牛新孢子虫NcSAG1基因工程亚单位疫苗的免疫试验

为了解新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗对实验动物的免疫效果,本试验提取延边黄牛新孢子虫野毒株基因组DNA,用PCR技术扩增新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因,并在大肠杆菌中进行原核表达,将Western-blot鉴定具有免疫活性的重组蛋白与弗氏佐剂混合制备NcSAG1基因工程亚单位疫苗,免疫BALB/c小鼠,应用间接ELISA方法测定体液免疫水平,应用流式细胞技术测定细胞免疫水平,以此评价疫苗对实验动物的免疫应答反应。结果显示,制备的NcSAG1基因工程亚单位疫苗免疫BALB/c小鼠后,在三免后第3天时,检测抗体的OD450nm值达0.688;CD4+/CD8+值达3.650,均显著高于重组蛋白免疫组和PBS对照组,说明制备的基因工程亚单位疫苗能够提高实验动物的体液免疫和细胞免疫水平。本试验为牛新孢子虫NcSAG1表面蛋白基因工程亚单位疫苗的深入研究奠定了基础。     

羊口疮病毒B2L基因DNA疫苗的构建及其诱导的免疫应答

为研究所构建羊口疮病毒(OrfV)B2L基因DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答效果,本研究对pMD18T-B2L质粒进行PCR扩增,克隆B2L片段至pVAX1载体中构建pVAX1-B2L重组质粒,进行酶切和测序鉴定;采用脂质体法将pVAX1-B2L真核表达质粒转染MDBK细胞,RT-PCR和IFA法检测B2L基因在MDBK细胞中的转录和表达;将构建的DNA疫苗免疫KM系小鼠,采用间接ELISA、MTT和FACS法对其诱导的免疫应答进行研究。结果显示,成功构建pVAX1-B2L真核表达质粒,并在MDBK细胞中表达;免疫小鼠后,DNA疫苗能诱导小鼠产生OrfV特异性抗体;脾淋巴细胞增殖、CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群百分比和IL-2、IFN-γ、IL-4细胞因子均高于pVAX1组和PBS组。结果表明,本研究制备的DNA疫苗能够诱导小鼠产生较高水平的体液免疫和细胞免疫应答。     

分子佐剂Cal对弓形虫SAG1亚单位疫苗的影响

构建分子佐剂钙网蛋白Cal与弓形虫SAG1基因的真核表达载体,探讨其对小鼠的免疫原性。采用PCR扩增Cal和SAG1基因并将其克隆至Pvax1载体中,构建出重组质粒pVAX1-Cal-SAG1和pVAX1-SAG1。将构建质粒pVAX1-Cal-SAG1、pVAX1-SAG1同空载体pVAX1通过肌肉注射的方式免疫小鼠,通过ELISA、CCK-8法和小鼠攻虫试验对该DNA疫苗的免疫效果进行评价。结果显示:SAG1片段为855 bp,Cal-SAG1片段为1 566 bp,成功构建了真核表达质粒pVAX1-Cal-SAG1、pVAX1-SAG。小鼠免疫后pVAX1-Cal-SAG1诱导的特异性抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖反应和IL-4、IL-10、IL-12 p70及IFN-γ细胞因子水平均高于pVAX1组、pVAX1-SAG1和空白对照PBS组。攻虫后,佐剂组小鼠存活时间最长,较空白对照组多存活5 d。本研究表明:制备的重组核酸疫苗免疫小鼠后能够诱导机体产生体液和细胞免疫,分子佐剂Cal可以显著地增强弓形虫表面膜蛋白SAG1的免疫原性。     

犬细小病毒核酸疫苗、重组活载体疫苗与弱毒疫苗免疫犬实验研究

分别用犬细小病毒（CPV）核酸疫苗（pVCPV-VP2）、CPV重组活载体疫苗（CAV2／CPV）与CPV弱毒疫苗对犬进行了免疫试验,以检测不同CPV疫苗的免疫原性。采用CPVELISA、CPVHI与CPV微量中和试验检测免疫犬的体液免疫水平,采用淋巴细胞转化试验检测犬的细胞免疫水平。结果,pVCPV—VP2和CAV2／CPV均能诱导机体产生抗CPVELISA抗体与抗CPV中和抗体,但是pVCPV-VP2不能诱导机体产生可检测的抗CPVHI抗体,而CAV2／CPV能够诱导机体产生抗CPVHI抗体。淋巴细胞转化试验结果,pVCPV-VP2和CAV2／CPV免疫犬的外周血淋巴细胞对ConA与CPV的刺激均出现明显的增殖反应。结果表明,pVCPV—VP2和CAV2／CPV免疫犬均能诱导机体产生抗CPV的特异性体液免疫反应和细胞免疫反应,两者所表达的VP2蛋白均具有较好的免疫原性。CAV2／CPV以及pVCPV—VP2和CAV2／CPV联合免疫犬的抗CPV体液免疫水平和细胞免疫水平均比用pVCPV—VP2单独免疫犬的体液免疫水平和细胞免疫水平高。但CAV2／CPV诱导机体产生的抗CPV特异性免疫反应仍然比CPV弱毒疫苗诱导机体产生的抗CPV特异性免疫反应弱。另外,CAV2／CPV还能诱导机体产生抗CAV-2的特异性免疫反应。     

寨卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME构建及新型佐剂的筛选

选用1种递送载体与4种免疫刺激增强剂混合,与赛卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME联合免疫BALB/c小鼠,观察新型佐剂对DNA疫苗抗原的免疫应答能力。首先构建表达ZikaME蛋白的DNA疫苗,然后将重组质粒转染至HEK293细胞,采用Western blot检测目的蛋白的表达。用配制的佐剂与重组的DNA疫苗联合免疫BALB/c小鼠,通过细胞亚群检测、淋巴细胞增殖试验和特异性抗体检测验证新型佐剂的增强免疫效果。结果显示,Western blot检测所构建的DNA疫苗表达68 000目的蛋白。用重组疫苗辅以佐剂免疫小鼠,免疫35 d时淋巴细胞增殖刺激组刺激指数、细胞亚群分化、特异性抗体水平均高于对照PBS组(P0.05)。结果表明,DNA疫苗pVAX-ZikaME辅以新型佐剂免疫小鼠可增强机体对该疫苗的免疫应答能力。     

DNA疫苗免疫佐剂的研究及应用

DNA疫苗是近年来出现的一种新型疫苗,能够诱导机体免疫系统产生体液免疫和细胞免疫,在预防和治疗人和动物的疾病中发挥重要的作用。随着DNA疫苗研究的深入和扩展,用于提高DNA疫苗免疫效果的免疫佐剂也逐渐开展起来。本文就新型细胞因子佐剂、趋化因子和协同刺激分子佐剂、补体分子佐剂和CpGDNA佐剂的研究作一综述。     

产肠毒素大肠杆菌菌毛的DNA疫苗研究进展

肠毒素大肠杆菌是导致婴幼儿及旅游者急性腹泻,仔猪腹泻和水肿的主要病原菌之一。菌毛定居因子是该病原菌主要的致病因素。DNA疫苗既能激发机体的细胞免疫,也能诱导特异性的体液免疫。目前用于预防ETEC腹泻的DNA疫苗的研究已取得一定进展,作者从重组质粒的构建、免疫应答、疫苗的接种系统以及基因佐剂4个方面简单的概述了产肠毒素大肠杆菌菌毛的DNA疫苗的研究现状。     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白多表位肽在毕赤酵母中分泌表达及其免疫原性研究

为构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白多表位疫苗,本研究将人工合成的优化后的E蛋白多表位肽(MP)序列克隆入酵母表达载体p PICZα-A,构建分泌型重组酵母表达质粒p PICZ-MP,经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母X-33,阳性重组子经甲醇诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白(rMP)。通过测定rMP免疫小鼠的抗体水平、抗体亚型、中和抗体和CTL,以评价该多表位疫苗在小鼠模型上的免疫原性。结果表明:成功构建了表达JEV E蛋白多表位抗原的重组酵母菌株X33(pPICZ-MP),能分泌表达多表位肽r MP。纯化后的r MP免疫小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫反应,其中和抗体水平、CTL活性均与活病毒疫苗组差异不显著(p0.05),且能保护小鼠免受致死量JEV的攻击。构建的JEV E蛋白多表位疫苗具有良好的免疫原性,能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应,为流行性乙型脑炎多表位疫苗研制提供新的思路。     

DNA疫苗佐剂研究进展

DNA疫苗是近年来发展较为迅速的一类生物制剂,它能诱导动物机体产生持久的体液免疫和细胞免疫,其在抗病毒、细菌和寄生虫的感染方面起到了重要作用。但与传统的灭活疫苗相比,其免疫效果并不理想。为了攻克DNA疫苗免疫效力低下的难题,一些学者已经研制了多种佐剂制品,以提高DNA疫苗对动物疾病免疫保护的能力。文章对使用佐剂提高DNA疫苗免疫效力进行了综述。     

弓形虫GJS株pcDNA3-MIC3核酸疫苗的研究

根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间.结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长.表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用.     

不同佐剂伪狂犬病病毒主要抗原决定簇gBb亚单位疫苗免疫小鼠安全性及免疫效力测定

为了评价不同佐剂猪伪狂犬病病毒(PRV)SA株gB蛋白主要抗原决定簇gBb亚单位疫苗免疫小鼠的安全性和免疫效力,以PRV SA强毒株基因组为模板扩增gB基因保守区域,连接pET-28a载体构建pET-28a/gB表达质粒,并经基因测序和Western blot鉴定;制备的抗原与不同佐剂配比分别制备亚单位疫苗,开展不同佐剂gB蛋白主要抗原决定簇gBb亚单位疫苗免疫昆明小鼠免疫效力评估,测定免疫后不同时间体液免疫抗体水平,进行免疫攻毒保护试验,测定免疫保护力。结果表明,不同佐剂gB蛋白主要抗原决定簇gBb亚单位疫苗免疫昆明小鼠后能够产生较高的抗体水平,模式动物昆明小鼠攻毒免疫保护率达到60%,为PRV新型亚单位疫苗的研制提供了依据。     

重组酵母疫苗诱导细胞介导的保护性免疫

美研究人员报道 ,重组的全酵母疫苗能够激活树突状细胞 ( DC)并诱导保护性细胞免疫。研究人员在测试表达肿瘤和 HIV-1抗原的重组酿酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae)的免疫原性时发现 ,在不存在佐剂的情况下 ,用这种重组酵母免疫的小鼠能产生很强的包括肿瘤保护的抗原特异性 CTL反应 ,而且这种酵母还能刺激 DC的成熟和 IL-1 2产生 ,从而有效激发 MHC-1和 MHC-2限制的抗原特异性 T细胞反应。这项研究表明 ,重组酵母载体疫苗在诱导对多种传染病和肿瘤的有效细胞免疫方面也许有更强的作用重组酵母疫苗诱导细胞介导的保护性免疫@郭志…     

牛源金黄色葡萄球菌黏附素纤连结合蛋白A分泌型DNA疫苗诱导小鼠免疫效应的研究

采用PCR方法对编码金黄色葡萄球菌黏附素纤连结合蛋白A(FnbpA)的A区基因片段进行了特异性扩增,构建了真核表达载体pVAX-SFn,转染BHK-21细胞后经ELISA可检测出分泌表达的FnbpA蛋白。将真核重组表达质粒肌肉注射C57BL/6小鼠,免疫后检测小鼠血清抗体效价、淋巴细胞增殖及对试验小鼠攻毒试验。结果表明,该重组表达载体诱导细胞和体液免疫应答的强度均明显超过对照组。对小鼠的攻毒试验结果提示该重组DNA经肌肉注射途径接种可对小鼠产生免疫保护。本试验的结果对该DNA疫苗今后在实际中的应用奠定了良好的试验基础。     

基因疫苗在畜禽传染病中的作用

基因疫苗亦称DNA疫苗,是将编码某种蛋白质抗原的真核重组表达载体直接注射机体,在宿主细胞中表达外源基因,诱导特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答,达到预防和治疗疾病的目的。基因疫苗在病毒感染性疾病中有广阔的应用前景,已成为疫苗研究领域的热点之一。基因疫苗被称为第三次疫苗革命。基因免疫已在畜禽传染病,如病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫免疫、抗肿瘤免疫、预防变态反应中发挥了巨大的作用。     

PRRSV GP5蛋白及猪IL-18基因共表达核酸疫苗免疫原性试验

本试验通过分子克隆技术分别构建了单独表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因以及PRRSVGP5基因和猪IL-18基因共表达的重组核酸疫苗质粒（pEGFP—GP5和pEGFP—ILl8-GP5）,并进行仔猪免疫原性研究,对构建的PRRSV核酸疫苗所诱导的体液免疫和细胞免疫水平进行检测,进一步研究了PRRSV核酸疫苗免疫效果以及猪IL-18基因对PRRSV核酸疫苗免疫调节作用的影响。同时,调查了商业上应用不同类型的PRRSV疫苗诱导的免疫效果,并与核酸疫苗免疫效果进行比较。结果表明,IL-18作为免疫佐剂在疫苗免疫猪后诱导的病毒特异性细胞免疫反应方面具有很好的调节作用,共表达IL18-GP5蛋白能够明显的改善DNA疫苗的免疫效力,增强抗PRRSV的免疫保护。因此,DNA疫苗做为一种新一代疫苗可用于对抗高致病性PRRSV感染。     

核酸疫苗的免疫效果与安全性

核酸疫苗是通过基因重组手段将编码某种抗原蛋白质的基因与载体重组后直接导入动物体内,在宿主体内表达抗原从而引起机体免疫应答的新型疫苗,是一种与传统疫苗截然不同的新型疫苗,被誉为第三代疫苗。核酸疫苗可诱导细胞免疫并可抵抗母源抗体干扰,它的诞生给基因治疗和免疫学领域带来了不可估量的前景。核酸疫苗目的基因、质粒载体的选择,接种剂量以及应用的佐剂等因素直接影响到核酸疫苗的免疫效果。DNA疫苗自诞生以来,其安全性一直是人们关心的问题,也是DNA疫苗得以日后应用于临床的关键。     

禽类DNA疫苗研究进展

新型疫苗的研究对于禽类传染病的防制意义重大。传统疫苗是基于抗原刺激机体产生特异性抗体的原理,它们大多数激发机体的体液免疫,很难启动细胞免疫。脱氧核糖核酸(DNA)疫苗作为第3代疫苗,具备传统疫苗和其它基因工程苗不可比拟的优点,能够诱导全方位的免疫反应且使用更安全更方便,DNA疫苗是将外源基因与真核质粒重组后直接导入细胞内,使外源基因在宿主细胞内表达合成保护性抗原蛋白。这是模拟病毒自然感染提呈过程,既能产生细胞免疫,又能产生体液免疫。文章对DNA疫苗在禽类应用的可行性和应用研究新进展作了综述。     

结核分支杆菌MTB41 DNA疫苗的构建及原核表达

为了构建结核分支杆菌MTB41 DNA疫苗,同时将其克隆到原核表达载体中进行表达。用结核分支杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR法对基因MTB41进行扩增,克隆到真核表达载体pJW4303中,构建MTB41重组真核质粒(DNA疫苗),进行了酶切鉴定和序列分析;克隆到原核表达载体pET22b中,酶切和测序鉴定正确后转入E．coli BL21(DE3)PLysS宿主菌株内中,诱导表达,进行SDS-PAGE电泳分析。电泳发现转化了重组质粒的菌株有蛋白表达,所表达的蛋白质相对分子质量为41ku,MTB41 DNA疫苗酶切鉴定和序列分析完全正确,确定含有正确的读码框,疫苗制备成功。DNA疫苗的成功构建,重组蛋白MTB41的成功表达,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下了基础。     

皮蝇素A基因DNA疫苗的构建及其免疫特性研究

本研究以实验室保存的原核表达载体pET-HA为模板,PCR扩增皮蝇素A(HA)基因,将克隆基因插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中构建DNA疫苗pcDNA-HA。构建的DNA疫苗pcDNA-HA和空载体pcDNA3.1(+)体外转染小鼠胎儿成纤维细胞,间接免疫荧光试验检测细胞内目的基因的表达。将pcDNA-HA、空载体pcDNA3.1(+)和PBS免疫BALB/c小鼠后,对免疫小鼠的体液免疫水平进行了检测。结果表明,构建的DNA疫苗能在小鼠胎儿成纤维细胞中表达,能被抗HA抗体识别,可诱导小鼠产生特异性体液免疫反应,说明HA可作为牛皮蝇蛆病的候选疫苗抗原。本研究为牛皮蝇蛆病的DNA疫苗研究奠定了基础。     

犬GM-CSF基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白.利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应.为进一步提高VP2 DNA疫苗的免疫活性,本实验利用犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因作为生物佐剂研究其对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用.首先通过RT-PCR方法从犬淋巴细胞中扩增GM-CSF基因,并将其插入到pcDNA3.1栽体上,分别构建该基因的两个分泌型真核表达载体,即非融合表达载体pcDNA-cGMCSF和与Myc His融合的表达栽体pcDNA-cGMCSF/MH.用pcDNA-cGMCSF/MH载体转染HEK293T细胞以确定GM-CSF基因能否在真核细胞中进行分泌表达.然后用本室构建的VP2基因表达栽体单免疫小鼠,用VP2表达载体与pcDNA-cGMCSF共免疫小鼠(pcDNA3.1空载体作为阴性对照).免疫后用ELISA方法检测不同时间小鼠血清的抗体水平.用MTT法检测小鼠免疫后35 d时淋巴细胞的增殖活性,同时用ELISA试剂盒检测小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平.结果表明,本试验构建的表达载体能够介导重组GM-CSF在真核细胞中进行分泌表达.免疫实验表明,利用GM-CSF基因与VP2基因共免疫小鼠,抗体的水平明显高于VP2基因单免疫组(P＜0.01).共免疫组小鼠淋巴细胞的刺激指数和γ干扰素的表达水平均明显高于单免疫组(P＜0.05).由此可见,GM-CSF表达载体可明显提高CPV VP2 DNA疫苗的免疫应答水平.