马立克氏病病毒６４８株囊膜糖蛋白gI基因的克隆和表达的研究

根据马立克氏病病毒（ＭＤＶ）强毒株ＧＡ的基因序列，设计和合成一对引物，以特超强毒６４８株基因组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ技术，扩增其囊膜糖蛋白gI基因阅读框（ＯＲＦ）中，除去其Ｎ－端编码疏水区的１６５个碱基对（bp)以外的蓁部分；将ＰＣＲ产物按正确的阅读框架定向克隆到表性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因的下游，将重组质粒转化进大肠杆菌ＢＬ２１株，在１．０mMIPTG浓度和３０℃的条件下诱导，gI-GST基因融合蛋白获得了理想的表达；经聚丙烯酰胺凝脉电泳，West-ern-blot试验，通信班下其表达的融合蛋白产物大小为预期的６３ＫＤ。将表达产物回收后免疫小鼠，所得抗血清可与ＭＤＶ感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）在免疫荧光试验（ＦＡ）中呈细胞膜阳性染色。试验结果表明，在大肠杆菌中表达的６４８株ＭＤＶgI基因的融合蛋白产物保留了天然蛋白的某些抗原性。     

马立克氏病病毒囊膜粘蛋白B基因原核细胞表达产物单克隆抗体的制备

用大肠杆菌BL21表达了马立克氏病病毒（MDV）强毒GA株的囊膜糖蛋白B（gB）基因，通过SDS－PAGE电泳分离表达蛋白条带，切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过ELISA和间接免疫荧光试验（IFA），得到1株阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株7C8。该单抗腹水的ELISA效价为1：2^12，IFA效价为1：800，与MDV不同致病型毒株CVI988、GA、RB1B、MD11、648A株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）均呈IFA阳性。1：100稀释时与GA株感染的CEF在斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA)中呈阳性。     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白Ⅰ的原核表达及多克隆抗体的制备

提取感染MDV 814A3毒株的鸡胚成纤维细胞(CEF)总基因组,利用PCR技术扩增获得gI基因.将鉴定正确的gI基因克隆至pET-32a(+),构建原核表达载体pET-gI.将诱导表达获得的gI重组蛋白免疫新西兰大白兔,产生的抗血清能够与MDV814A3病毒发生特异性反应.本试验所制备的gI重组蛋白和多克隆抗体将在MDV检测、血清学诊断等方面具有重要应用价值.     

马立克氏病病毒gB基因的克隆及理组鸡痘病毒的构建

通过PCR方法扩增了马立克氏病病毒（MDV）2.8kbgB基因，并且在其两端加上PstⅠ和NotⅠ位点。然后用PstⅠ/NotⅠ酶切回收gB片段，插入到转移载体pEFgpt12s复合启动子Spromoter的下游的PstⅠ/NotⅠ酶切位点处，构建了转移质粒pEFgpt12s-gB。将该质粒与鸡痘病毒（FPV）野毒282E4株共转染鸡胚成纤维细胞（CEF），通过MXHAT选择培养基进行筛选，蚀斑纯化，经PCR扩增证实重组病毒中含有gB基因。重组病毒和FPV野毒在CEF上形成空斑大小无明显差别，病毒效价分别为10^-5.43TCDID50/mL和10^-6TCID50/mL，表明外源基因的插入不影响所构建的重组病毒的生物学特性。     

马立克氏病病毒CV1988株pp24基因的克隆与表达

根据马立克氏病病毒（MDV）国际参考强毒CA株pp24基因序列，设计和合成了一对引物，其两端分别含SalI和EcoRI的酶切位点，以CV1988株基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增其pp24基因。PCR产物经纯化后，按正确的阅读框架定向克隆到表达性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶（GST）基因的下游，并用序列测定验证。将重组质粒转化的大肠杆菌BL21，在1.0mMIPTG和37℃条件下诱导，GST-pp24基因获得了表达。诱导菌体的裂解物经12%的SDS聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE）和Westemblot试验验证。得到大小为43kD的融合蛋白，与预期大小一致。将该融合蛋白的凝胶带切下研碎后免疫小鼠三次后，其血清与MDV感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）在间接免疫荧光试验中呈阳性反应。     

表达马立克氏病病毒CV1988／Rispens株糖蛋白B基因的重组鸡痘病毒疫苗的免疫保护研究

用鸡痘病毒载体表达马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白B（gB)基因构建成重组鸡痘病毒（rF-PV)。以MDV GA或Md5和RBIB混合攻毒，在不同品种的鸡中评价rFPV-gB/R单价苗和与火鸡疱疹病毒（HVT）组成的二价苗的免疫保护效力。试验结果表明，MDV疫苗和FPV母源抗体阴性的SPF鸡和母源抗体阳性的商品鸡中，rFDV-gB/R均能提供免疫保护作用，且其中一种商品蛋鸡中rFPV-gB/R与HVT液氮苗或HVT冻干苗结合使用，均有显著的免疫协同保护作用。免疫学研究指出，rFPV-gB/R与常规疫苗一样，可显著地降低疫苗免疫攻毒鸡的病毒血症和羽囊排毒。     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B抗原I型特异性和群共同性决定簇的…

用能表达马立克氏病病毒（ＭＤＶ）糖蛋白Ｂ（ｇＢ）的重组杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞免疫小鼠，制备针对ＭＤＶｇＢ的单克隆抗体，以Ｉ型马立克氏病病毒ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞作为检测抗原，同时以免疫荧光试验（ＩＦＡ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）来筛选杂交瘤细胞，结果获得了ＩＦＡ和ＥＬＩＳＡ均为阳性的１株单克隆抗体细胞株，定义名ＢＡ４和ＢＤ８。在ＩＦＡ和免疫沉淀试验中，单抗ＢＤ８与Ｉ，ⅡⅢ型ＭＤＶ均呈阳     

马立克氏病病毒Meq基因缺失株的保护性免疫作用

马立克氏病病毒(MDV)的致病性一直在不断增强中,甚至已出现了能抵抗CV1988/Rispens疫苗的特超强株。本实验室用BAC克隆技术构建了MDV中国野毒株的Meq基因缺失株,显示出在抗马立克氏病方面具有与美国Meq基因缺失株同样有效的保护性免疫效果,而且其自身没有明显的免疫抑制作用。对美国和中国的两个MDV的Meg基因缺失株的优缺点做了比较。     

犬瘟热病毒OP株囊膜糖蛋白H基因的克隆与表达

根据发表的犬瘟热病毒OP－CDV毒株序列设计两对引物，以犬瘟热病毒OP－CDV株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板，做RT－PCR扩增出H基因的5'端和3' 端大小为945bp、904bp的两个片段，两片段部分重叠，覆盖了H基因的全部编码序列。将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-6P-1载体中谷胱甘肽－S－转移酶（GST）基因的下游，将重组质粒转化进宿主菌BL21中，在37℃ 1.0mM IRTG诱导下，H基因分段获得了良好的表达，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，确定其表达的融合蛋白质大小分别为59kDa、58kDa，将表达产物回收后混合免疫小鼠。IFA显示免疫小鼠血清能与病毒感染细胞呈现特异反应，表明体外表达H基因保留了天然蛋白部分抗原性。     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B抗原Ⅰ型特异性和群共同性决定簇的单克隆抗体

用能表达马立克氏病病毒（ＭＤＶ）糖蛋白Ｂ（ｇＢ）的重组杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞免疫小鼠，制备针对ＭＤＶｇＢ的单克隆抗体。以Ⅰ型马立克氏病病毒ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞作为检测抗原，同时以免疫荧光试验（ＩＦＡ）和酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）来筛选杂交瘤细胞，结果获得了ＩＦＡ和ＥＬＩＳＡ均为阳性的２株单克隆抗体细胞株，定名为ＢＡ４和ＢＤ８。在ＩＦＡ和免疫沉淀试验中，单抗ＢＤ８与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型ＭＤＶ均呈阳性反应；单抗ＢＡ４只对Ⅰ型ＭＤＶ（包括ＣＶＩ９８８疫苗株）呈阳性反应。免疫沉淀反应进一步确证２株单抗识别的是ＭＤＶ糖蛋白Ｂ抗原。     

马立克氏病病毒肿瘤Meq基因缺失株的保护性免疫作用

马立克氏病病毒（MDV）的致病性一直在不断增强中,甚至已出现了能抵抗CV1988/Rispens疫苗的特超强株。本实验室用BAC克隆技术构建了MDV中国野毒株的Meq基因缺失株,显示出在抗马立克氏病方面具有与美国Meq基因缺失株同样有效的保护性免疫效果,而且其自身没有明显的免疫抑制作用。对美国和中国的两个MDV的Meg基因缺失株的优缺点做了比较。     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B基因原核表达产物单抗的制备

用大肠杆菌BL21表达了马立克氏病病毒（MDV）强毒GA株的囊膜糖蛋白B（gB)基因，通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶龟泳（SDS－PAGE）分离表达蛋白条带，切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光试验（IFA），得到1株GA株阳性的单克隆抗体杂交瘤细胞株7C8。该单抗腹水的ELISA效价为1：2^12，IFA效价为1：800，与MDV不同致病型毒株CVI988、GA、RB1B、MD11、648A株感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）均呈IFA阳性。1：100稀释时与GA感染的CEF在斑点酶联免疫吸附试验（dot-ELISA)中呈阳性。     

马立克氏病病毒的蛋白和疫苗研究进展

马立克氏病是严重危害养鸡业的重要传染病之一,对该病的研究可为肿瘤病的研究提供理想模型,本文从病毒编码的蛋白出发,重点介绍了病毒的酶类、抗原的研究进行及其在预防马立克氏病上的应用,提出利用载体构建重组疫苗对今后防制马立克氏病具有广阔的应用前景。     

禽马立克氏病毒糖蛋白B基因在家蚕中的表达

将马克克氏病毒（Marek'sdiseasevirus，MDV）糖蛋白B（gB）基因克隆入转移载体pBac－PAK8中，得到重组转移载体质粒pBacPAK（gB）。经限制性酶切图谱结合Southernblot分析鉴定表明，gB基因以正确方向插入转移载体，受多角体蛋白基因启动子控制。将此转移载体与经CvnI酶切线性化的亲本病毒Bm－BacPAK6DNA通过脂质体法共转梁家蚕细胞，只有发生重组的病毒才有复制增殖的能力。然后通过蓝白斑筛选、结合点杂交，纯化得到重组的空斑病毒vBM，用该重组病毒接种家蚕5龄幼虫，对表达产物进行SDS－PAGE分析，检测到gB基因在家蚕中高效表达，表达产物的分子量主要为97KD，表达量约为1mg／mL血淋巴。     

利用重组反转录病毒表达马立克氏病病毒Meq基因

为研究马立克氏病病毒Ｍｅｑ蛋白的生物学功能,应用磷酸钙与ＭＤＶ Ｍｅｑ基因重组的反转录病毒转染载体质粒ＲＣＡＳ－Ｍｅｑ的ＤＮＡ,转染于鸡胚成纤维细胞质ＤＦ１。经同间接免疫荧光技术研究表明,转染后第３天即开始有少量ＤＦ１细胞在细胞核表达Ｍｅｑ蛋白,以后阳性细胞增多,到转染后第７天阳性细菌最多,之后荧光即衰减,通过酶联免疫吸附试验检测,发现细胞培养上清中游离病毒在转染后第５天即可检出,直至第７天仍维持     

鸡马立克氏病病毒广西株Meq基因的克隆与序列分析

为研究鸡马立克氏病病毒(MDV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了3株MDV。参照GenBank中MDV的核苷酸序列设计1对引物,利用PCR技术对分离毒株的Meq基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示, Meq基因序列全长为1020 bp,编码一条由339个氨基酸组成的多肽,分离株与国内外MDV参考毒株相比,不同MDV株的Meq基因序列相对较保守,它们之间核苷酸同源性为83.8%~99.9%,氨基酸同源性为88.4%~99.6%。3株MDV分离株Meq基因在相关报道中提到的与毒力相关的脯氨酸重复区存在点突变。3株分离株与国内参考株YL、GXY2关系较近,与参考株RB1B、GA、Md5、648A及疫苗株亲缘关系较远。该研究为中国MDV的流行、遗传变异及防控研究提供了材料。     

马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B基因原核细胞表达产物单克隆抗体的制备

用大肠杆菌 BL2 1表达了马立克氏病病毒 (MDV)强毒 GA株的囊膜糖蛋白 B(g B)基因 ,通过 SDS- PAGE电泳分离表达蛋白条带 ,切下并碾碎后作为免疫原制备单克隆抗体。通过 EL ISA和间接免疫荧光试验 (IFA) ,得到 1株阳性单克隆抗体杂交瘤细胞株 7C8。该单抗腹水的 EL ISA效价为 1∶ 2 1 2 ,IFA效价为 1∶ 80 0 ,与 MDV不同致病型毒株CVI988、GA、RB1B、MD11、6 48A株感染的鸡胚成纤维细胞 (CEF)均呈 IFA阳性。1∶ 10 0稀释时与 GA株感染的 CEF在斑点酶联免疫吸附试验 (dot- EL ISA)中呈阳性。     

马立克氏病病毒(MDV)糖蛋白gB在重组鸡痘病毒中的表达

将马立克氏病病毒gB基因用EcoR I从质粒pUR-MDVEgB中切下。两端补平后，插入到质粒pEFgpt12s的Pst I酶切位点。构建了含有完整的MDVgB基因的转移载体pEFgpt12s-gB。这个载体的特点是，它含有两个启动子，在强的复合启动子Spromoter的下游是插入的gB基因，另一个反向启动子vvP7.5的下游 是标记基因Ecogpt，它的两端是FPV的非必需区。携带gB基因的质粒pEFgpt12s-gB通过磷酸钙的方法转染用282e4株FPV感染3-4h的鸡胚成纤维细胞。通过药物筛选 ，得到含有gB基因的重组病毒。通过PCR、免疫荧光检测，证实了重组病毒中含有gB基因，并且gB糖蛋白也得到了表达。