副猪嗜血杆菌和猪链球菌双重PCR方法的建立与应用

针对副猪嗜血杆菌和猪链球菌16S rRNA序列各设计1对特异性引物,分别能扩增出822 bp和294 bp的DNA片段,并据此建立了快速准确鉴别副猪嗜血杆菌和猪链球菌的双重PCR方法,临床试验证明该方法具有很好的特异性、敏感性,能对临床病料进行鉴别诊断.对161份临床样本检测结果显示,副猪嗜血杆菌的检出率为23.75%,猪链球菌的检出率为43.48%,二者混合感染率为9.94%.     

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

为了解副猪嗜血杆菌病在贵州对猪群的危害和流行规律、进一步开展副猪嗜血杆菌病的防治研究提供参考依据,特进行副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用研究。根据副猪嗜血杆菌（HPS）16S rRNA基因序列设计1对引物,通过优化组合试验,对贵州省分离的HPS进行PCR扩增,扩增出长为650bp的目的基因片段,而大肠埃希氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、葡萄球菌等扩增结果为阴性。采用该方法对贵州发病猪群中350头疑似病例进行PCR检测,检出率为8％～49％。该方法检测副猪嗜血杆菌敏感性高、特异性好,可用于副猪嗜血杆菌的快速诊断。     

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速鉴别诊断副猪嗜血杆菌的方法,本试验针对副猪嗜血杆菌infB基因序列,利用Premier5.0软件设计并合成了1对特异性引物,建立了针对副猪嗜血杆菌的PCR鉴别诊断方法,优化了退火温度,检测了该方法的敏感性和特异性,结果表明,本试验建立的PCR检测方法的最佳退火温度为49℃。敏感性试验表明,该PCR检测方法最低能检测到的DNA浓度为18.1×10-6μg/mL。通过特异性试验表明,本方法仅可由副猪嗜血杆菌中扩增出特异性条带,在金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等病原菌中扩增不出相应的条带,表明该方法具有较高的特异性。同时,通过对本方法检测出的阳性样品infB序列分析发现,与GenBenk中公布的副猪嗜血杆菌infB序列同源性均在98.2%~99%。表明建立的方法灵敏度高、特异性强,可以应用于副猪嗜血杆菌的实验室诊断。     

副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆、表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌的外膜蛋白ompP2基因,序列测定结果表明扩增片段全长1 188bp。将扩增片段插入表达载体pET-32a,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果证实重组融合蛋白约为60 000,West-ern-blot结果表明重组表达蛋白具有免疫反应性。以纯化的重组蛋白ompP2作为抗原,建立副猪嗜血杆菌的抗体间接ELISA检测方法。通过试验确定最佳反应条件为抗原包被质量浓度4.75mg/L,4℃包被过夜,待检血清的稀释浓度为1∶40,阳性判断标准为D630大于0.383。特异性和重复性试验表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,可用于副猪嗜血杆菌的检测。     

副鸡嗜血杆菌PCR检测方法的建立

参照GenBank中已发表的副鸡嗜血杆菌血凝素（HA）基因设计合成了一对引物，预计扩增片段大小约为412bp。利用这对引物，通过对PCR反应体系和反应条件的优化，建立了针对副鸡嗜血杆菌的PCR检测方法。结果表明，该方法敏感性较高，最低可检出1．7×10^4CFU／mL的副鸡嗜血杆菌，对副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌在相同反应条件下未扩增出任何片段，说明该方法具有较好的特异性。     

副猪嗜血杆菌PCR快速诊断方法的建立

副猪嗜血杆菌营养要求比较苛刻,常规生化试验检测方法比较烦琐,本研究针对副猪嗜血杆菌16SrRNA基因特异性PCR引物序列,合成一对PCR引物,建立相应的PCR检测方法,同时对该方法的灵敏性、特异性等实验。结果显示可检测出浓度为2．8×10^3CFU／mL的副猪嗜血杆菌表明该方法灵敏度高;对大肠杆菌、链球菌、巴氏杆菌、沙门氏杆菌、金黄色葡萄球菌进行PCR扩增均不获得任何条带,表明该方法特异性较强。所以该方法对于临床快速检测副猪嗜血杆菌具有重要意义。     

两株不同地区副猪嗜血杆菌的分离及分子生物学鉴定

本试验从浙江和河南部分地区的送检的疑似患多发浆膜炎与关节炎猪的病料中分离到2株疑似副猪嗜血杆菌,进行了细菌形态观察、培养特性和生化特性鉴定,根据已报道的副猪嗜血杆菌16SrRNA序列特异性引物进行PCR扩增,得到预期的822bp的基因片断,最终证实为副猪嗜血杆菌。     

副猪嗜血杆菌部分16S rRNA基因的克隆及序列分析

副猪嗜血杆菌(Haenophilus parasuis,Hps)为副猪嗜血杆菌病的病原体。目前,副猪嗜血杆菌地方分离株基因背景研究国内报道不多,试验针对临床分离的2株Hps进行16S rRNA基因片段的扩增、克隆、测序及同源性比较,以期在分子水平对副猪嗜血杆菌进行鉴定。1材料与方法1.1菌种和质粒副     

副猪嗜血杆菌病的诊断实例

对山东省某猪场疑似患副猪嗜血杆菌病的猪进行实验室诊断的结果表明,分离到的病原菌为革兰氏阴性杆菌,经PCR鉴定,其扩增片段与目的片段大小相符,进而确诊为副猪嗜血杆菌病。     

副猪嗜血杆菌ompP2基因在猪肺泡巨噬细胞中的表达

为了进一步研究副猪嗜血杆菌(HPS)ompP2基因的功能,根据已发表的副猪嗜血杆菌核苷酸序列,设计并合成1对引物,PCR扩增HPS LZ株外膜蛋白ompP2基因,获得大小为1 158bp的核苷酸片段,该片段纯化后克隆至pEASY-Blunt载体,转化后鉴定,再与真核表达质粒pCI-neo经过酶切和连接反应,转化感受态大肠杆菌Trans-T1,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。通过脂质体法将pCI-neoompP2转染猪肺泡巨噬细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测重组质粒是否表达。结果显示,成功构建了含ompP2基因的副猪嗜血杆菌真核表达载体pCI-neo-ompP2,提取转染该质粒的猪肺泡巨噬细胞的mRNA,进行RT-PCR扩增,在1 000bp~2 000bp之间可见1条明显的条带。Western blot发现在42ku处出现目的条带。试验结果为后期研究副猪嗜血杆菌感染猪肺泡巨噬细胞的机理奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌外膜蛋白TbpB基因的克隆和表达

为了克隆和表达副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)外膜蛋白TbpB基因,试验采用基因工程的方法对已发布的HPS外膜蛋白P5序列进行相关序列分析,设计并合成引物,以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS外膜蛋白P5编码基因,获得长为1 116 bp的预期基因片段。该基因编码372个氨基酸的蛋白质,预测分子质量约为41 ku,将该基因片段定向克隆至表达载体pGE X-6p-1中。结果表明:诱导表达后分子质量约为67 ku,与副猪嗜血杆菌阳性血清发生了特异性反应。说明该蛋白与抗体发生了反应,有一定免疫原性。     

副猪嗜血杆菌新疆株的分离及PCR鉴定

从新疆北疆6个规模化猪场的37例发病猪病料中分离到两株疑似副猪嗜血杆菌(HPs)。经形态染色镜检、培养特性、生化和部分生物学特性试验,初步鉴定为HPs。根据副猪嗜血杆菌特异性引物进行PCR扩增,结果均扩增出822 bp预期特异性条带,确定分离株为副猪嗜血杆菌。这是目前为止新疆地区首次分离到HPs。     

四川省部分地区副猪嗜血杆菌的分离鉴定及espp2基因序列分析

为了解四川省副猪嗜血杆菌病的流行情况及分析分离株espp2基因,本试验从2013年8月到12月分离该菌并扩增其espp2基因进行序列分析。结果显示,分离到12株副猪嗜血杆菌,镜检发现为革兰阴性短杆菌;卫星试验表明分离株在金黄色葡萄球菌周围产生卫星现象;生化试验显示分离株发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、果糖、木糖、甘露醇、山梨醇、尿素、D-核糖和精氨酸水解酶;PCR鉴定发现均扩增到约821bp的目的片段。药敏试验显示分离株对氟苯尼考、先锋霉素V、阿莫西林、强力霉素和环丙氟哌酸敏感。扩增SC-1和12株分离株的espp2基因并测序,测序结果与GenBank公布的副猪嗜血杆菌SH0165、ZJ0906和Nagasaki的espp2基因共计16条序列进行比对发现相似性大于98%,这16条序列编码的氨基酸序列相似性大于97%,表明副猪嗜血杆菌espp2基因变异度低,较保守。     

副猪嗜血杆菌病的PCR诊断与病理组织学观察

为了诊断副猪嗜血杆菌病和研究其病理组织学变化,采集疑似副猪嗜血杆菌病病猪的主要病变组织器官,进行细菌分离和PCR检测,并观察各器官的病理组织学变化。结果表明:分离的菌株和副猪嗜血杆菌标准菌株均扩增出650 bp左右的特异性目的条带,且分离菌株与标准菌株的序列同源性高达99%,诊断为副猪嗜血杆菌感染。病理组织学观察可见肺脏组织出血,肺泡间质增宽,心脏和肝脏严重出血、瘀血和充血,肾小球萎缩和淀粉变性,炎性细胞浸润。说明副猪嗜血杆菌对猪各组织器官均有不同程度的损伤,尤以肺脏病变最为严重。     

猪群中7种高发传染病多重PCR诊断方法的建立

[目的]建立猪瘟、蓝耳病(又称猪繁殖与呼吸综合征)、圆环病毒2型感染、猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病、猪多杀性巴氏杆菌感染和猪支原体感染7种猪病的多重PCR诊断方法.[方法]根据GenBank发表的核苷酸序列设计了分别针对猪瘟、蓝耳病、圆环病毒2型感染、猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病、猪多杀性巴氏杆菌感染和猪支原体感染的2套多重PCR特异性引物,优化多重PCR反应条件后进行敏感性与特异性评价.[结果]建立的2套多重PCR诊断方法对其他常见猪病痛原的基因组无特异性扩增,检测病原基因组最低浓度可达到pg级.[结论]该研究建立的2套多重PCR诊断方法可以用于猪群中上述7种猪病痛原的单一感染或混合感染的鉴别诊断.     

副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立基于SYBR Green Ⅰ的快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的实时荧光定量PCR方法,参照GenBank公布的HPS的infB基因序列(DQ:781933.1),设计特异性引物;提取HPS基因组,进行PCR扩增,回收目的片段;构建阳性标准模板,建立标准曲线;验证其敏感性、重复性和特异性。结果显示,本试验得到了阳性标准质粒,并建立了标准曲线,线性关系在102copies/μL～108copies/μL检测范围内良好;该方法敏感性达到10copies/μL,比常规PCR高100倍,重复性试验变异系数均小于2.5%,同时对HPS具有良好的特异性。结果表明,本试验建立的副猪嗜血杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法可用于临床对HPS的快速诊断和定量检测。     

猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立

目的建立可以同时检测猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速而可靠的PCR检测方法。方法和结果根据胸膜肺炎放线杆菌的Apx-VIA基因序列、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的16SrRNA基因序列设计5条引物。猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌模板的PCR扩增产物大小分别为342bp,485bp和1258bp。复合PCR对1～12型猪胸膜肺炎放线杆菌标准株,6株多杀性巴氏杆菌标准株,1～15型副猪嗜血杆菌以及25株经生化鉴定确认为上述三种细菌的分离株的基因组DNA作为模板进行检测,均获得预期大小的扩增产物。以猪放线杆菌、吲哚放线杆菌等14种常见细菌作为阴性对照进行PCR检测,结果仅有支气管败血波氏杆菌产生了可以和上述三个特异性条带明显区分的PCR产物。复合PCR针对胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的敏感性分别为14pg、34pg和37pg。结论本研究建立的复合PCR特异性好,敏感性高,可以用于猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速检测。     

副猪嗜血杆菌16S rRNA基因的克隆及序列分析

本研究旨在从分子水平对副猪嗜血杆菌湖南分离株进行鉴定,并用16S rRNA序列分析不同血型副猪嗜血杆菌之间的遗传关系。利用PCR扩增副猪嗜血杆菌的16S rRNA,应用ClustalX 1.81程序对序列进行比对,再用Phylip 3.67程序MP法和Mage 4.0程序NJ法绘制种系发育树,并用Puzzle 5.2程序构建最大似然树,同时利用DNAStar 5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果显示,所获得的16S rRNA序列长度均为783 bp,湖南分离株与已知5型副猪嗜血杆菌位于同一分枝。结果表明,湖南分离株属于5型副猪嗜血杆菌,为副猪嗜血杆菌的分子流行病学和其相关疾病的诊断奠定基础。     

副鸡嗜血杆菌16 S rDNA PCR检测方法的建立

根据副鸡嗜血杆菌的16 S rDNA基因序列设计一对特异性引物XZIC1和XZIC2,对6株副鸡嗜血杆菌进行PCR扩增。结果显示,该对引物对6株副鸡嗜血杆菌均扩增出与预期大小相一致的282bp片段,而对鸡毒支原体、禽巴氏杆菌、鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌、禽流感病毒(H9)、鸡喉气管炎病毒及葡萄球菌等9种病原体的扩增结果均为阴性。该PCR敏感性结果表明,本方法可以检测到10pg的副鸡嗜血杆菌DNA模板。采用引物XZIC1和XZIC2,对分别用副鸡嗜血杆菌ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269株感染SPF鸡的临床病料DNA进行PCR扩增,均可扩增出单一的282bp的片段。     

副猪嗜血杆菌PCR检测方法的建立与初步应用

根据副猪嗜血杆菌16 S rRNA基因设计了一对引物,通过最佳条件摸索扩增出大小为821 bp的特异目的基因片段,建立了快速检测副猪嗜血杆茵的PCR方法,该方法最低检出量达10-3 ng,且对大肠埃希茵、金黄色葡萄球菌、传染性胸膜肺炎放线杆菌和巴氏杆茵等均无交叉反应.用该PCR方法从门诊送检的病料中检测出4株副猪嗜血杆菌,并对分离株SH0854P的PCR扩增产物进行测序与对比分析,其与已发表的GenBank中的相关菌株的同源性为97.3%～100%.