patatin启动子调控烟草液泡转化酶抑制子在马铃薯抗低温糖化中的作用

为了降低马铃薯(Solanum tuberosum )块茎低温贮藏下还原糖的积累，实验构建了马铃薯块茎特异性启动子（CIPP）调控的烟草液泡转化酶抑制子Nt-VIF基因表达载体pBICNI，并转化马铃薯植株。PCR、Northern杂交和Southern杂交分析结果显示，CIPP调控的Nt-VIF基因全长cDNA成功地导入鄂马铃薯3号（E-3）植株。14个转基因株系块茎分别贮藏在4℃和20℃条件下，贮藏1个月后进行还原糖含量和液泡酸性转化酶（VI）活性测定。结果表明，在20℃条件下转基因株系块茎还原糖（RS）含量与对照相比差异不明显，在4℃条件下RS含量则显著下降，与对照相比下降幅度从34%（株系B-13）至76.8%（株系B-1），说明Nt-VIF cDNA在马铃薯中的表达，成功地抑制了液泡酸性转化酶的活性，导致还原糖含量降低。进一步分析表明，转基因块茎低温贮藏其液泡转化酶活性与还原糖含量呈显著的正直线相关（VI = 0.3084RS + 0.0673）。实验获得的B-1、B-2、B-6、B-9、B-14等5个转基因株系，块茎低温贮藏后能直接满足炸片加工对还原糖含量的要求。     

反义class Ⅰ patatin基因转化马铃薯及其对试管块茎形成的影响

通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将CaMV 35S启动子驱动的反义class Ⅰ patatin基因导入马铃薯(Solarium tuberosum)品种鄂马铃薯3号中。PCR扩增和PCR—Southern杂交证明，反义class Ⅰ patatin基因已整合到马铃薯基因组中。Northern杂交分析表明，该反义基因在转基因植株中能正常转录并导致内源classⅠ patatin mRNA含量的下降。对转基因植株试管块茎分析显示，其蛋白质含量和酯酰水解酶的活性较对照有不同程度的下降，其中下降程度最大的株系分别比对照减少36．4％和31．4％。同时部分转基因株系在组织培养条件下的结薯株率、单株结薯数和有效薯率较对照有一定程度的降低。     

叶面喷施硫酸锌对马铃薯淀粉合成和积累的影响

"克新13号"马铃薯品种用不同浓度的硫酸锌叶面喷施后,测定叶片与块茎中淀粉、蔗糖和还原糖含量以及相关酶活性。结果表明,适量硫酸锌(2~4 g.L-1)叶面喷施处理后马铃薯叶中蔗糖磷酸合成酶、蔗糖转化酶以及块茎蔗糖转化酶和蔗糖合成酶活性均提高,促进马铃薯叶和块茎中的蔗糖、还原糖的合成,块茎中淀粉合成和积累提高。     

不同浓度乙烯利处理对甘蔗若干生理生化特性的影响

在甘蔗的分蘖初期用不同浓度的乙烯利处理，结果表明：５０ｍｇ／Ｌ，１００ｍｇ／Ｌ乙烯利处理能提高甘蔗前中期的Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶、Ｃａ２＋－ＡＴＰ酶、酸性转化酶、多酚氧化酶等的活性及可溶性蛋白质、无机磷、还原糖等物质的含量，而过氧化物酶活性与对照差异较小。３００ｍｇ／Ｌ，４００ｍｇ／Ｌ乙烯利处理则降低了甘蔗生长前中期的Ｍｇ２＋－ＡＴＰ酶、Ｃａ２＋－ＡＴＰ酶、酸性转化酶、多酚氧化酶等的活性及可溶性蛋白质、无机磷、还原糖等物质的含量，其过氧化物酶活性显著高于对照。     

转菜豆几丁质酶基因和烟草葡聚糖酶基因抗病棉花的种植对棉花根际土壤酶活性的影响

本研究探讨了转菜豆几丁质酶基因和烟草葡聚糖酶基因的抗病棉花株系７p、２８p（双价载体）以及受体高代材料９７１８５、７９７０１的种植对根际土壤过氧化氢酶活性、蛋白酶活性、纤维素酶活性、脲酶活性、蔗糖酶活性的影响。结果表明：整个生育时期抗病转基因棉花根际土壤的过氧化氢酶活性与其受体之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）。另外,根际土壤的蛋白酶活性、纤维素酶活性、脲酶活性、蔗糖酶活性在同一生育期内差异不显著（Ｐ＞０．０５）,而在不同的生育时期差异显著（Ｐ＜０．０５）。说明抗病转基因棉花的种植对根际土壤过氧化氢酶和蛋白酶几乎无影响,而根际土壤纤维素酶、脲酶、蔗糖酶活性的变化转基因抗病棉花与受体种植之间几乎没有影响,而在不同棉花株系和生育期之间产生一定的影响,这可能与不同基因类型以及生育期植株根部分泌物有关。研究初步表明转基因抗病棉花的种植对土壤微生态的影响不大。     

硼素对马铃薯淀粉合成和积累的影响

以克新13号马铃薯品种为试验材料,采用不同浓度的硼砂溶液叶面喷施,通过测定块茎中淀粉、蔗糖和还原糖含量以及相关酶活性,研究喷施硼砂溶液对马铃薯淀粉合成和积累的作用.结果表明:适量硼砂(4～6 g·L-1)叶面喷施处理后,提高了马铃薯块茎蔗糖转化酶和蔗糖合成酶活性,促进马铃薯块茎中的蔗糖、还原糖的合成,块茎中淀粉合成和积累量增高,改善了块茎相关品质.     

长期不同施肥棕壤玉米地的酶活性之时空变化

为揭示长期不同施肥对棕壤玉米地酶活性时空变化的影响,利用31年长期肥料定位试验研究了玉米生育期内3种主要土壤酶活性的时空变化及其与土壤理化性质的关系。结果表明,棕壤上各种酶随玉米生育期推进而有规律地变化。土壤脲酶、转化酶活性高峰出现在玉米拔节期,酸性磷酸酶活性高峰出现在玉米大喇叭口期;玉米收获后,土壤转化酶、脲酶均高于播前或与播前相当,而酸性磷酸酶活性则低于播前。在同样化肥水平上增施有机肥能增加脲酶、转化酶活性,而降低酸性磷酸酶活性;3种酶活性的空间分布规律均遵循随土层深度加深而不断减小的规律,长期培肥对深层土壤酶活性亦有影响。相关分析结果显示,土壤脲酶同转化酶呈极显著正相关（r=0.636**）;脲酶、转化酶同土壤有机碳、pH、含水量、碱解氮、速效磷基本呈极显著正相关;酸性磷酸酶同各因子无显著关系。土壤酶与土壤肥力因素关系密切,可作为衡量土壤肥力的敏感指标。     

PTLF-PTAG-IR对转基因烟草开花的抑制效应

PTLF（LEAFY同源基因）和PTAG（AGAMOUS同源基因）是杨树中控制花发育的重要基因,为了解RNA干涉同时抑制PTLF和PTAG对花发育的影响,本研究采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将35S：：PTLF-PTAG-IR导入烟草（Nicotiana tabacum）。经PCR检测获得了15株阳性转化株系,进一步的Southern分析证实PTLF-PTAG-IR基因已整合到烟草基因组中。荧光定量分析结果显示,转基因烟草内源NFL（LEAFY同源基因）和NAG1（AGAMOUS同源基因）的表达量均低于野生型。对开花时间调查的结果表明：与野生型烟草相比,53.3%的转基因株系开花受到完全的抑制,26.7%的转基因株系开花时间平均推迟34.3d,仅20%的转基因株系与野生型在同一时期开花。另外,对转基因烟草花器官的观察发现花瓣形态,雄蕊着生方式、数目等方面发生变异,这些研究结果表明过量表达35S：：PTLF-PTAG-IR对烟草花发育起到抑制作用,本研究将为利用转基因手段获得不育材料提供参考。     

盐胁迫对枸杞叶片糖代谢及相关酶活性的影响研究

试验研究盐胁迫对枸杞叶片糖代谢及相关酶活性的影响结果表明,随NaCl浓度升高和处理时间的延长,枸杞叶片多糖和可溶性糖含量显著增加(P<0.05),蔗糖含量呈上升趋势,而淀粉含量显著下降(P<0.05),还原糖含量呈下降趋势。随NaCl浓度的增加,枸杞叶片中中性转化酶活性显著降低(P<0.05);3g/kg、6g/kg NaCl处理对酸性转化酶活性影响较小,3g/kg NaCl处理降低蔗糖合成酶而对蔗糖磷酸合成酶活性基本无影响;6g/kg NaCl处理蔗糖合成酶活性随时间先降后升,而对蔗糖磷酸合成酶活性影响较小;但9g/kg NaCl处理显著降低酸性转化酶、蔗糖磷酸合成酶活性(P<0.05)。     

利用RNA干扰技术抑制水稻淀粉极限糊精酶基因表达

构建了含极限糊精酶基因片段反向重复结构的RNAi载体,抑制水稻籽粒中极限糊精酶基因表达获得了极限糊精酶基因功能缺失突变体。经酶切及序列测定证实,成功地构建了胚乳特异表达启动子启动的水稻极限糊精酶基因反向重复结构RNAi载体;通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导水稻(Oryza sativa sp.japonica)转化,经PCR及Southern杂交检测,获得28个水稻转基因再生株系;以极限糊精酶抗体对转基因株系胚乳发育期籽粒蛋白质进行Western杂交,并经SDS-PAGE极限糊精酶活性检测,结果显示,该反向重复结构在胚乳发育期表达,减少了极限糊精酶的积累,获得了不同沉默效果的转基因株系。转化株系012的极限糊精酶活性只有野生型的10%,表明该载体可有效地抑制水稻胚乳中极限糊精酶的活性。     

Expression Pattern of Ａ Recombinant Phloem-specific Promoter from Pumpkin in Transgenic Potato Plants

以本实验室构建的重组南瓜(Cucurbita moschata)韧皮部特异启动子dENP构建了植物表达载体pBdENP。利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA44O4介导转化马铃薯(Solanum tuberosum)品种Favorita，经过抗生素筛选，共获得转pBdENP和对照pBI121的抗卡那霉素马铃薯再生植株106株。通过PCR初步筛查，筛选出65株为转基因阳性植株。通过Southern blot对部分植株进一步分析,确证外源gus基因已经插入到转基因马铃薯植株的基因组中，插入拷贝数在1个或2个以上。对这些转基因马铃薯植株进行GUS染色结果表明, dENP和CaMV35S启动子一样均能驱动gus基因的表达，前者仅在马铃薯的韧皮部内特异表达，而CaMV35S启动子驱动的gus基因为组成型性表达。GUS酶活力测定结果进一步表明dENP和CaMV35S启动子驱动gus基因表达水平没有明显区别。以上结果证明dENP启动子驱动的外源基因在马铃薯中也具有韧皮部特异而高效表达的特征，从而可用于马铃薯抗病、抗蚜虫转基因研究。     

利用RNAi技术提高玉米直链淀粉含量

为了提高玉米直链淀粉含量,用基因枪将前期工作中构建的sbeⅡb RNAi表达载体pBAC413导入玉米自交系幼胚愈伤组织,经过筛选获得了12 株转化再生植株,其中6 个植株获得了结实种子。DNA点杂交、PCR扩增和PCR－Southern均证明目的基因已整合到T0代再生植株玉米基因组中。对T1代转基因玉米籽粒淀粉含量进行测定,结果表明总淀粉含量比对照没有显著变化,其中1个转基因玉米株系的直链淀粉含量比对照提高了15.6%。     

ADP ribosylation factor regulates metabolism and antioxidant capacity of transgenic potato tubers

In our recent studies we have evidenced that repression of ADP-ribosylation factor (ARF) in potato plants results in 14-3-3 gene activation. The significant alteration in plant phenotype and in carbohydrate content clearly indicates that there may also be changes in other metabolite syntheses. In this paper we present the data on contents of compounds, occurring in transgenic potato tubers from field trial, known to be important for the human diet. We also determine which of the ARF-antisense plant features resulted from ARF repression. This determination was accomplished by the analysis of ARF-antisense plants transformed with cDNA encoding 14-3-3 protein in reverse orientation. The sucrose accumulation and the decrease in glycoalkaloids level were found to be characteristic features of all transgenic plants. The increase in antioxidant capacity of transgenic potato tubers should also be pointed out. The analysis of fat from modified potato tubers revealed a nutritionally valuable composition of fatty acids, including the significant increase of linoleic acid level.     

Increase in lipid content in potato tubers modified by 14-3-3 gene overexpression

Recently, transgenic potato plants were created with overexpression of the 14-3-3 protein derived from Cucurbita pepo. Detailed analysis of those plants suggested that the function of the isolated 14-3-3 isoform is in the control of carbohydrate and lipid metabolism in the plants. 14-3-3 protein overexpression gave rise to an increase in soluble sugar and catecholamine contents in both leaves and tubers. It is proposed that 14-3-3 protein affects carbohydrate metabolism in potato plants via regulation of catecholamine synthesis. Furthermore, genetically modified potato tubers with 14-3-3 protein overexpression showed changes in lipid content and composition. The transgenic potato tubers contained 69% more total fat compared to the wild-type plant. Separation of tuber lipids into polar and nonpolar fractions revealed that the transgenic potato tubers contained almost 3 times more nonpolar lipids than the control. Analysis of fatty acid composition, conducted by the means of gas chromatography, showed that linoleic acid was the main fatty acid present in the tubers of both modified and control potato plants. In the nonpolar fraction of the fat of the transgenic tubers the unsaturated fatty acids exhibited a higher participation in the sum of all fatty acids.     

转nsLTPs类抗菌蛋白基因烟草对赤星病和青枯病的抗病性分析

以烟草叶盘为受体，通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将益母草 (Leonurus japonicus Houtt.) 非专一性脂转移蛋白(nsLTPs)类抗菌蛋白基因Lj-L和相应改造基因Lj-S分别导入烟草(Nicotiana tabacum cv. Xanthi.)，并进行抗病性分析。GUS染色和PCR分子验证表明外源基因已整合进烟草基因组中。RT-PCR分析表明，外源基因能够在烟草中稳定转录。T0代离体抗性实验表明，外源基因对烟草赤星病(Alternaria alternata)的抗性已达极显著水平; T1代活体抗性实验表明，Lj-L和Lj-S基因对青枯病(Pseudomanas solanacearum)的抗性也均达显著水平。抗性结果比较发现，Lj-L基因的抗病性效果优于Lj-S基因，且离体和活体抗病结果较一致，但并不与基因的转录水平成正比，似乎存在一个阈值。     

青花菜ProDH基因的克隆及功能鉴定

脯氨酸是水分胁迫植物中最常见的渗透保护物质之一,脯氨酸脱氢酶（ProDH）是存在于线粒体内的催化脯氨酸降解的关键酶,构建RNAi表达载体转化青花菜可以抑制脯氨酸分解提高其抵抗干旱胁迫和盐胁迫的能力。本研究利用同源重组和RACE技术克隆青花菜脯氨酸脱氢酶基N（ProDH）,以酶切、连接的方法利用载体pFGC1008构建植物RNAi表达载体pFGC—PDHi。序列分析表明,本文首次克隆了1595bp的青花菜脯氨酸脱氢酶基因cDNA全长,该序列编码498个氨基酸;序列比对发现该核酸序列与拟南芥、甘蓝型油菜、芜菁分别有83．26％、89．07％和97．73％的同源性,其氨基酸序列和拟南芥、甘蓝型油菜、芜菁分别有89．78％、91．38％和98．80％的同源性。测序和酶切鉴定表明青花菜ProDH基因RNA干扰表达载体已经构建成功,并将其转化青花菜得到转化株,经PCR检测,转化株均为阳性株,证明干扰载体的T-DNA区已经成功地整合到了青花菜基因组中。研究还发现在外源的L-脯氨酸存在时,转化株的脯氨酸脱氢酶的活件受到了明显的抑制。本研究为青花菜的抗旱育种提供了非常有价佰的新种质材料。     

液态有机肥对酚酸胁迫下马铃薯生长发育和土壤酶活性影响

为明确液态有机肥对土壤酚酸导致马铃薯的连作障碍的缓解效应,采用盆栽试验,将阿魏酸与香草酸等量混合后按不同浓度(0,50,100,150 mg/kg)施加于马铃薯基质土壤中,模拟马铃薯连作分泌的有机酸自毒物质,并施加不同浓度梯度液态有机肥(0,225,450,675 kg/hm^2),探讨酚酸胁迫下液态有机肥对马铃薯生长发育以及土壤酶活性的影响。结果表明:单一施加外源酚酸对马铃薯株高、茎粗、叶面积以及干物质量皆有不同程度的抑制作用,随酚酸浓度增加,土壤中脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶活性相对对照分别降低2.74%~10.95%,11.11%~20.55%,5.29%~12.96%,过氧化氢酶、多酚氧化酶活性升高,FDA水解酶活性表现为低促进高抑制。施加液态有机肥后提高了马铃薯株高、茎粗、叶面积以及干物质量,土壤酶活性均有提高,脲酶、酸性磷酸酶、蔗糖酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、FDA水解酶活性相对对照处理最高分别提高了10.80%,21.40%,18.20%,29.60%,37.69%,12.31%,但是液态有机肥浓度过高降低了其对磷酸酶、脲酶、过氧化氢酶的提升效果,抑制了FDA水解酶活性。因此合理施加液态有机肥可以促进马铃薯生长发育,提高土壤酶活性,增强马铃薯的抗逆性,从而缓解酚酸对马铃薯的胁迫作用。     

Repression of the 14-3-3 gene affects the amino acid and mineral composition of potato tubers

Recently, transgenic potato plants were created showing underexpression of the 20R isoform of the 14-3-3 protein. The transgenic plants grown in tissue culture showed a significant increase in nitrate reductase activity and a decrease in nitrate level. The transgenic line with the lowest 14-3-3 quantity was field-trialed (1997-2000) and analyzed. The reduction in the 14-3-3 protein level consistently resulted in a starch content increase and in an increase in the ratio of soluble sugars to starch in the tubers, although the latter was only barely visible. The determination of amino acid composition in the tubers showed a significant increase in methionine, proline, and arginine content and a slight but consistent increase in hydrophobic amino acid and lysine content in the cells of the transgenic potato plants. We also observed an increase in the crude protein content, from 19 to 22.1% of the control value in consecutive years. It is proposed that all of these changes might have resulted from the downregulation of nitrate reductase and sucrose phosphate synthase activities by 14-3-3, although other potential mechanisms cannot be excluded (e.g., an increase in enzyme protein level). 14-3-3-repressed transgenic plants showed a significant increase in calcium content in their tubers. It is thus proposed that a function of the isolated 14-3-3 isoform is in the control of amino acid synthesis and calcium metabolism. However, the mechanism of this control is as yet unknown.