。     

鸡新城疫病毒新乡株ND-XX10的分离与鉴定

2010年初,已免疫过新城疫疫苗的新乡市某鸡场蛋鸡出现以消化道、呼吸道出血为主要症状的疑似新城疫病例.将病料经10日龄SPF鸡胚增殖分离病毒,命名为ND-XX10.提取其病毒基因组RNA,并以此为模板,RT-PCR扩增获得F基因主要功能区(1～631 bp)片段并进行测序.结果显示,ND-XX10毒株F蛋白的裂解位点为...